私たちは、試験期間中に彼らの助けのためにメイヨークリニックMycobacteriology研究室の検査技師に感謝いたします。

各研究室では、接種の準備のためとプレートに接種のピペッティングに適切なバイオセーフティレベルを決定するために、その制度生物学的安全管理者と共同でリスク評価を実行する必要があります。マイクロタイタープレートに接種し、プラスチックの接着シールで密閉されるまで、私たちの研究室では、我々は生物学的安全性レベル3実験室（BSL3）プラクティスを活用する。これらのプレートは、熱にも密封であるビニール袋、内側に配置されます。マイクロタイタープレートのインキュベーションと解釈読書はバイオセーフティーレベル2実験室（BSL2）で実施される。 1。材料のラベリング<ol><li>ラベル血液寒天プレート、三ミドルブルック7H10プレート、ミドル7H9ブロス、生理食塩水、トゥイーンガラスビーズのチューブとBSL2の適切な識別子（例えば、患者名、医療記録番号）を持つマイクロタイターASTプレート。 </li><li>ラベル血液寒天培地と&quot;純度のチェック&quot;などのメッキ7H10。接種の定期的なコロニー数は、生物の適切な濃度は、試験で使用されていることを確認することをお勧めします。実行コロニー数は&quot;1 / 1コロニー数&quot;と&quot;50分の1コロニー数&quot;で標識7H10プレートの二つを持っている必要があります。 </li></ol> 2。 BSL3に入るテクノロジストの準備<ol><li>適切な個人保護具は、BSL3で作業する必要があるとソリッドフロントガウン、頭部カバー、手袋、靴カバー、および人工呼吸器が含まれています。各機関は、所属機関の産業衛生責任者と共同で独自の呼吸保護計画を確立する必要があります。当研究室では、我々はパワー空気浄化マスク（PAPRs）とフィットHEPAフィルタを通した、N95ハーフ顔の呼吸器を含む利用可能ないくつかの呼吸器を、持っている。 </li></ol> 3。生物学的安全キャビネットの準備<ol><li> BSL3では、表面を消毒し、空気の通気パネルから約6インチ消毒液で浸したペーパータオルを配置することによって、生物学的安全キャビネット（BSC）を準備する。 </li><li>廃棄物の左側の容器、および右側の小さいnephlometerとボルテックスを置きます。 </li><li>接種ループ、pipetorsとヒントは、ペーパータオルの横に配置されています。 </li><li>生物（ブロス中または固体培地上）とペーパータオルの上でマクファーランド0.5標準でラックを置きます。 </li></ol> 4。比濁計のキャリブレーション<ol><li>比濁計で生理食塩水、トゥイーンのガラスビーズ管を配置し、生理食塩水、トゥイーンのブランクを使用してゼロに楽器を設定します。 </li><li>比濁計のマクファーランド0.5標準を置いて、製造元の指示に従って、キャリブレーション。 </li></ol> 5。接種の準備<ol><li> ≥0.5マクファーランド標準が得られるまで、適切に標識された生理食塩水、トゥイーンガラスビーズのチューブに滅菌ループを使用して固形培地からBSC、スクレープのコロニーでの作業。 </li><li>視覚的にサンプルを検査し、マクファーランド標準と比較する。 </li><li> 30〜60秒間ボルテックスのサンプル。 </li><li>接種材料は、（タイマーを設定）15分のために解決することができます。 </li></ol> 6。マイクロタイタープレートの接種<ol><li>ステップ4.1と4.2でマクファーランド0.5に校正された比濁計を用いて生理食塩水、トゥイーンブロスで接種を調整します。これは、30分（メーカー仕様につき）以内に完了する必要があります。 </li><li> 200μLピペッターと生理食塩水ビーズ、トゥイーンのチューブのTOP 3分の1 回の接種を100μLを削除するには、LONGエアゾール耐性をピペットチップを使用してください。ミドル7H9ブロスに接種する。 20秒間ゆっくりと渦を接種7H9ブロス。 </li><li>メーカーのパッケージからASTマイクロタイタープレートを取り外します。箔のパッケージが破損している場合は乾燥剤が青色の場合、または使用しないでください。 </li><li>滅菌チューブに滅菌水50μLをピペットで50倍希釈の準備のために後で使用するために1:50希釈チューブを準備します。 </li><li>慎重に溝に7H9ブロス接種を注ぐ。エアロゾル発生を避ける。 </li><li>あなたのラベル面を上にしてASTマイクロタイタープレートを置きます。 </li><li>各ウェルに接種を100μLを追加するには、12チャンネルピペッターを使用してください。 </li><li>コロニーカウントのための希釈液を調製する： <ol type="a"><li> 1月1日希釈は、&quot;1 / 1&quot;とラベル7H10プレート上に1μlのループをストリーキングでも陽性対照（H12）から調製される。 </li><li> 50分の1希釈がよくポジティブコントロール（H12）から1μlのループを接種し、上記で調製した水管の50μlをチューブにそれを旋回することによって調製される。 &quot;1 / 50&quot;というラベルの付いたプレートにこの希釈のストリーク1μL。 </li></ol></li><li>適切に標識された血液寒天培地と分離用7H10プレートとストリークの上に50μLをピペッティングすることによりトラフから純度のプレートに接種する。 </li><li>の場所ASTのマイクロタイタープレート上に接着剤シール。