この作品は、厚生グラントGM086822の国民の協会によって資金を供給された。著者は、博士に感謝します。彼らの専門的技術支援のためのアレックパホーモフ＆ポールウォーレス（ワシントンのナノテクノロジーの利用施設の筑波大（NTUF））とアンドレアスレイド（ブルカーAXS）。 DNA AFMイメージングは​​、大学で行われた。ワシントンNTUF、国家ナノテクノロジー基盤ネットワークのメンバーの。 2xGal4 - 2xGRE - lucifereaseプラスミド好意博士キース山本（カリフォルニアの筑波大、サンフランシスコ）の研究室によって提供されていました。

1。汚染のないイメージを作成するDNAとタンパク質試料の準備<ol><li>適当な水性緩衝液中でイメージ化し、場所に生体分子を分離します。撮像されるタンパク質は、液体クロマトグラフィー6を用いて精製することが、免疫吸着は抗体とペレット1,2の除去、またはProfinity正確な精製とタグの除去7（ 図2A）が続きます。ミニプレップ精製（ 図2B）によって撮像されるDNA分子を分離します。 </li><li> SDS - PAGEとウェスタンブロッティングを用いて画像化するタンパク質サンプルの組成と純度を確認してください。 DNAの場合は、制限消化とアガロースゲル電気泳動を完了することによって、シーケンスや純度を確認してください。 </li><li>マイカにサンプルの遵守を促進するためにAFM吸着バッファーでサンプルをインキュベートする。タンパク質サンプルの場合は、10mMのHEPES緩衝液を使用することができます。追加の低イオン強度塩または他の因子も同様に追加される可能性があります。 DNAサンプルの場合は、マイカ基板に吸着を促進するための二価カチオン（例えば、Mg 2 +のまたはNi 2 +）が含まれます。 DNAに適したのMg 2 +を含む緩衝液は10mMトリス、pH7.5の10 mMのNaCl、2mMのMgCl 2 3です。代替のNi 2 +、バッファは、10mMのHEPES、pH6.8の、10mMのNiCl 2です。 </li><li>吸着バッファーで5μg/ mlの濃度にサンプルを希釈する。軽く混合します。顕微鏡が準備されている間に氷上で保存する。 </li></ol> 2。取付AFMプローブ<ol><li>対応するカンチレバーのインストールのドッキングステーションに液体セルプローブホルダを置きます。 </li><li>イメージングに使用する鋭い窒化レバー（SNL）プローブの長い、太いカンチレバーを（&#39;B&#39;カンチレバーと呼ばれる）を探します。慎重に先端が垂直に保つように、液体セルプローブホルダに転送します。テクニカルノート：任意の高さからそれをドロップすると、カンチレバーまたは先端を損傷または破壊可能性があるため、プローブは、転送中に細心の注意を払う必要があります。 microlever SNL（MSNL）プローブは、SNLのプローブの代替として使用することができます。 </li><li>ドッキングステーションからプローブホルダを取り外し、それを調べて、正しく液体セルプローブホルダに装着されて確保するために光学顕微鏡下でカンチレバーを調べます。 </li><li>慎重にローレットヘッドのクランプねじを締めて、楽器の蟻のアセンブリからのAFMヘッドを取り外します。テクニカルノート：AFMヘッドを操作しながら、細心の注意を払っても、短い距離（蟻のアセンブリ内に正しく取り付けられていない場合など）から、それをドロップするように、支払われなければ、実質的な損傷を与えることがあります。 </li><li> AFMヘッドを逆さにしてしっかりとAFMヘッドのベースで4ピンの上に液体セルプローブホルダを押してください。慎重に楽器の蟻のアセンブリにAFMヘッドを返す。測定器にAFMヘッドを固定するローレットヘッドのクランプネジを離します。 </li></ol> 3。 