עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות גרנט GM086822. המחברים מבקשים להודות בני הזוג. אלק Pakhomov &amp; פול וואלאס (Univ. של מתקן למשתמש וושינגטון ננוטכנולוגיה (NTUF)) ואנדריאה סלייד (Bruker AXS) לקבלת סיוע טכני המומחה שלהם. ה-DNA הדמיה AFM נערך בבית Univ. וושינגטון NTUF, חבר של רשת ננוטכנולוגיה התשתיות הלאומיות. 2xGal4-2xGRE-luciferease פלסמיד סופק על ידי חביב במעבדה של ד&quot;ר קית&#39; ימאמוטו (Univ. של קליפורניה, סן פרנסיסקו).

1. הכנת דגימות דנ&quot;א וחלבון להיות צילמו ללא מזהמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד ביומולקולות להיות צילמו ומניחים חיץ מימית מתאים. חלבונים להיות צילמו ניתן יהיה לטהר באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית 6, ואחריו immunoadsorption על ידי הסרה של נוגדנים ואת גלולה 1,2, או טיהור Profinity המדויק והסרת תג 7 (איור 2 א). לבודד מולקולות דנ&quot;א להיות צילמו על ידי טיהור miniprep (2B איור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אישור הרכב וטוהר של דגימות חלבון להיות צילמו באמצעות SDS-PAGE ומערב סופג. עבור ה-DNA, לאשר רצף וטוהר ידי השלמת הגבלה לעכל ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגימות ספיחה AFM חיץ כדי לקדם את הדבקות של המדגם כדי מיקה. לקבלת דוגמיות חלבון, 10 mM HEPES חיץ עשוי לשמש. נוסף נמוך מלחים יוניים כוח או cofactors אחרים ניתן להוסיף גם כן. עבור דגימות DNA, כוללים קטיון divalent (למשל Mg 2 + או Ni 2 +) כדי לקדם ספיחה למצע מיקה. מתאים Mg 2 + המכיל מאגר של DNA הוא 10 mM טריס, pH 7.5, 10 mM NaCl, 2 מ&quot;מ MgCl 2 3. Ni חלופה 2 חיץ + הוא HEPES 10 מ&quot;מ, pH 6.8, 10 mM NiCl 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את המדגם כדי בריכוז של 5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​במאגר ספיחה. לערבב בעדינות. חנות על הקרח בעוד מיקרוסקופ מכינים. </li></ol> 2. הרכבה AFM בדיקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום בעל נוזל התא בדיקה על גבי שלוחה תחנת עגינה המתאימה להתקנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את שלוחה ארוכה ועבה (המכונה שלוחה &#39;ב&#39;) של בדיקה חד מנוף (SNL) ניטריד לשמש הדמיה. בזהירות להעביר אותו בעל תא נוזל בדיקה, להבטיח כי קצה נשאר זקוף. הערה טכנית: טיפול אקסטרים חייב להיות משולם תוך בדיקה נמצא במעבר, כמו להפיל אותו מגובה כלשהו עלול לגרום נזק או להרוס את שלוחה או טיפ. SNL microlever (MSNL) בדיקה עשוי לשמש כאלטרנטיבה לחקור את SNL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את מחזיק בדיקה מתחנת העגינה ולבחון את שלוחה תחת מיקרוסקופ אור כדי להבטיח שהוא שלם יושב כמו שצריך בעל תא נוזל בדיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בזהירות את הראש AFM מ הרכבה להשתלב מכשיר על ידי הידוק בורג המחורצים מהדק את הראש. הערה טכנית: טיפול אקסטרים חייב להיות משולם תוך מניפולציה של ראש AFM, כמו להפיל אותו אפילו ממרחק קצר (למשל, אם לא יושב כראוי באסיפה להשתלב) עלול לגרום נזק משמעותי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היפוך ראש AFM ובתקיפות לדחוף את נוזל בעל תא החללית על ארבע סיכות בבסיס הראש AFM. בזהירות להחזיר את הראש AFM לתוך הרכבה להשתלב מכשיר. שחרר את הבורג המחורצים מהדק ראש להדק את הראש AFM לתוך המכשיר. </li></ol> 3. איתור קצה שלוחה, יישור לייזר, והתאמת photodetector <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתוכנת המכשיר AFM, לאתר את קצה שלוחה ידי הזזת ידיות של מיקרוסקופ אור המשולב. כוון את התאורה של המיקרוסקופ אם יש צורך לשפר את הזיהוי קצה. תביא סוף קצה שלוחה לתוך בסמיכות של הכוונת המוצג על התוכנה במכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו את קצה שלוחה אל המוקד באמצעות התאמת בחצים מעלה ומטה של ​​הבקר אופטיקה על התוכנה. השתמש איטי (S) או (ז) במהירות בינונית תוך התאמת אופטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את הלייזר על קצה שלוחה באמצעות התאמת ידיות לייזר. הזיזו את ידיות הסתגלות עד נקודה אדומה הלייזר בתוך במקום תאורה לבנה. מעקב לאורך הזרוע שלוחה באמצעות דפוס זיג זג עד הלייזר ממוקם על קצה שלוחה. כאשר מיושר כראוי, נקודה השתקפות חזקה יופיע החלון הקדמי של הראש AFM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המרכז photodetector