シールの白いバックを使用して十分なシール性を確保するために各ウェルにしっかりと押します。折り目を避けてください。 </li><li>ヒートシールやテープとビニール袋と密接に結核菌消毒剤と場所のマイクロタイタープレートに浸したペーパータオルでそれを拭いてマイクロタイタープレートを消毒する。 <ol type="a"><li>ビニール袋がある主な板の漏れや流出でなければならないすべての培養液が含まれていることを確認するために二次的コンテナとして機能します。 </li></ol></li></ol> 7。材料と生物学的安全キャビネットの消毒<ol><li>エアロゾルを製作するのを避けるために、廃棄容器に静かにそれを配置する前に接種したトラフの上に別のトラフを配置。 </li><li>結核菌消毒剤でダウン拭いてnephlometer、ボルテックス、プレート、チューブ、等を含むすべての材料を消毒し、BSCから取り外す前に、製造元の指示に従って消毒を保証するために適切な時間を待つ。例えば、Prospray、我々が使用する結核菌消毒剤は、抗酸菌を殺すために15分かかります。 </li><li>オートクレーブの前に医療用ごみ袋とシールの廃棄容器を置きます。 </li></ol> 8。インキュベーション<ol><li>プレートを下にメディアとの注意を払って培養する必要のあるすべての液体をこぼしたり、飛散しないように注意してください。 </li><li> BSL2実験室で5〜10％CO 2で5〜10％のCO 2で35〜37℃のインキュベーターでASTのマイクロタイタープレートのプレート、7H10と血液寒天プレートをインキュベートする。 <ol class="lalpha"><li>プレートはしっかりと密封されて、内側密封ビニール袋なので、私たちの研究室では、これは許容範囲です。 </li></ol></li><li> 3回以上のマイクロタイターASTプレートは、製造元の指示に従ってインキュベーターを重ねる必要があります。 </li></ol> 9。代表的な結果結果の解釈： 封印されたASTマイクロタイタープレートは、手動で補助としてまたはVizion（TREK診断）などの自動プレートリーダーでミラーを使用して読み取ることができます。プレートは、できるだけ早く接種後7日間として調べることができます。彼らは正かどうかを判断するための位置H11とH12での成長制御の井戸を調べて（すなわち、ウェルの底にある細胞の預金を持っている）。成長のコントロールウェルが正でない場合は成長のコントロールウェルが陽性になるまで（例えば、10日目、14日目）定期的に、プレートをreinc​​ubateと再検討する。 <ol type="a"><li>ミラーの読み取り： <ol type="i"><li>場所は、プラットフォームにASTマイクロタイタープレートを密封。 </li><li>インキュベーションの7日後に成長のコントロールウェルを読んで、これは負、reinc​​ubate ASTマイクロタイタープレートの場合はtrue。 </li><li>成長のコントロールが許容できる場合には、薬物を含むウェルをお読みください。各薬剤のために、成長の制御と薬剤の井戸を比較しても成長を持たない最初の希釈を記録。 </li><li>成長は、濁度として、あるいはウェルの底にある細胞の預金として表示されます。 </li></ol></li><li>楽器はリード：メーカーの指示に従って、以下の手順では、読書がVizionのプラットフォームで行われる方法の例は次のとおりです。 <ol type="i"><li>ログインします。 </li><li> &quot;MYCOTB&quot;ASTプレートのソフトウェアを使用してください。 </li><li>ユーザーが直面しているバーコードで密封されたプレートを置きます。成長は、濁度として、あるいはウェルの底にある細胞の預金として表示されます。 </li><li>成長のコントロールを読んで、これは負、reinc​​ubate ASTマイクロタイタープレートの場合は、プラスの成長を示していない各薬剤の最初のウェルに画面をタッチするプレートを読んでいれば。 </li></ol></li></ol>純度のプレートをお読みください。血液寒天プレートは48時間後には成長を示してはならないと7H10純度のプレートは、ある生物の種類のコンフルエントな成長が必要です。汚染された場合、ASTマイクロタイターテストは、純粋培養から繰り返す必要があります。 よく下の表を使用して、陽性コントロールのコロニー数を計算します。 コロニーカウントキー<table border="1"><tbody><tr><td> ＃コロニーは、&quot;1 / 1&quot;というラベルの付いたプレートでカウント </td><td> &quot;1 / 50&quot;というラベルの付いたプレートでカウント＃コロニー </td><td> 接種コロニーカウント（CFU / mL）を </td></tr><tr><td> &lt;50 </td><td> 0 </td><td> &lt;5 × 10 4 </td></tr><tr><td> 50から100 </td><td> 0から2 </td><td> 5 × 10 4〜1 × 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> ≤10 </td><td> 5 × 10 5〜1 × 10 5 </td></tr><tr><td> &gt; 100 </td><td> &gt; 10 </td><td> &gt; 5 X 10 5 </td></tr></tbody></table> 結核tuberculoの一部の菌株でパラアミノサリチル酸とが続くことがありますSIS。