、カンチレバーの先端の位置のレーザーを揃え、および光検出器の調整<ol><li> AFMの測定器ソフトウェアを使用して、オンボード光顕微鏡のノブを移動することによって、カンチレバーの先端を探します。必要に応じて先端の識別を向上させるために、顕微鏡の照明を調整します。測定器ソフトウェアに表示される十字線の近接にカンチレバー先端の終わりをもたらす。 </li><li>ソフトウェア上で光学系のコントローラーの上矢印と下矢印を調整することで、焦点にカンチレバーの先端をもたらす。光学系を調整しながらゆっくりと（S）またはミディアム（M）の速度を使用してください。 </li><li>レーザーの調整ノブを使用して、カンチレバーの先端にレーザーの位置を合わせます。赤色レーザーのドットが白の照射スポットの内側になるまで調整ノブを移動します。レーザーをカンチレバーの先端に配置されるまで、ジグザグなパターンを用いてカンチレバーアームに沿ってトレースします。正しく揃うと、強い反射スポットは、AFMヘッドのフロントウィンドウに表示されます。 </li><li>中央AFMヘッドの光検出器のノブを調整することにより、光検出器。これにより、機器のソフトウェアの光検出器のディスプレイの十字のレーザードットを整列します。観測された信号の合計は約4〜6にする必要があります。 </li></ol> 4。ポジショニングAFMヘッドとチューニングのカンチレバー<ol><li> AFMホルダープレートの上に磁化された試料ホルダーに金属原子間力顕微鏡の試料ディスクに接続されたマイカの新鮮劈開シートを置きます。この設定は、イメージングの前にステップ1で調製したDNAまたはタンパク質サンプルをAFMヘッドを配置するために使用されます。 <ol><li>テクニカルノート：磁化された試料ホルダーと液晶セルのプローブホルダは、メカニズムとプローブホルダーを固定している他のサンプルよりも厚いです。マイカ - サンプルホルダーアセンブリとAFMヘッドとの間の不十分なクリアランスが現在ある場合は、機器のソフトウェアで数回を撤回アイコンを選択することにより、AFMヘッドを上に移動。 </li></ol></li><li>試料ディスクを初期イメージングのために配置されるようにAFMホルダープレートを回転させます。マイカ基板をAFMヘッドの下を中心にされていることを確認します。 </li><li>に向かってAFMヘッドを下に移動測定器ソフトウェアの焦点面のコントロールを使用して、マイカ - 試料ディスクの表面。 Zモーターの培地（M）の速度を選択し、AFMヘッドはマイカ上に約2mmになるまで表面に向かって継続する。この時点では、プローブと表面（先端のクラッシュと呼ばれる）between急激な接触を避けるためにゆっくりと（S）Zモーターの回転速度を使用するように切り替える。 </li><li>雲母表面や先端の反射で異なる機能がフォーカスされるまで近いマイカ基板の表面にプローブを移動するために進んでください。測定器ソフトウェアからアイコン：&quot;に焦点を当てて&quot;使用して表面と先端反射焦点面を切り替えます。 </li><li>測定器ソフトウェアから曲のアイコンを選択して、カンチレバーを調整してください。推奨SNLとMSNLのカンチレバープローブの共振周波数は20〜60 kHzです。オフセット5％のピークを選択してください。テクニカルノート：適切なカンチレバーのチューニングは十分なサンプルのイメージングのために不可欠です。 </li></ol> 5。イメージング雲母の試料表面<ol><li>マイカの表面にプローブをかけます。 10μmとスキャンレートは1Hzまでに最初のスキャンサイズを設定します。積分ゲインと比例ゲインは、最初はそれぞれ、0.2〜0.4に設定することができます。トレースを持つとリトレーススキャンがほぼ重なるために、必要に応じてゲインを調整します。