ידי התאמת ידיות photodetector על הראש AFM. זה יהיה ליישר את נקודה לייזר על הכוונת של התצוגה photodetector של התוכנה במכשיר. סכום אות נצפתה צריך להיות כ 4-6. </li></ol> 4. מיקום AFM ראש שלוחה כוונון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח גיליון ביקע טרי נציץ המצורפת לדיסק הדגימה מתכת AFM על בעל מדגם ממוגנטים על גבי צלחת בעל AFM. ההתקנה זה ישמש לתפקיד ראש AFM לפני הדמיה דגימת DNA או חלבון מוכן בשלב 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הערה טכנית: בעל מדגם ממוגנטים מחזיק נוזל בדיקה תא עבה יותר מדגם אחר לחיזוק מנגנוני ובעלי בדיקה. אם יש כיום אישור מספיק בין הרכבה מיקה מדגם בעל הראש AFM, להזיז את הראש AFM על ידי בחירת סמל לסגת על תוכנת המכשיר מספר פעמים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סובב את הלוח בעל AFM כך את הדיסק הדגימה ממוקם הדמיה הראשונית. ודא את המצע מיקה מרוכז תחת הראש AFM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הראש כלפי מטה AFMפני השטח של הדיסק מיקה הדגימה באמצעות משטח מוקד השליטה של ​​התוכנה במכשיר. בחר (M) בינונית מהירות על המנוע Z, ולהמשיך לכיוון פני המים עד הראש AFM הוא כ 2 מ&quot;מ מעל מיקה. בשלב זה, לעבור להשתמש במהירות איטית (S) Z מנוע כדי להימנע ממגע פתאומי בין החללית לבין המשטח (המכונה מתרסק קצה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך להזיז את החללית קרוב לפני השטח המצע מיקה עד הייחודיות על פני השטח מיקה או השתקפות קצה הם בפוקוס. מעבר בין פני השטח השתקפות קצה מטוסים באמצעות מוקד &quot;להתמקד:&quot; הסמל של התוכנה במכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את סמל מנגינה מתוך התוכנה המכשיר לכוון את שלוחה. תדר התהודה של SNL מומלץ בדיקות MSNL שלוחה היא kHz 20-60. בחר לשיא של 5% לקזז. הערה טכנית: כוונון שלוחה נאותה חיונית הדמיה דגימה מספקת. </li></ol> 5. הדמיה מיקה פני השטח מדגם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Engage את החללית על פני השטח מיקה. הגדרת גודל הסריקה הראשונית עד 10 מיקרומטר וקצב סריקה הרץ 1. רווח אינטגרל ולהשיג יחסי ניתן להגדיר תחילה 0.2 ו - 0.4, בהתאמה. התאם רווחים לפי הצורך כדי שיהיה זכר וסריקות לשחזר בערך חפיפה. הקטנת setpoint משרעת יגדיל את האינטראקציה בין החללית לבין מיקה ולהבטיח מעורבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלמו תמונות סריקה מלאה של השדה 10 מיקרומטר. הקטנת גודל סריקה עד 5, 1, ו - 0.5 מיקרומטר ו ללכוד תמונות שלם של כל שדה. התאם רווחי וקצב סריקה לפי הצורך. לכידת תמונות של פני השטח מיקה מספק הבסיס לעומת ה-DNA ואת החלבונים המכילים דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את החללית בלחיצה אחת על אייקון לנתק את התוכנה על המכשיר. </li></ol> 6. הדמיה של ביומולקולות עניין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לערבב בעדינות את ה-DNA או דגימת חלבון מוכן בשלב 1 ולהכין לטעון אותו על פני השטח מיקה הדמיה. מערבבים 5 μl של המדגם מוכן עם 45 μl של חיץ ספיחה טרי (ריכוז המדגם הסופי = 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להוסיף 50 μl של 0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​פתרון biomolecule המכילים ישירות על גבי המשטח מיקה. האם זה מבלי להזיז את הראש או בדיקה AFM, ולהבטיח את הפתרון מדגם (אך לא קצה pipet) יוצר קשר עם החללית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 5 דקות הפסקה כדי לאפשר ביומולקולות במדגם לדבוק פני השטח מיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתום 5 דקות, pipet μl נוסף 50-100 של חיץ ספיחה לתוך בעל תא נוזל בדיקה נזהר שלא לגעת בדיקה, ראש AFM, או מיקה עם קצה pipet. זה יהוו המניסקוס ולאפשר AFM הקשה הדמיה במצב נוזל. איור 3 מראה את ההסדר הסופי של התא שלוחה נוזל, לדוגמה, בעל המדגם, המניסקוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוונו את photodetector ויישר מחדש את לייזר שלוחה לפי הצורך. הערה טכנית: צפייה קצה בדיקה ויישור הלייזר הוא מסובך עקב דיפרקציה הדפוס הנגרמת על ידי הוספת מאגר מדגם לתוך מחזיק בדיקה. ידנית retune שלוחה, במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Re-לעסוק בדיקה באמצעות כלי תוכנה. התאמת הטיה אנכית, רווח נפרד, ולהשיג יחסי לפי הצורך. זה יהיה להתחיל את התהליך מחדש הדמיה בסעיף נציץ סרוקים מיד לפני הוספת