これは、ペレットを持っているすべての井戸を見て、エンドポイントとして、次の希釈と同じサイズのペレットを持つ最初のウェルを使用して解釈することができます。抵抗は、この薬ではまれである。 <img src="/files/ftp_upload/3094/3094fig1.jpg" alt="図1"/> 図1。 MYCOTBプレートを使用した代表的な結果。 <table border="1"><tbody><tr><td> 薬剤の略語 </td><td> 薬 </td><td> MICのμ/ mLの </td></tr><tr><td> OFL </td><td>オフロキサシン</td><td> 16 </td></tr><tr><td> MXF </td><td>モキシフロキサシン</td><td> 8 </td></tr><tr><td> RIF </td><td>リファンピン</td><td> &gt; 16 </td></tr><tr><td> AMI </td><td>アミカシン</td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> STR </td><td>ストレプトマイシン</td><td> 16 </td></tr><tr><td> RFB </td><td>リファブチン</td><td> 8 </td></tr><tr><td> PAS </td><td>のp -アミノサリチル酸</td><td> ≤0.5 </td></tr><tr><td> ETH </td><td>エチオナミド</td><td> 5 </td></tr><tr><td> CYC </td><td>サイクロセリン</td><td> 4 </td></tr><tr><td> INH </td><td>イソニアジド</td><td> 2 </td></tr><tr><td> KAN </td><td>カナマイシン</td><td> 1.2 </td></tr><tr><td> EMB </td><td>エタンブトール</td><td> 4.0 </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>Wengenack, N., Hall, L., Labombardi, V., Parrish, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+New+Sensititre+(MYCOTB)+MIC+Plate+for+the+Susceptibility+Testing+of+Mycobacterium+tuberculosis+(Mtb)+to+First+and+Second+Line+Drugs.">Evaluation of the New Sensititre (MYCOTB) MIC Plate for the Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis (Mtb) to First and Second Line Drugs.</a> , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HHS+Publication+No.+(CDC)+21-112:+Biosafety+in+Microbiological+and+Biomedical+Laboratories+(BMBL).">HHS Publication No. (CDC) 21-112: Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL).</a> U.S. Department of Health and Human Services Centers for Disease and Preventions. , (2009).</li><li>Morcillo, N., Imperiale, B., Digiulio, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+MGIT+960+and+the+colorimetric-based+method+for+tuberculosis+drug+susceptibility+testing.">Evaluation of MGIT 960 and the colorimetric-based method for tuberculosis drug susceptibility testing.</a> Int J Tuberc Lung Dis. 14, 1169-1175 (2010).</li><li>Bemer, P., Bodmer, T., Munzinger, J., Perrin, M., Vincent, V., Drugeon, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicenter+Evaluation+of+the+MB/BACT+System+for+Susceptibility+Testing+of+Mycobacterium+tuberculosis.">Multicenter Evaluation of the MB/BACT System for Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis.</a> J Clin Microbiol. 