振幅の設定値を小さくすると、プローブとマイカ間の相互作用を増加させると関与を保証します。 </li><li> 10μmのフィールドの完全なスキャンイメージをキャプチャします。 1、5にサイズをスキャンし、0.5μmの各フィールドの完全な画像をキャプチャ減少。必要に応じてゲインとスキャンの速度を調整します。雲母表面の画像をキャプチャするDNAとタンパク質含有試料との比較のためにベースラインを提供します。 </li><li>測定器ソフトウェア上で外すアイコンをシングルクリックするだけでプローブを外します。 </li></ol> 6。興味のイメージングの生体分子<ol><li>ゆっくりとステップ1で調製したDNAやタンパク質試料を混合し、画像化されたマイカの表面にそれをロードするための準備。新鮮な吸着バッファ（最終サンプルの濃度= 0.5μg/ ml）を45μlを調製したサンプルの5μlを混ぜる。 </li><li>慎重に直接マイカの表面に0.5μg/ mLとなる生体分子を含む溶液50μlを加える。プローブやAFMヘッドを移動せずにこれを行うと、試料溶液を確保するには（ただし、ピペットチップ）プローブと接触しています。 </li><li>一時停止5分は、サンプル中の生体分子がマイカ表面に付着できるようにする。 </li><li> 5分の終了時、ピペットピペットチップとプローブ、AFMヘッド、またはマイカを触れないでするように注意して液体セルプローブホルダに吸着バッファの追加の50〜100μL。これは、メニスカスを形成し、AFMは流体でモードの画像をタップを可能にする。 図3は、流体セル、カンチレバー、試料、試料ホルダー、及びメニスカスの最終的な配置を示しています。 </li><li>光検出器を再調整し、必要に応じてカンチレバーにレーザーを再調整してください。テクニカルノート：プローブ先端とレーザーのアライメントを表示するには、プローブホルダーにサンプルバッファーを加えることによって引き起こされる回折パターンが原因で複雑になっています。必要に応じて手動で、カンチレバーを再調整。 </li><li>測定器ソフトウェアを使用してプローブを再係合する。垂直偏向、積分ゲイン、および必要に応じて比例ゲインを調整します。これは雲母のセクションが追加する前にサンプルやキャプチャ画像に即座にスキャン再イメージングのプロセスを開始します。 </li><li>関心領域を識別するために、（500ナノメートル-10μm）のスキャンサイズを増やします。ズームインと画像解像度を向上させるために0.5 Hzでは、スキャン速度を減少させる</li><li>イメージングが完了すると、測定器ソフトウェアのアイコンを撤回数回を選択することにより、プローブを外します。分解液体セルまたは試料ディスクの前に、AFMヘッドと試料ディスクとの間のスペースを確保してください。 </li><li>徹底的に残留吸着バッファが蒸発するように形成される塩の結晶を防止するために蒸留水で液体セルプローブホルダと試料ディスクをすすぐ。圧縮空気で乾燥した。 </li></ol> 7。代表的な結果： AFM像の例を図4に示す。マイカ基板（A）は、DNAとタンパク質が吸着することができるその上に分子的に平坦な表面を提供する。前の生体分子試料のイメージングマイカは、画像のノイズの負の制御と評価しています。また、カンチレバーが適切に調整され、後続のサンプル画像が正しく行われる保証のレベルを提供します。二本鎖プラスミドDNA（B、D）、推定的にスーパーコイルは、容易に以前に平凡マイカ基板上に堆積し、その非対称な外観と均一によって識別されます。控えめな粒子サイズ（C、E）のタンパク質複合体はまた、マイカ基板から一意に区別することができる。粒径の違いは、サンプルの不均一性を示し、近似タンパク質複合体の化学量論や生化学的活性に役立ちます。プロの一般的な斜めの形状と一貫性のある方向タンパク質は予想どおりランダムにマイカ基板上に配向であるようにパネルCで観察TEINの粒子は、イメージングのアーティファクトです。