מדגם ותמונות ללכוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדלת גודל סריקה (500 ננומטר-10 מיקרומטר) כדי לזהות אזורים של עניין. זום פנימה להפחית את קצב הסריקה הרץ 0.5 כדי לשפר את רזולוציית התמונה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדמיה תושלם, לנתק את החללית על ידי בחירת לסגת סמל התוכנה במכשיר מספר פעמים. ודא אישור מספיק בין ראש AFM ו דיסק הדגימה לפני פירוק התא נוזל או דיסק הדגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף ביסודיות את תא נוזל בדיקה מחזיק ואת הדיסק הדגימה עם מים מזוקקים כדי למנוע גבישי מלח מ טביעה כמו שיורי מתאדה ספיחה חיץ. יבש עם אוויר דחוס. </li></ol> 7. נציג תוצאות: דוגמאות של תמונות AFM מוצגים באיור 4. המצע מיכה (א) מספק משטח שטוח מולקולרי אשר על דנ&quot;א וחלבון יכול לספוג. הדמיה מיקה לפני דגימות biomolecule מספק בקרה הערכה שלילית של רעש הדמיה. הוא גם מספק רמה של ביטחון כי שלוחה מכוון כראוי הדמיה מדגם הבאות יהיה מוצלח. פעמיים גדילי הדנ&quot;א פלסמיד (B, D), supercoiled מתיימר, מזוהה בקלות על ידי מראה סימטרית שלה הפקדת אחיד על פני המצע מיקה ייחוד בעבר. קומפלקסים חלבונים בגדלים החלקיקים דיסקרטי (C, E) גם להבחין ייחודי מן המצע מיקה. ההבדלים בגודל החלקיקים עולה הטרוגניות המדגם, יכול להיות שימושי כדי קירוב stoichiometry חלבון מורכב או פעילות ביוכימית. הצורה אלכסונית בכלל אוריינטציה עקבית של הפרוחלקיקים טיין נצפתה בלוח C הוא חפץ הדמיה, כמו חלבונים היה כצפוי להיות מונחה על פני המצע מיקה באופן אקראי. גורמים אפשריים של החפץ הנצפה הוא פיזי קצה חריגות או AFM הדמיה מהירה מדי של שער סריקה. בעוד קונבולוציה קצה (מאויר ב 1B איור) מונע מוחלט מדידה חישובים באורך של x ו-y צירים, מדידת הגובה (ציר z) x ו-y יחסית המדידות עשוי להיות שימושי בכל זאת להערכת מאפייני biophysical של ביומולקולות הדמיה. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig1.jpg" alt="איור 1"/> איור 1: מצגת סכמטי של כוח אטומי במצב הקשה מיקרוסקופית (AFM). , את המיקרוסקופ. בסוף שלוחה הוא קצה חד נעה מעלה ומטה כמו סריקות על פני השטח של מצע מיקה אשר מתחמי לספוג biomolecular. כאשר הסורק עובר בכיוונים x ו-y, קרן לייזר משתקף מהחלק האחורי של שלוחה אל גלאי רגיש, עמדה photodiode למפות את המרחק האנכי (z) טיפ עובר כשהוא עובר על מתחמי biomolecular יושב על מיקה. ב עיוות של התמונה בכיוונים x ו-y הנגרמת על ידי קונבולוציה קצה. רדיוס הנקוב של טיפ סיליקון קונבנציונלי ניטריד הוא גדול יותר מאשר החלקיקים להיות צילמו, לבין קצה המגעים קצה מדגם כפי שהוא חוצה את פני השטח. קונבולוציה עצה תוצאות חלקיקי צילמו המופיעים גדול ב x ו-y כיוונים, אבל לא בכיוון z. השפעה זו ניתן למזער על ידי שימוש טיפים עם רדיוס קטן טיפ הנומינלי. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2: איור של חלבון immunoadsorbed מדגם הכנה DNA. שחרור, של GR immunoadsorbed • חלבון מורכב מ hsp70 בנוגדן (מב), חלבון A-Sepharose (PAS) גלולה. דוגרים immunopellet עם פפטיד המכיל את epitope MAB יקל על שחרורו של GR • חלבון מורכב hsp70 מן גלולה, המאפשר מורכבים להיות שנאסף supernatant ו דמיינו ידי AFM. B, הכנת DNA עבור הדמיה AFM מחייב שימוש קטיון divalent ספיחה חיץ. קטיון divalent מגביר את הזיקה של ה-DNA של המצע מיקה. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3: הסדר סופי של הראש AFM, מחזיק נוזל בדיקה התא, לדוגמה, בעל הדגימה, ואת המניסקוס חיץ. טיפול, יש לנקוט בעת הפקדת מדגם חיץ נוסף על המצע מיקה, כדי למנוע מגע פיזי בין קצה pipet וראש AFM, קוראים נוזל, המצע מיקה. ב &#39;, הגדלה של א המניסקוס המאגר משתרע מדיסק הדגימה את בעל תא נוזל בדיקה. <img src="/files/ftp_upload/3061/3061fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4: micrographs כוח אטומי המצע מיקה (A), 2xGal4-2xGRE luciferease-DNA פלסמיד 8 (B, D), ו - GR • קומפלקסים חלבונים hsp70 (C, E) בתמיסה שנאגרו. מיכה משמש דימוי בקרה להשוות עם חזותיים של דנ&quot;א וחלבון. GR • קומפלקסים חלבונים hsp70 הוכנו על ידי immunoadsorption של GR ישפעו hsp70 ולאחר מכן שוחרר מן גלולה את הנוגדן-חרוז באמצעות נוגדן MAB מתחרים (באיור 2 א). ה-DNA הוכן על ידי miniprep פלסמיד קונבנציונאלי. לוחות A, B ו-C הם של הגדלה מקבילה (ברים בקנה מידה = 200 ננומטר), כמו גם לוחות D ו-E (מוטות סולם = 40 ננומטר).