42, 1030-1034 (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SENSITITRE+MYCOTB+Susceptibility+Plate:+For+Mycobacterium+Susceptibility+Testing.">SENSITITRE MYCOTB Susceptibility Plate: For Mycobacterium Susceptibility Testing.</a> Product Insert. , (2010).</li><li>CLSI. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Susceptiblity Testing of Mycobacteria, Nocardia, and Other Aerobic Actinomycetes; Approved Standard. Document M24-A. , (2003).</li><li>Sullivan, N., Sotos, J., Anhalt, K., Allen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+results+from+a+new+TREK+Sensititre+Mycobacterium+tuberculosis+MIC+plate+(MYCOTB).">Preliminary results from a new TREK Sensititre Mycobacterium tuberculosis MIC plate (MYCOTB).</a> , (2010).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VersaTREK+MYCO+SUSCEPTIBLITY+KIT.">VersaTREK MYCO SUSCEPTIBLITY KIT.</a> Product insert. , 7115-7160 (2008).</li><li>Parrish, N. M., Carroll, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+the+Clinical+Mycobacteriology+Laboratory+in+the+Diagnosis+and+Management+of+Tuberculosis+in+Low+Prevalance+Settings.">The Role of the Clinical Mycobacteriology Laboratory in the Diagnosis and Management of Tuberculosis in Low Prevalance Settings.</a> J Clin Microbiol. , (2010).</li><li>Kam, K. M., Sloutsky, A., Yip, C. W., Bulled, N., Zingol, M., Espinal, M., Kim, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+critical+concentrations+of+second-line+anti-tuberculosis+drugs+with+clinical+and+microbiological+relevance.">Determination of critical concentrations of second-line anti-tuberculosis drugs with clinical and microbiological relevance.</a> Int J Tubercl Lung Dis. 14, 282-288 (2010).</li><li>Woods, G. L., Warren, N. G., Inderlied, C. B., Murray, P. R., Barron, E. J., Jorgensen, J. H., Landry, M. L., Pfaller, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Susceptibility+Test+Methods:+Mycobacteria,+Nocardia,+and+Other+Actinomycetes.">Susceptibility Test Methods: Mycobacteria, Nocardia, and Other Actinomycetes.</a> Manual of Clinical Microbiology. , 1223-1247 (2007).</li><li>Bergmann, J. S., Woods, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+ESP+Culture+System+II+for+Testing+Susceptibilities+of+Mycobacterium+tuberculosis+Isolates+to+Four+Primary+Antituberculosis+Drugs.">Evaluation of the ESP Culture System II for Testing Susceptibilities of Mycobacterium tuberculosis Isolates to Four Primary Antituberculosis Drugs.</a> J Clin Microbiol. 36, 2940-2943 (1998).</li></ol>