観測されたアーティファクトの原因としては、物理的な先端異常やスキャン速度の速すぎるにおけるAFM像である。先端の畳み込みが（ 図1Bに示す）は、x軸とy軸の絶対的な長さの測定の計算を防止しながら、高さの測定（z軸）との相対的なxとyの測定値は、撮像された生体分子の生物物理学的特性を推定するにもかかわらず役に立つかもしれません。 <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig1.jpg" alt="図1"/> 図1：モード原子間力顕微鏡（AFM）をタップの模式図。 、顕微鏡。カンチレバーの終わりにそれがどの生体分子複合体の吸着へのマイカ基板の表面上を走査するように上下に振動する鋭い先端です。スキャナは、xおよびy方向に移動すると、レーザービームは、それが上に座って生体分子複合体の上を通過するように先端が移動する垂直（z）は距離をマッピングする位置に敏感なフォトダイオード検出器の上にカンチレバーの背面から反射され、マイカ。先端のコンボリューションによって引き起こされるxとy方向の画像のBの歪み。従来の窒化ケイ素の先端の公称半径は、撮像すべき粒子よりも大きいです、そして先端の接触試料の端を横断面をとして。画像化されたxとy方向の大きい方を表示される粒子ではなく、z方向の先端のコンボリューションの結果。この効果は小さく、公称先端半径のヒントの使用を最小限に抑えることができます。 <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig2.jpg" alt="図2"/> 図2：immunoadsorbedタンパク質とDNAのサンプル調製のイラスト。 immunoadsorbed GRの、リリースモノクローナル抗体（mAb） - プロテインA -セファロース（PAS）ペレットから•HSP70タンパク質複合体。 mAbのエピトープを含むペプチドとimmunopelletをインキュベートすることは複雑なのAFMによる上清および可視化から収集できるように、ペレットからGR•HSP70タンパク質複合体の放出を容易にするでしょう。 B、​​AFMイメージングのためのDNAの調製は、二価陽イオン吸着バッファを使用する必要があります。二価陽イオンは、マイカ基板のためのDNAの親和性を向上させます。 <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig3.jpg" alt="図3"/> 図3：AFMヘッド、液晶セルのプローブホルダ、サンプル、試料ホルダー、およびバッファのメニスカスの最終的な配置。ピペットチップとAFMヘッド、液体の呼び出し、およびマイカ基板間の物理的接触を避けるために、マイカ基板上にサンプルと追加のバッファを堆積する際、注意する必要があります。 B、​​試料ディスクから液体セルプローブホルダにAの倍率バッファのメニスカスのスパン。 <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig4.jpg" alt="図4"/> 図4：マイカ基板の原子間力顕微鏡（）、緩衝液で2xGal4 - 2xGRE - lucifereaseプラスミドDNA 8（B、D）、およびGR•HSP70タンパク質複合体（C、E）。マイカは、DNAとタンパク質の視覚化と比較して、コントロールのイメージとして機能します。 GR•HSP70蛋白質複合体は、モノクローナル抗体の競合抗体を（図2Aに図示）を用いて抗体 - ビーズペレットから放出してHSP70とでプライミングGRの免疫吸着することにより調製した。 DNAは、従来のプラスミドミニプレップで調製した。パネルA、B、およびCは、パネルDとEは、（スケールバー= 40 nm）のものとして、同等の倍率（スケールバー= 200 nm）のです。

