手動チェッカーボードアレイの相乗効果テストは、手間がかかり、エラーが発生しやすい方法です。これに対し、当社の自動インクジェットプリンターベースのチェッカーボード方式は、スピード、精度、およびスループットを劇的に向上させます。自動化されたチェッカーボード法は、相乗的な組み合わせのために多数の薬物をスクリーニングすることを可能にし、タイムキル法はこれらの組み合わせの活性をさらに確認し、さらに探求することができる。
新しい抗生物質の発見は抵抗性の広がりに追いついていないが、相乗的な組み合わせの調査は、耐性細菌を治療するために既存の薬物を救う可能性を提供する。抗菌剤でこの技術を実証していますが、他のクラスの抗菌剤や異なる種類の併用薬や化合物検査にも使用できます。このビデオでは、自動チェッカーボード配列方式と手動の時間キル方式を示します。
まず、有望な組み合わせを特定するためにチェッカーボードアレイ研究を行い、次にこれらをタイムキル研究でさらに調査することをお勧めします。まず、コリスチンとミノサイクリンの抗菌ストック溶液を作り、付随するテキストプロトコルに記載されているようにストック溶液の品質管理を行います。次に、約1ミリリットルの0.9%塩化ナトリウム、生理食塩水を12ミリメートル/75ミリメートルの丸底ガラス培養チューブに加えます。
一晩の細菌のプレートから1つまたは2つのコロニーを選択し、培養管に入れます。溶液中の細菌を懸濁させるチューブを穏やかに渦液。マクファーランドの読者を使用して細菌の濃度を確認してください。
0.5マクファーランド濁度の読み取りを達成するために、より多くの生理的またはより多くの細菌を追加することによって濃度を調整します。次いで、50ミリリットルの円錐管中のカチオン調整されたミューラー・ヒントンブロスの30ミリリットルに懸濁液の100マイクロリットルを加えて細菌を1〜300に希釈し、5倍の5倍のコロニー形成単位に1ミリリットルの最終的な細胞密度に達する。さて、付随するテキストプロトコルに沿って従って印刷するための抗菌剤を準備する。
プロトコルを保存し、左上の [実行] ボタンをクリックし、[開始] ボタンをクリックします。プレートホルダーに384ウェルプレートをロードし、ロードプレート1シナジープロンプトの下でロードを押します。次に、カセットスロットに T8+カセットを挿入し、T8+カセットのロードプロンプトの下で「ロード」を押します。
プロンプトが表示されたら、カセットの示された貯蔵所に抗生物質ストック溶液を加えます。各ソリューションを追加したら、[塗りつぶし] ボタンを押します。D300 ディスペンサーが適切な量の抗生物質ストックを各ウェルに追加し、[実行完了]ボックスが表示されたら、[閉じる]をクリックしてプレートを取り外し、D300 をオフにします。
次に、以前に調製した細菌懸濁液を滅菌試薬貯留槽に注ぎます。マルチチャンネルピペットを使用して、50マイクロリットルのサスペンションをチェッカーボードアレイ内のすべてのウェルに追加します。その後、空の井戸に細菌なしでカチオン調整されたミューラーヒントンスープの50マイクロリットルを追加します。
これは、メディアの無菌性を確認するネガティブコントロールウェルになります。35°Cの周囲空気インキュベーターで16〜20時間インキュベートします。テストを分析するには、付属のテキスト プロトコルに従ってください。
タイムキルシナジーテストのために、再びテキストプロトコルに記載されているように抗菌ストック溶液を準備する。その後、滅菌生理液中の試験生物の0.5マクファーランド懸濁液を作る。0.5マクファーランド懸濁液の100マイクロリットルを、ステンレススチールクロージャー付きの25/150ミリメートルガラス丸底培養チューブのCAMHBの5ミリリットルに加え、渦をそっと混ぜます。
滅菌接種ループを使用して、希釈された懸濁液の滴を血液寒天プレートに引き落とし、周囲の空気で35°Cでプレートをインキュベートして接種純度を確認する。チューブの閉鎖を交換し、対数相成長に達するまで、少なくとも3時間は周囲の空気で摂氏35度のシェーカーの試験管ラックにインキュベートします。最初の培養がインキュベートされている間に、5つのオートクレーブガラス培養チューブにカチオン調整されたミューラーヒントンスープを10ミリリットル加えます。
タイムキルシナジー研究の場合、少なくとも1つの薬物は、成長曲線に個別に影響を与えない濃度にする必要があります。これは、シナジー研究の前に個々の薬物濃度の影響を評価することによって決定することができる。最初のチューブに、1ミリグラム/ミリリットルコリスチンストックの10マイクロリットルを加えて、1ミリリットル当たり1マイクログラムの最終的なコリスチン濃度を得る。
2つ目のチューブでは、1ミリグラム1ミリリットルのミノサイクリンストックを10マイクロリットル加え、1ミリリットル当たり1マイクログラムの最終濃度を得る。この濃度は、この例で使用されている株に対しても効果がありません。3番目のチューブに、1ミリグラム/ミリリットルミノサイクリンストックの10マイクロリットルと1ミリリットル/ミリリットルコリスチンストックの10マイクロリットルを追加します。