開示することは何もありません。

プラス成長のコントロールを持つASTのマイクロタイタープレートの例を図1に示されており、各薬剤のエンドポイントのMIC（μg/ ​​mlの）が円で囲まれている。当研究室で行われた研究では、ASTマイクロタイタープレート法は、 結核菌の感受性試験のためのゴールドスタンダード寒天比例の方式と同等であることが示された。 ASTマイクロタイタープレートと寒天の割合の方法14時と21日間の最終的な解釈と伝統的な寒天の割合の方式と比較した場合、結果の迅速な報告がマイクロタイターASTマイクロタイタープレートで得られた、respectively.The ASTマイクロタイタープレートは、最初のテストの利点を有しており、耐性菌との過度の遅延を防ぐことができます同時にセカンドラインの薬剤。 ASTマイクロタイタープレートには、APMよりもセットアップや読みする方がはるかに簡単ですし、そのようなVIZION、手動ミラーと半自動化システムの両方は、プレートを読み取るために使用することができます。結核の薬剤耐性検査のMIC値の可用性は、特に&quot;ボーダーライン&quot;感受性とのそれらの分離株については、従来の臨界濃度の値に対する相対医師に有益な新しい情報を提供することがあります。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> ASTマイクロタイタープレートと接着剤シール</td><td> TREK診断、オハイオ州クリーブランド</td><td> MYCOTB </td></tr><tr><td>マクファーランド0.5標準</td><td> TREK診断、クリーブランド、オハイオ州</td><td> E1041 </td></tr><tr><td>ミドルブルック7H10プレート</td><td>フィッシャー</td><td></td></tr><tr><td>血液寒天プレート</td><td>フィッシャー</td><td></td></tr><tr><td>滅菌は、1μLループします</td><td>フィッシャー</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ループは10μL </td><td>フィッシャー</td><td></td></tr><tr><td> Sensititre生理食塩水 - ツイーンガラスビーズスープ</td><td> TREK診断、クリーブランド、オハイオ州</td><td> 27143 </td></tr><tr><td> 7H9 OADCスープ</td><td> TREK診断、クリーブランド、オハイオ州</td><td> T3440 </td></tr><tr><td>ロングピペットチップ</td><td>フィッシャー</td><td></td></tr><tr><td>無菌トラフ</td><td> TREK診断、クリーブランド、オハイオ州</td><td></td></tr><tr><td> 結核菌 </td><td> ATCC </td><td> 27294 </td></tr><tr><td> Pipeters：1000、200、20μL </td><td>フィッシャー</td><td></td></tr><tr><td>ヒント1000、20、20μL </td><td>フィッシャー</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペッター</td><td>フィッシャー</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター5〜10％のCO 2 </td><td>フィッシャー</td><td></td></tr><tr><td>ビニール袋、小型の、CO 2透過性</td><td>ポリプラスチック、デラノ、PA </td><td></td></tr><tr><td> TBの消毒剤（このようなProSpray C - 60など） </td><td> Certolインターナショナル、コマースシティ、CO </td><td> PSC60/32 </td></tr><tr><td>ミラーボックスリーダー</td><td>フィッシャー</td><td></td></tr></tbody></table>

antimicrobial susceptibility testing of mycobacterium tuberculosis complex for first and second line drugs by broth dilution in a microtiter plate format