<ol>
	<li>Murphy, P. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+mechanism+of+assembly+of+a+glucocorticoid+receptor&#149;hsp70+complex+that+is+primed+for+subsequent+Hsp90-dependent+opening+of+the+steroid+binding+cleft.">Visualization and mechanism of assembly of a glucocorticoid receptor&#149;hsp70 complex that is primed for subsequent Hsp90-dependent opening of the steroid binding cleft.</a> J Biol Chem. 278, 34764-34773 (2003).</li><li>Harrell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+glucocorticoid+receptor+transport+on+microtubules+by+dynein.">Evidence for glucocorticoid receptor transport on microtubules by dynein.</a> J Biol Chem. 279, 54647-54654 (2004).</li><li>Pastre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adsorption+of+DNA+to+mica+mediated+by+divalent+counterions:+a+theoretical+and+experimental+study.">Adsorption of DNA to mica mediated by divalent counterions: a theoretical and experimental study.</a> Biophys J. 85, 2507-2518 (2003).</li><li>Guthold, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+one-dimensional+diffusion+and+transcription+by+Escherichia+coli+RNA+polymerase.">Direct observation of one-dimensional diffusion and transcription by Escherichia coli RNA polymerase.</a> Biophys J. 77, 2284-2294 (1999).</li><li>Petrucco, S., Volpi, G., Bolchi, A., Rivetti, C., Ottonello, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nick-sensing+DNA+3'-repair+enzyme+from+Arabidopsis.">A nick-sensing DNA 3'-repair enzyme from Arabidopsis.</a> J Biol Chem. 277, 23675-23683 (2002).</li><li>Murphy, P. J. M., Morishima, Y., Kovacs, J. J., Yao, T. P., Pratt, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+dynamics+of+hsp90+action+on+the+glucocorticoid+receptor+by+acetylation/deacetylation+of+the+chaperone.">Regulation of the dynamics of hsp90 action on the glucocorticoid receptor by acetylation/deacetylation of the chaperone.</a> J Biol Chem. 280, 33792-33799 (2005).</li><li>Ruan, B., Fisher, K. E., Alexander, P. A., Doroshko, V., Bryan, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+subtilisin+into+a+fluoride-triggered+processing+protease+useful+for+one-step+protein+purification.">Engineering subtilisin into a fluoride-triggered processing protease useful for one-step protein purification.</a> Biochemistry. 43, 14539-14546 (2004).</li><li>Meijsing, S. H., Elbi, C., Luecke, H. F., Hager, G. L., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ligand+binding+domain+controls+glucocorticoid+receptor+dynamics+independent+of+ligand+release.">The ligand binding domain controls glucocorticoid receptor dynamics independent of ligand release.</a> Mol Cell Biol. 27, 2442-2451 (2007).</li><li>Shen, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+effective+sample+preparation+method+for+atomic+force+microscopy+visualization+of+individual+DNA+molecules+in+situ.">A simple and effective sample preparation method for atomic force microscopy visualization of individual DNA molecules in situ.</a> Mol Biol Rep. 38, 965-969 (2010).</li><li>Paulite, M., Fakhraai, Z., Akhremitchev, B. B., Mueller, K., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly,+tuning+and+use+of+an+apertureless+near+field+infrared+microscope+for+protein+imaging.">Assembly, tuning and use of an apertureless near field infrared microscope for protein imaging.</a> J Vis Exp. , (2009).</li><li>Cretu, A., Castagnino, P., Assoian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+the+effects+of+matrix+stiffness+on+cellular+function+using+acrylamide-based+hydrogels.">Studying the effects of matrix stiffness on cellular function using acrylamide-based hydrogels.</a> J Vis Exp. , (2010).</li><li>Brunger, A. T., Weninger, K., Bowen, M., Chu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+studies+of+the+neuronal+SNARE+fusion+machinery.">Single-molecule studies of the neuronal SNARE fusion machinery.</a> Annu Rev Biochem. 78, 903-928 (2009).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