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利害の衝突は宣言されません。

AFMは、リアルタイムでの水とほぼ生理的緩衝液中の画像の個々のコーティングされていない生体分子のできるユニークな顕微鏡技術を提供します。これは、個々のタンパク質とDNA分子だけでなく、多タンパク質複合体とタンパク質- DNA複合体の可視化が可能になります。 AFMによるイメージングの高分子粒子は、サンプルの均一性を評価するための、観測された粒子の構成成分の物理的な配置を特定するのに役立ちます。個々の高分子粒子を観測するこのアプローチは、関心の現在の10 3〜10 11個々の生体分子複合体を表す重要な総括的データを提供するような免疫沈降法、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー等の一般的な生化学的方法、、に有用な補助することができますで与えられています。 多タンパク質複雑な化学量論、生体分子の相互作用、および補因子の要件への研究は、すべての原子間力顕微鏡を用いて検討することができます。ここで紹介する手法は、関心のある特定の生物物理学的な質問に対応するために適応させることができます。たとえば、バッファを交換可能な液体セルプローブホルダを使用して、それは蛋白質複合体形成のためのアッセイの補因子の要件に可能となります。撮像されている間、DNA -タンパク質のアセンブリであっても、ほぼリアルタイムとで形成され、解離することができます。 DNAは、興味のある特定のシーケンスを生成（推定応答要素または新規タンパク質結合配列など）を、仮説結合タンパク質と混合し、分子間相互作用の直接的な証拠を提供するために撮像することができます。 乾燥したサンプルはむしろ水溶液中のサンプル、および直鎖DNAのスタンドとクローズドサークルのDNAプラスミドこの方法3,9でイメージングされている両方よりも利用している場合はタッピングモードAFMイメージングは、実質的に少ない複雑です。ここで紹介する方法は、より生理的なイメージング環境を提供するために緩衝液でサンプルを利用しています。イメージング、タンパク質の他の注目に値する方法はまた、フィールド赤外線顕微鏡ニア10を含め、検討する必要があります。 AFMと協同して免疫吸着の補完的な使用は、十分に確立された生化学的手法を用いて、タンパク質複合体の無数を準備する機会を提供し、immunoadsorbing抗体 - ビーズペレットから放出以下、それらを可視化する。例えば、immunoadsorbed GRは、複雑な大きさと化学量論を推定するために、このアプローチを使用して2 HSP70分子シャペロンタンパク質1と同様にダイニンモーター蛋白質との関連付けについてアッセイされています。粒径と生物物理学的特徴（例えば剛性）AFM画像化された試料11,12で観察された生体分子の同一性を確かめるのに便利でした。それは、ターゲットの生体分子が存在する場合、そのターゲットに結合し、粒子サイズの増大を引き起こす相互作用する生体分子（リガンドまたはモノクローナル抗体など）、を添加することにより生体分子のアイデンティティを確認することも可能です。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td>寸法3100 </td><td>ブルカー</td><td>寸法3100 </td></tr><tr><td>次元の流体セル</td><td>ブルカー</td><td> DTFML - DD - HE </td></tr><tr><td>シャープ窒化レバー（SNL）窒化ケイ素AFMプローブ</td><td>ブルカー</td><td> SNL - 10 </td></tr><tr><td> Microlever鋭い窒化レバー（MSNL）窒化ケイ素AFMプローブ</td><td>ブルカー</td><td> MSNL - 10 </td></tr><tr><td>ナノスコープAFMの測定器ソフトウェア</td><td>ブルカー</td><td> 004-132-000 </td></tr><tr><td>金属原子間力顕微鏡の試料ディスク</td><td>テッドペラ</td><td> 16208 </td></tr><tr><td>グレードV1マイカディスク、12 mm径</td><td>テッドペラ</td><td> 50から12 </td></tr></tbody></table>

visualization of recombinant dna and protein complexes using atomic force microscopy

原子間力顕微鏡（AFM）は、個々のタンパク質、DNA分子、タンパク質 - タンパク質複合体、およびDNA -タンパク質複合体の可視化が可能になります。顕微鏡のカンチレバーの先端にある任意の時点で、基板表面上に載っ高分子の標高を測定するナノスケールのプローブ、ナノメートルからマイクロメートルまでの画像領域を横断する、です。静電気力は緩くランダムな方向の基板に接続し、イメージングを可能にするためにタンパク質、脂質、及び核酸を引き起こす。生成されたデータは、巨大分子が離散的な大きさ（ 図1）1,2の三次元粒子として解決する地形図を、似ている。タッピングモードAFMは、DNAやタンパク質などの比較的柔らかい生体のイメージングを可能にするカンチレバーの繰り返し振動を伴います。他のナノスケール顕微鏡技術上のAFMの顕著な利点の一つは、リアルタイムで、ほぼ生理的なバッファリング状態を含む水性緩衝液、で個々のタンパク質と高分子複合体を可視化するために、その相対的な適応性であり、染色や塗装せずにサンプルを撮像する。 ここで示す方法はDNAと緩衝液でimmunoadsorbed転写因子（すなわちグルココルチコイド受容体、GR）（ 図2）の画像を説明します。 Immunoadsorbedタンパク質とタンパク質の複合体は、抗体のエピトープと（ 図2A）して画像形成されたとの競合によりimmunoadsorbing抗体-ビーズペレットから分離することができる。これは、イメージングの前に興味のある生体分子の生化学的な操作が可能になります。一度精製、DNAとタンパク質を混合することができ、結果として相互作用の複合体は、同様に撮像することができます。マイカのDNAの結合は、Ni 2 +またはMg 2 +、まだタンパク質の活性を維持するサンプルバッファに追加できるように二価陽イオン3を 、必要になります。同様のアプローチを用いて、AFMは、個々のDNA鎖に結合したRNAポリメラーゼ4と修復酵素5、など、個々の酵素を、視覚化するために利用されている。これらの実験は、分子レベルで起きている蛋白質 - 蛋白質とDNA -タンパク質生物物理学的相互作用の重要な洞察を提供しています。 AFMによるイメージング、個々の高分子粒子は、粒子の均一性を決定するためと、画像化された粒子の構成成分の物理的な配置を特定するのに役立ちます。本方法は、GRがバインドできるGR -シャペロンタンパク質複合体の1,2とDNA鎖の可視化のために開発されましたが、それはさまざまなソースからのイメージングDNAとタンパク質サンプルに広く適用することができます。