抗菌剤耐性の迅速な検出は、耐性結核菌（MTB）の増加を制御するための努力に重要です。マウンテンバイクの抗菌薬感受性試験（AST）は伝統的に比率の寒天法によるか、または/バクテック（Becton Dickinson社、スパークス、MD）、VersaTREK（TREK診断、クリーブランド、オハイオ州）またはバクテなどの機器上でmacrobroth試験によって行われているALERT（ビオメリュー、ヘーゼルウッド、ミズーリ）。と考えながら、寒天の割合の方法は、ASTの&quot;ゴールド&quot;スタンダードは、労働集約的であり、薬物のない寒天と比較して薬物含有寒天培地上にコロニー数を実行することで抵抗の計算が必要になります。薬剤を含まない培地と比較して薬物含有培地上≥1％の成長率がある場合は、生物は、その薬剤に耐性と考えられている。 macrobrothメソッドは、最初の行の薬（イソニアジド、エタンブトール、リファンピン、およびピラジナミド）のインスツルメンテーションとテストのブレークポイント（&quot;クリティカル&quot;）の薬物濃度が必要です。ここで説明する方法では、96ウェルマイクロタイタープレートフォーマットで[MYCOTB（TREKの診断）]市販されており、最初の（イソニアジド、リファンピン、エタンブトール）およびセカンドライン治療薬（アミカシン、両方を含む結核の治療に使用される12抗菌剤の濃度を増加含まれていますサイクロセリン、エチオナミド、カナマイシン、モキシフロキサシン、オフロキサシン、パラアミノサリチル酸、リファブチン、およびストレプトマイシン）。ピラジナミド、最初の行の薬は、酸性試験条件の必要性に起因するマイクロタイタープレートに含まれていません。マイクロシステムの利点は、従来の寒天の割合（21日）と比較して前後の設定と高速ターン（14日）の使いやすさの両方が含まれています。さらに、プレートはブロスまたは固形培地のいずれを用いて調製した接種材料から設定することができます。マイクロタイタープレートフォーマットが新しくなるとマウンテンバイクが研究室で独自の安全性の課題を提示するので、このプロトコルは安全に設定する方法を説明するので、インキュベートし、マイクロタイタープレートをお読みください。

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Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

結核菌の抗菌薬感受性試験は厳しいが、患者のケアのための非常に重要です。このマイクロタイタープレートフォーマットは、12抗マイコバクテリア薬のテストを提供し、適切な治療に役立つだろう最小発育阻止濃度（MIC）値を、提供します。

マイクロタイタープレート形式で液体希釈法により、第一、第二ラインの薬のための結核菌の複合体の抗菌薬感受性試験

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

antimicrobial-susceptibility-testing-mycobacterium-tuberculosis

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

38.0K ビュー.  Mayo Clinic. 結核菌の抗菌薬感受性試験は厳しいが、患者のケアのための非常に重要です。このマイクロタイタープレートフォーマットは、12抗マイコバクテリア薬のテストを提供し、適切な治療に役立つだろう最小発育阻止濃度（MIC）値を、提供します。

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A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third most common infection in US hospitals. Different manifestations of candidiasis are associated with biofilm formation, both on host tissues and/or medical devices (i.e. catheters). Biofilm formation carries negative clinical implications, as cells within the biofilms are protected from host immune responses and from the action of antifungals. We have developed a simple, fast and robust in vitro model for the formation of C. albicans biofilms using 96 well microtiter-plates, which can also be used for biofilm antifungal susceptibility testing. The readout of this assay is colorimetric, based on the reduction of XTT (a tetrazolium salt) by metabolically active fungal biofilm cells. A typical experiment takes approximately 24 h for biofilm formation, with an additional 24 h for antifungal susceptibility testing. Because of its simplicity and the use of commonly available laboratory materials and equipment, this technique democratizes biofilm research and represents an important step towards the standardization of antifungal susceptibility testing of fungal biofilms.

A 96 Well Microtiter Plate-based Method for Monitoring Formation and Antifungal Susceptibility Testing of Candida albicans Biofilms

We describe a simple, rapid and robust method for the formation of Candida albicans biofilms using 96 well microtiter plates and its utility in antifungal susceptibility testing of cells within biofilms.

監視形成との抗真菌薬感受性試験のための96ウェルマイクロタイタープレートベースの方法カンジダアルビカンスバイオフィルム

Candida albicans remains the most frequent cause of fungal infections in an expanding population of compromised patients and candidiasis is now the third ...