AFM מספק שיטה מיקרוסקופית ייחודי המסוגל ביומולקולות הדמיה בודדים ללא ציפוי בפתרונות שנאגרו מימית כמעט פיזיולוגיים בזמן אמת. זה מאפשר הדמיה של חלבונים בודדים מולקולות דנ&quot;א, כמו גם מתחמי multiprotein ו-DNA חלבון קומפלקסים. חלקיקים הדמיה macromolecular עם AFM יכול להיות שימושי להערכת ההומוגניות מדגם לזיהוי הסדר הפיזי של הרכיבים המרכיבים של החלקיקים שנצפו. גישה זו של התבוננות macromolecular חלקיקים בודדים יכולים להיות תוספת שימושית טכניקות ביוכימיות קונבנציונליים, כגון מבחני immunoprecipitation, ג&#39;ל אלקטרופורזה polyacrylamide, והדרה גודל עמודה כרומטוגרפיה, המספקים נתונים מסכמת משמעותי המייצג את 10 -10 11 3 מתחמי biomolecular בודדים עניין להציג במדגם. מחקר לתוך stoichiometry multiprotein מורכבים, אינטראקציות biomolecular, ודרישות cofactor יכול כל להיחקר באמצעות AFM. השיטה המוצגת כאן ניתן להתאים להתאים biophysical שאלות ספציפיות של עניין. לדוגמה, באמצעות תא נוזל בדיקה בעל יכולת החלפת החיץ, הוא ניתן cofactor דרישות assay להיווצרות חלבונים מורכבים. ה-DNA חלבון אסיפות יכול להיווצר ו ניתק בשנת ליד בזמן אמת, ואפילו תוך הדמיה. הדנ&quot;א יכול להיות שנוצר עם רצפים מסוימים של עניין (לדוגמה, אלמנטים בתגובה משוערת או חלבון רומן רצף מחייב), מעורבב עם החלבון מחייב שיערו, הדמיה לספק עדות ישירה של אינטראקציות מולקולאריים. במצב הקשה AFM הדמיה באופן משמעותי פחות מסובך אם דגימות יבש מנוצלים ולא דגימות תמיסות מימיות, ועומד DNA ליניארי וסגר מעגל פלסמידים DNA יש שני כבר צילמו בדרך זו 3,9. השיטה המוצגת כאן מנצל דגימות שנאגרו פתרונות על מנת לספק סביבת הדמיה פיזיולוגית יותר. שיטות אחרות לציין של חלבונים הדמיה צריך להיות גם נחשב, לרבות בתחום האינפרא אדום הקרוב מיקרוסקופיה 10. השימוש משלימים של immunoadsorption בשיתוף פעולה עם AFM מספק הזדמנות להכין מספר עצום של קומפלקסים חלבונים, באמצעות ומבוססת טכניקות ביוכימיות, ולאחר מכן לדמיין אותם לאחר שחרורו מן immunoadsorbing נוגדנים חרוז גלולה. לדוגמה, GR immunoadsorbed כבר assayed על הקשר שלה עם החלבון המלווה המולקולרי hsp70 1, כמו גם את החלבון מנוע dynein 2 שימוש בגישה זו כדי להעריך גודל מורכבים stoichiometries. גודל החלקיקים ותכונות biophysical (קשיחות למשל) כבר שימושי לוודא את זהותו של ביומולקולות נצפתה בדגימות AFM הדמיה 11,12. אפשר גם לאשר זהות biomolecule על ידי תוספת של biomolecule אינטראקציה (לדוגמא ליגנד או נוגדן חד שבטי), זה היה לאגד היעד שלה לגרום לעלייה גודל החלקיקים אם biomolecule היעד הוא ההווה.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th></tr><tr><td> Dimension 3100 </td><td> Bruker </td><td> Dimension 3100 </td></tr><tr><td> נוזל המימד Cell </td><td> Bruker </td><td> DTFML-DD-HE </td></tr><tr><td> ניטריד מנוף שארפ (SNL) סיליקון ניטריד AFM בדיקה </td><td> Bruker </td><td> SNL-10 </td></tr><tr><td> Microlever ניטריד מנוף חדה (MSNL) סיליקון ניטריד AFM בדיקה </td><td> Bruker </td><td> MSNL-10 </td></tr><tr><td> NanoScope AFM כלי תוכנה </td><td> Bruker </td><td> 004-132-000 </td></tr><tr><td> מתכת AFM דיסקים הדגימה </td><td> טד פלה </td><td> 16208 </td></tr><tr><td> כיתה V1 מיכה דיסקים, 12 מ&quot;מ </td><td> טד פלה </td><td> 50-12 </td></tr></tbody></table>