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Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

プラスミドDNA、細胞質タンパク質、およびDNA -タンパク質複合体の可視化のためのタッピングモード原子間力顕微鏡（AFM）方法が記載されている。方法は、生化学的な操作は、次のAFMイメージングのための試料を調製するための代替的なアプローチが含まれています。特定のタンパク質相互作用領域を含むDNAは、ほぼ生理的緩衝液条件下で観察される。

原子間力顕微鏡を用いて組換えDNAとタンパク質の複合体の可視化

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.3K ビュー.  Seattle University. プラスミドDNA、細胞質タンパク質、およびDNA -タンパク質複合体の可視化のためのタッピングモード原子間力顕微鏡（AFM）方法が記載されている。方法は、生化学的な操作は、次のAFMイメージングのための試料を調製するための代替的なアプローチが含まれています。特定のタンパク質相互作用領域を含むDNAは、ほぼ生理的緩衝液条件下で観察される。

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Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

原子間力顕微鏡によるイメージングのための細菌の固定化

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

生物工学

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

原子間力顕微鏡と内皮グリコカリックスの機械的性質の定量化

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

原子間力顕微鏡を用いた生細胞の機械的特性を測定する

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

ケルビンプローブフォース顕微鏡を用いて細菌の表面電位測定

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in Parkinson&#8217;s disease and beta-amyloid and tau in Alzheimer&#8217;s disease, it is critically important to develop morphology specific reagents that can selectively target these disease-specific protein variants to study the role of these variants in disease pathology and for potential diagnostic and therapeutic applications. We have developed novel atomic force microscopy (AFM) based biopanning techniques that enable isolation of reagents that selectively recognize disease-specific protein variants. There are two key phases involved in the process, the negative and positive panning phases. During the negative panning phase, phages that are reactive to off-target antigens are eliminated through multiple rounds of subtractive panning utilizing a series of carefully selected off-target antigens. A key feature in the negative panning phase is utilizing AFM imaging to monitor the process and confirm that all undesired phage particles are removed. For the positive panning phase, the target antigen of interest is fixed on a mica surface and bound phages are eluted and screened to identify phages that selectively bind the target antigen. The target protein variant does not need to be purified providing the appropriate negative panning controls have been used. Even target protein variants that are only present at very low concentrations in complex biological material can be utilized in the positive panning step. Through application of this technology, we acquired antibodies to protein variants of TDP-43 that are selectively found in human ALS brain tissue. We expect that this protocol should be applicable to generating reagents that selectively bind protein variants present in a wide variety of different biological processes and diseases.

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

筋萎縮性側索硬化症におけるTDP-43の変異体に対する形態学的試薬の分離のための新規原子間力顕微鏡ベースのバイオパニング

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

Germinosomes と枯草菌胞子の内部の膜の可視化

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

早期変形性関節症の検出に対する原子間力顕微鏡の応用

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

数百個の C.アルビカン 細胞に対するバイオ原子間力顕微鏡測定の自動化

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...