免疫・感染学

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

のサンプル調製<em&gt;結核菌</em核磁気共鳴代謝研究のための&gt;抽出

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

の成長結核バイオフィルム

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

多剤耐性を実証<em&gt;結核菌</em&gt;増幅マイクロアレイ

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

Preparation of a Blood Culture Pellet for Rapid Bacterial Identification and Antibiotic Susceptibility Testing

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a rapid identification of the infectious agent to guide optimal antibiotic treatment. The analysis of Gram stains from positive blood culture can be rapidly conducted and already significantly impact the antibiotic regimen. However, the accurate identification of the infectious agent is still required to establish the optimal targeted treatment. We present here a simple and fast bacterial pellet preparation from a positive blood culture that can be used as a sample for several essential downstream applications such as identification by MALDI-TOF MS, antibiotic susceptibility testing (AST) by disc diffusion assay or automated AST systems and by automated PCR-based diagnostic testing. The performance of these different identification and AST systems applied directly on the blood culture bacterial pellets is very similar to the performance normally obtained from isolated colonies grown on agar plates. Compared to conventional approaches, the rapid acquisition of a bacterial pellet significantly reduces the time to report both identification and AST. Thus, following blood culture positivity, identification by MALDI-TOF can be reported within less than 1 hr whereas results of AST by automated AST systems or disc diffusion assays within 8 to 18 hr, respectively. Similarly, the results of a rapid PCR-based assay can be communicated to the clinicians less than 2 hr following the report of a bacteremia. Together, these results demonstrate that the rapid preparation of a blood culture bacterial pellet has a significant impact on the identification and AST turnaround time and thus on the successful outcome of patients suffering from bloodstream infections.

A rapid bacterial pellet preparation from a positive blood culture can be used as a sample for applications such as identification by MALDI-TOF, Gram staining, antibiotic susceptibility testing and PCR-based test. The results can be rapidly communicated to clinicians to improve the outcome of patients suffering from bloodstream infections.

迅速な細菌同定および抗生物質感受性試験のための血液培養ペレットの調製

Bloodstream infections and sepsis are a major cause of morbidity and mortality. The successful outcome of patients suffering from bacteremia depends on a ...

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, which are expressed as minimum inhibitory concentrations (MICs) are used in research for antimicrobial development and monitoring of resistance development and in the clinical setting for antimicrobial therapy guidance. Dalbavancin is a semi-synthetic lipoglycopeptide antimicrobial agent that was approved in May 2014 by the Food and Drug Administration (FDA) for the treatment of acute bacterial skin and skin structure infections caused by Gram-positive organisms. The advantage of dalbavancin over current anti-staphylococcal therapies is its long half-life, which allows for once-weekly dosing. Dalbavancin has activity against Staphylococcus aureus (including both methicillin-susceptible S. aureus [MSSA] and methicillin-resistant S. aureus [MRSA]), coagulase-negative staphylococci, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus anginosus group, &#946;-hemolytic streptococci and vancomycin susceptible enterococci. Similar to other recent lipoglycopeptide agents, optimization of CLSI and ISO broth susceptibility test methods includes the use of dimethyl sulfoxide (DMSO) as a solvent when preparing stock solutions and polysorbate 80 (P80) to alleviate adherence of the agent to plastic. Prior to the clinical studies and during the initial development of dalbavancin, susceptibility studies were not performed with the use of P-80 and MIC results tended to be 2-4 fold higher and similarly higher MIC results were obtained with the agar dilution susceptibility method. Dalbavancin was first included in CLSI broth microdilution methodology tables in 2005 and amended in 2006 to clarify use of DMSO and P-80. The broth microdilution (BMD) procedure shown here is specific to dalbavancin and is in accordance with the CLSI and ISO methods, with step-by-step detail and focus on the critical steps added for clarity.

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

ダルババンシンの参照ブロス微量希釈法<em&gt;インビトロ</em好気的に成長する細菌の&gt;感受性試験

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

上の機能的研究のための3Dヒト肺組織モデル<em&gt;結核菌</em&gt;感染

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

細胞内の標的阻害剤の有効性及び細胞毒性スクリーニングのためのシステム<em&gt;結核菌</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

18FDG PET/CT イメージング勉強結核感染と非ひと霊長類における治療のためのツールとしての解析

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

レポーター酵素蛍光を用いたマウスにおける結核菌をイメージング

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...