visualization of recombinant dna and protein complexes using atomic force microscopy

מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) מאפשר הדמיה של חלבונים בודדים, מולקולות דנ&quot;א, חלבונים קומפלקסים, ו-DNA-חלבון קומפלקסים. בצד של שלוחה של המיקרוסקופ היא בדיקה בקנה מידה ננו, אשר חוצה אזורים בתמונה החל ננומטר עד מיקרומטר, מדידת גובה של מקרומולקולות נחים על פני המצע בכל נקודה נתונה. כוחות אלקטרוסטטיים לגרום חלבונים, שומנים, וחומצות גרעין כדי רופף לצרף המצע של אוריינטציות אקראי היתר הדמיה. הנתונים שנוצר דומה מפה טופוגרפית, שם מקרומולקולות לפתור כמו תלת מימדי חלקיקים בגדלים בדידים (איור 1) 1,2. במצב הקשה AFM כרוך תנודה חוזרות ונשנות של שלוחה, המאפשרת הדמיה של biomaterials רכים יחסית כגון דנ&quot;א וחלבונים. אחד היתרונות הבולטים של AFM על אחרים שיטות מיקרוסקופיה ננו ההסתגלות היחסי לדמיין חלבונים בודדים ומתחמים מולקולארית מאגרים מימית, כולל כמעט פיזיולוגי התנאים שנאגרו, בזמן אמת, ללא כתמים או ציפוי המדגם להיות צילמו. השיטה המוצגת כאן מתארת ​​את הדמיה של דנ&quot;א גורם שעתוק immunoadsorbed (כלומר, הקולטן glucocorticoid, GR) בתמיסת בופר (איור 2). חלבונים Immunoadsorbed ו קומפלקסים חלבונים ניתן להפריד immunoadsorbing נוגדנים חרוז גלולה על ידי תחרות עם epitope את הנוגדן הדמיה אז (איור 2 א). זה מאפשר מניפולציה ביוכימית של ביומולקולות עניין לפני הדמיה. מטוהרים פעם, דנ&quot;א וחלבונים יכול להיות מעורבת המורכבת אינטראקציה כתוצאה ניתן הדמיה גם כן. עקידת דנ&quot;א מיקה דורש קטיון divalent 3, כגון ניקל או 2 + Mg 2 +, אשר ניתן להוסיף מאגרים מדגם עדיין לשמור על פעילות החלבון. שימוש בגישה דומה, AFM נוצל לדמיין אנזימים נפרדים, כולל RNA פולימראז 4 ו - אנזים תיקון 5, חייב גדילי דנ&quot;א בודדות. ניסויים אלו מספקות תובנה משמעותית לתוך חלבונים ושל אינטראקציות חלבון דנ&quot;א biophysical המתרחשים ברמה המולקולרית. חלקיקים הדמיה macromolecular הפרט עם AFM יכול להיות שימושי לקביעת הומוגניות החלקיקים לזיהוי הסדר הפיזי של הרכיבים המרכיבים של חלקיקים הדמיה. בעוד השיטה הנוכחית פותחה עבור להדמיה של GR-המלווה קומפלקסים חלבונים ו-DNA גדילי 1,2 אשר GR יכול להיקשר, זה יכול להיות מיושם באופן נרחב ל-DNA הדמיה דגימות חלבון ממגוון רחב של מקורות.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy at JoVE.com