これは、チューブ1と2で使用されるコリスチンとミノサイクリンの同じ量です。4本目と5本目のチューブに抗生物質を加えずに。これは、それぞれ成長制御と負のコントロールチューブになります。
次に、列1~4列の行BからHに900マイクロリットルの無菌生理食塩水をマルチチャンネルピペットで加えることで、シリアル希釈用の2ミリリットルのウェルを備えた96個のディープウェルポリプロピレンプレートを調製します。培養が対数成長期にある場合は、シェーカーから培養管を取り出し、それを穏やかに渦液にします。1ミリリットルの懸濁液を12〜75ミリメートルのガラス培養チューブに移し、マクファーランドのリーダーで密度を確認します。
密度が1.0マクファーランド未満の場合は、チューブをシェーカーに戻し、より長くインキュベートします。1.0 マクファーランドより大きい場合は、カチオン調整されたミューラーヒントンスープをチューブに追加し、渦をそっとボルテックスし、サスペンションが1.0マクファーランドになるまで再サンプリングします。開始接種を準備する際に、文化が対数成長段階にあることが重要です。
成長曲線を構築して、生物がこの段階に達した時期を決定できます。その後、1.0マクファーランドサスペンションの100マイクロリットルをチューブ1から4に加え、穏やかに渦を出します。混合直後、2時間、4時間、6時間、24時間で、各培養管から150マイクロリットルのアリコートを取り除き、無菌ピペットチップだけがチューブに入り、アリコート引き出し中に無菌ピペットシャフトが入るようにします。
アリコートを、それぞれ、前に準備した96深層プレートの最初の列の連続したウェルに追加する。各時点でアリコートを取り除いた直後に、35°Cのアンビエントエアインキュベーターでシェーカーの試験管ラックにチューブを戻します。マルチチャンネルピペットを使用して、プレートの行Aから100マイクロリットルを取り出し、900マイクロリットルの生理食塩水を含む行Bに追加し、1対10希釈を作成します。
溶液を上下に4〜5回ピペットして混ぜ、その後、チップを捨てます。まず、メッキする抗生物質条件と希釈液を持つミューラー・ヒントン寒天プレートにラベルを付けます。次に、ドロッププレート法を使用してコロニーカウント用希釈サンプルをプレートし、超長いチップを備えたマルチチャンネルピペットを使用します。
1列目の各ウェルから10マイクロリットルを取り出し、適切にラベル付けされたプレートに慎重に一列に塗布します。すべての行がプレートに分配されるまで続けます。さらに、24時間のタイムポイントで、負のコントロールチューブから直接取り出した10マイクロリットルのドロップを、無菌性をテストするために専用のスポットに配置します。
その後、すべてのプレートを反転し、周囲の空気中で摂氏35度で一晩インキュベートします。次に、各領域のコロニー数をカウントし、細胞密度を計算する。二重カウントや欠落したコロニーを避けるために、プレートの逆に細かい先端の永久マーカーでコロニーをマークします。
各希釈系列について、3〜30コロニーの滴を特定する。これらの滴にコロニーを数え、希釈係数と共にカウントを記録します。ここに示されているのは、1ミリリットル当たり0〜32マイクログラムの濃度のミノサイクリンを1ミリリットル当たり0〜16マイクログラムの濃度でコリスチンと組み合わせ、大腸菌株に対して試験したチェッカーボードアレイシナジー実験のグリッドです。
07 未満の OD600 値を持つウェルは成長を表さないので、赤くシェーディングされ、OD600 値が 07 以上の井戸は成長を表し、緑でシェーディングされます。各薬剤について、最小阻害濃度は細菌の増殖を阻害する薬物の最低濃度である。ミノサイクリンの場合、これは1ミリリットル当たり32マイクログラムであり、コリスチンの場合は1ミリリットル当たり8マイクログラムである。
ここではシェーディングは保持されますが、成長が阻害されるウェル内の値は、分数抑制濃度(FIC)のインデックス値に置き換えられます。各井戸では、各薬物のFIC指数は、その中の抗生物質の濃度を薬物の最小阻害濃度で除くことによって計算される。FIC指数が0.5以下のウェルは、シナジーのカットオフと見なされ、破線の境界線で示され、最も低いFIC指数を持つ井戸は太字で示されます。
最小FIC値は相乗的範囲にあるため、この組み合わせは相乗的であると考えられる。成長が阻害される最小FIC指数が1であり、0.5を超える場合として、相乗効果を発揮しない場合の例を示します。最後に、この例では、いくつかのスキップされた井戸が発生し、これは、抗生物質の濃度が高い隣接する井戸に細菌増殖が存在するにもかかわらず、阻害される細菌の増殖を表す。
チェッカーボード配列で複数のスキップがうまく発生した場合、結果は破棄され、アッセイは繰り返されます。タイムキル相乗計アッセイの結果を示すグラフの例をここに示す。タイムキルシナジーアッセイの解釈の詳細については、付随するテキストプロトコルを参照してください。
相乗的な組み合わせの活性に関するさらなる情報は、薬物動態および薬力学の評価および動物モデルとのインビボ研究を通じて得ることができる。細菌を扱う場合は、個人保護具の使用を含め、常に適切な安全手順に従ってください。エアロゾルを生成したり、危険度の高い病原体を使用する場合は、バイオセーフティキャビネットですべての作業を行います。