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

כוח הקשה במצב מיקרוסקופ אטומי (AFM) שיטת הדמיה של פלסמיד דנ&quot;א, חלבונים cytoplasmic, ו-DNA-חלבון מתחמי מתואר. השיטה כוללת גישות חלופיות להכנת דגימות הדמיה AFM בעקבות מניפולציה ביוכימית. ה-DNA המכיל אזורים ספציפיים אינטראקציה חלבון שנצפה כמעט פיזיולוגי התנאים חיץ.

ויזואליזציה של דנ&quot;א רקומביננטי ו קומפלקסים חלבונים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

visualization-recombinant-dna-protein-complexes-using-atomic-force

Research

JoVE Journal

Bioengineering

22.3K Views.  Seattle University. כוח הקשה במצב מיקרוסקופ אטומי (AFM) שיטת הדמיה של פלסמיד דנ"א, חלבונים cytoplasmic, ו-DNA-חלבון מתחמי מתואר. השיטה כוללת גישות חלופיות להכנת דגימות הדמיה AFM בעקבות מניפולציה ביוכימית. ה-DNA המכיל אזורים ספציפיים אינטראקציה חלבון שנצפה כמעט פיזיולוגי התנאים חיץ.

Video: Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Immobilization חיידקית עבור הדמיה על ידי מיקרוסקופית כוח אטומי

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

ויזואליזציה של קליפת הארגון ואת הדינמיקה של מיקרואורגניזמים, באמצעות Fluorescence סה&quot;כ פנימי מיקרוסקופית השתקפות

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

כימות תכונות המכאניות של Glycocalyx האנדותל עם מיקרוסקופי כוח אטומי

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

מדידת התכונות המכאניות של תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Surface Potential Measurement of Bacteria Using Kelvin Probe Force Microscopy

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. Kelvin probe force microscopy (KPFM) is a module of atomic force microscopy (AFM) that measures the contact potential difference between surfaces at the nano-scale. The combination of KPFM with AFM allows for the simultaneous generation of surface potential and topographical maps of biological samples such as bacterial cells. Here, we employ KPFM to examine the effects of surface potential on microbial adhesion to medically relevant surfaces such as stainless steel and gold. Surface potential maps revealed differences in surface potential for microbial membranes on different material substrates. A step-height graph was generated to show the difference in surface potential at a boundary area between the substrate surface and microorganisms. Changes in cellular membrane surface potential have been linked with changes in cellular metabolism and motility. Therefore, KPFM represents a powerful tool that can be utilized to examine the changes of microbial membrane surface potential upon adhesion to various substrate surfaces. In this study, we demonstrate the procedure to characterize the surface potential of individual methicillin-resistant Staphylococcus aureus USA100 cells on stainless steel and gold using KPFM.

Here, we present a protocol explaining the use of Kelvin probe force microscopy as a tool for generating high resolution nano-scale surface potential maps. This tool was applied to assess the role of surface potential on the binding capacity of microorganisms to substrate surfaces.

משטח מדידת פוטנציאל של חיידקים באמצעות קלווין Probe מיקרוסקופית כוח

Surface potential is a commonly overlooked physical characteristic that plays a dominant role in the adhesion of microorganisms to substrate surfaces. ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in Parkinson&#8217;s disease and beta-amyloid and tau in Alzheimer&#8217;s disease, it is critically important to develop morphology specific reagents that can selectively target these disease-specific protein variants to study the role of these variants in disease pathology and for potential diagnostic and therapeutic applications. We have developed novel atomic force microscopy (AFM) based biopanning techniques that enable isolation of reagents that selectively recognize disease-specific protein variants. There are two key phases involved in the process, the negative and positive panning phases. During the negative panning phase, phages that are reactive to off-target antigens are eliminated through multiple rounds of subtractive panning utilizing a series of carefully selected off-target antigens. A key feature in the negative panning phase is utilizing AFM imaging to monitor the process and confirm that all undesired phage particles are removed. For the positive panning phase, the target antigen of interest is fixed on a mica surface and bound phages are eluted and screened to identify phages that selectively bind the target antigen. The target protein variant does not need to be purified providing the appropriate negative panning controls have been used. Even target protein variants that are only present at very low concentrations in complex biological material can be utilized in the positive panning step. Through application of this technology, we acquired antibodies to protein variants of TDP-43 that are selectively found in human ALS brain tissue. We expect that this protocol should be applicable to generating reagents that selectively bind protein variants present in a wide variety of different biological processes and diseases.

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

רומן הכוח האטומי מיקרוסקופית מבוסס Biopanning לבידוד של חומרים כימיים מסוימים מורפולוגיה נגד גרסאות TDP-43 בטרשת לרוחב amyotrophic

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

כוח האטומי מיקרוסקופית הדמיה וחיל ספקטרוסקופיה של bilayers שומנים הנתמכים

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

ויזואליזציה של Germinosomes, את הקרום הפנימי בנבגים Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

יישום של מיקרוסקופ כוח אטומי כדי לזהות אוסטיאוארתריטיס מוקדם

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy (Conpokal) on Live Cells

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning and transmission electron microscope, to the invention of atomic force microscopy, and advances in fluorescent imaging, there have been substantial gains in technologies that enable the study of small materials. Conpokal is a portmanteau that combines confocal microscopy with atomic force microscopy (AFM), where a probe &#8220;pokes&#8221; the surface. Although each technique is extremely effective for the qualitative and/or quantitative image collection on their own, Conpokal provides the capability to test with blended fluorescence imaging and mechanical characterization. Designed for near simultaneous confocal imaging and atomic force probing, Conpokal facilitates experimentation on live microbiological samples. The added insight from paired instrumentation provides co-localization of measured mechanical properties (e.g., elastic modulus, adhesion, surface roughness) by AFM with subcellular components or activity observable through confocal microscopy. This work provides a step by step protocol for the operation of laser scanning confocal and atomic force microscopy, simultaneously, to achieve same cell, same region, confocal imaging, and mechanical characterization.

Near Simultaneous Laser Scanning Confocal and Atomic Force Microscopy Conpokal on Live Cells

Presented here is the protocol of the Conpokal technique, which combines confocal and atomic force microscopy into a single instrument platform. Conpokal provides same cell, same region, near simultaneous confocal imaging and mechanical characterization of live biological samples.

ליד סריקת לייזר בו זמנית מיקרוסקופיה קונפוקל וכוח אטומי (Conpokal) על תאים חיים

Techniques available for micro- and nano-scale mechanical characterization have exploded in the last few decades. From further development of the scanning ...