この作品は、ウェルカムトラストからベアテKampmann（056608、GRO77273）への個人的な奨学金によって賄われていた。

1。 BCG ルクスレポーターマイコバクテリア株の調製<ol><li> BCGを育てるルクスミドル7H9ブロス0.2％グリセロール、0.05％ツイーン80および10％のADCの濃縮を含むで中期対数期に200rpmで振盪しながら（シャトルプラスミドpSMT1で形質転換されたM.ボビス BCGモントリオール株）。 </li><li>重複のルミノメーターチューブに滅菌PBSでBCG ルクス文化（900μlPBS +100μlのBCG ルクス文化）の1:10希釈液1mlの準備。 </li><li>マシンの後ろにN -デシルアルデヒド（ルシフェラーゼ酵素の基質）を含むチューブをロードして蓋を所定位置に固定し、チューブをされていることを確認します。 </li><li>ルミノメーターに配置された3空のプライミング管のそれぞれに100 UCL × 3を注入するように設定プライムプログラム、を介して基板との内閣総理ルミノメーターインジェクタ。 </li><li>ルミノメーターに2チューブをロードし、各チューブに基質の100 UCLを注入することで設定されたプログラムを介して測定値を取ると1秒間隔で20秒間お読みください。 </li><li>株価が1 × 10 8 RLU / mlに2 × 10 8 RLU / mlを（これは成長の3〜4日ほどかかります）に達したときは、50ミリリットルファルコンチューブに培養液に滅菌30％グリセロールを等量を加え、穏やかに混合する。 </li><li> -80℃でラベルの付いた2ミリリットルのスクリューキャップ付きマイクロチューブや店舗℃に分注し1.5ミリリットルボリュームを</li></ol> 2。アリコートの株式RLU / CFU相関と内容の決定<ol><li>ベントキャップと200ミリリットルの三角フラスコ〜10％のADCサプリメントでミドル7H9培養液の15ミリリットルを追加。 </li><li> 20％のTweenのハイグロマイシンおよび30μlのの15μlを追加。 </li><li>安全キャビネット内の室温（RT）での冷凍庫と除霜からBCG ルクスのバイアルを取り外します。培地にバイアルの内容を追加し、キャップを締めます。 </li><li> 4日間、37℃で200rpmで振盪しながらインキュベートする。 </li><li>それぞれの日に、CFU決定のためにシリアル10倍希釈して（1:10、1:100、1:1000、1:10,000及び1:100,000）を構成します。 </li><li>並行して同一の希釈を設定し、（ 一部1.2から1.6を参照 ）発光を判断するために複製。 </li><li>ミドル7H11寒天（0.5％グリセロール、10％OADCサプリメント、20％のTweenおよびハイグロマイシンを1 ml 1 mlを含有する液体培地1リットル）の2つの3コンパートメントプレートを準備します。 </li><li>個々の室に均等に液体を分配する別のスプレッダーを用いて各プレートのセグメント上に各希釈液100μl、外板。 </li><li>各パラフィルムでプレート、滅菌したプラスチック製の袋に入れて、オートクレーブテープでシールをシールし、下向きにふたで2週間、37℃でインキュベートする。 </li><li>外装フィルムは、（2-3週間）表示されるまで定期的に検査する。 </li><li>コロニーをカウントするには、インキュベーターとコロニーカウンター上の場所からプレートを取り外します。重複したプレートから各希釈液の平均値を計算する。 </li><li>各希釈に相当するRLUとCFUカウントを使用してRLU / CFU比を計算する。比は3と5 RLU / CFUの間でなければなりません。 </li></ol> 3。全血への接種のためのBCG ルクス文化の調製<ol><li>ベントキャップと200ミリリットルの三角フラスコ〜10％のADCサプリメントでミドル7H9培養液の15ミリリットルを追加。 </li><li> 20％のTweenのハイグロマイシンおよび30μlのの15μlを追加。 </li><li>安全キャビネット内で室温で冷凍庫、デフロストからBCG ルクスのバイアルを取り外します。培地にバイアルの内容を追加し、キャップを締めます。 </li><li> 2〜4日、37℃で200rpmで振盪しながらインキュベートする。 </li><li>重複のルミノメーターチューブに滅菌PBSでBCG ルクス文化（900μlPBS +100μlのBCG ルクス文化）の1:10希釈液1mlの準備。 </li><li>首相優しく渦基板とのルミノメーター（上述）、ルミノメーターに2チューブと負荷と測定値を（上記のように）取る。 </li><li> 7 × 10 6 RLUと同等のものを（これはの単球数を想定し、約1:1の単球に2 × 10約5 CFU / mlの血液とBCGの比の接種材料を与える与えるためにPBSで文化を希釈するために、この測定値を使用血液1ml当たり4 × 10 5〜2 × 10約5球）。 </li></ol> 4。全血の調製<ol><li>防腐剤フリーのヘパリンを含むチューブに静脈血5mlのに3を取る。 </li><li> 50ミリリットルファルコンチューブに血液を移し、グルタミンおよび25mMのHEPES（ 無ペン/連鎖球菌）を含むRPMI 1640の等量で希釈する。 </li><li> 。0hrs 3と96hrs 3必要に応じて、追加のタイムポイントのために追加のチューブを設定：。たびにポイントの滅菌ビジューチューブ（合計で6本に三連で希釈した血液のアリコートを900μl </li><li>の10％ADCサプリメント+50μg/mlハイグロマイシン（BCG ルクス文化に使用したのと同じ培地）とミドルブルックス7H9培地のアリコート900μlの成長のコントロールのために複製。 </li><li>血液の各チューブに希釈BCG ルクス 100μlのを追加し、2成長制御にチューブ。 </li><li>よく混和して、37℃で96時間の時間ポイントとロッキングインキュベーターで彼らの側に2成長コントロールのための3 bijousを配置° C、20回転/分（CO 2は必須ではありません）。 </li></ol> 5。測定ルミネッセンス（0hrと96hrsで） <ol><li> 10分間2000グラムで3 bijousを遠心分離します。 </li><li>注意深く-80フリーズする2ミリリットルのスクリューキャップ付きマイクロチューブにペレットと場所を乱すことなく清の300μl除去° C、その後のサイトカインの分析のため。 </li><li>削除された上清の量を交換する各宝石にPBSの300μlを追加。 </li><li>対応する50ミリリットルファルコンチューブにそれぞれ宝石の内容を吸引し、各試験管に8ミリリットルの蒸留水を加えます。 10分のタイマーを開始します。 NB：これは時間に敏感なステップであり、このインキュベーションは、細胞が最初に水と接触したときから始まり、10分よりも長くてはならない。 </li><li>対応するファルコンチューブに転倒する前に5秒のための蒸留水と渦の2ミリリットルでそれぞれ宝石をすすいでください。 </li><li> 10分間のインキュベーションの終わりに、10分間2000グラムで、ファルコンチューブを遠心してください。 </li><li> Surfaniosの消毒剤にデカントで上澄み。 </li><li>各ペレットとボルテックスにいくつかのガラスビーズを追加。 </li><li>各チューブとボルテックスに滅菌PBSを1mlを追加。 </li><li>ルミノメーター用チューブで、（900μlPBS +100μlのサンプル）をPBSで二重にし、時間ポイント96時間で各サンプルの1:10希釈を行います。成長のコントロールのそれぞれに対して同じ希釈を行う。 </li><li>ルミノメーターに静かにボルテックスチューブと負荷と測定値を（上記のように）取る NB：同じサンプルのトリプリケート間に測定値が互いの15％以内でご使用ください。 </li></ol> 6。代表的な結果： 代謝活性は、冷凍庫のまっすぐいずれかに該当する場合または固定相において最適であるとして全血ルクスアッセイのための対数増殖期の細菌を使用することが重要である、すなわち、前にサンプルを接種して48〜72時間にわたって成長。前の成長は​​変動を避けるために、48時間または72時間のどちらかに一連の実験のための標準化されるべきである。図1は、BCG ルクスの代表的な文化の成長曲線を示しています。定常期に達するまで、倍加時間は約24時間です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig1.jpg" /> 図1。7H9培地とRLUとCFUの相関関係で96時間以上BCG ルクスの代表的な成長曲線。 RLU値は常にCFUと相関するが、単一のCFUに対応するRLUの数は、感染の一貫性のある多重度を保証するために一連の実験を通じて同一の凍結ストックを使用することをお勧めしますそれはなぜである株式、によって変わる場合があります（ MOI）。 表1は、接種の時間（T 0）と96時間で生の日付の例を示しています。成長率は、公式T 96 / T 0を用いて計算されますが、他の時間間隔は、勿論、測定することができます。重要な細胞死が発生するとそれは、、しかし、96時間を超えて文化を使用しないことをお勧めします。 <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/3332/3332table1.jpg" /> 表1。接種（T0）の時と96時間（T96）と3成人のドナーから計算された成長率で生データの例。 あるとHIV感染のない子供の血液中に図2で示したように利用可能な抗原特異的メモリーの応答と多分また好中球数に応じて、成長率は、個人によって異なります。平均して、若い子供たちはツベルクリン反応検査（TST）、成人よりも高い成長率を持っている+ veの個人は、TST - VEの個人よりも低い成長率を持っており、HIV感染患者は、CD4 T細胞集団の欠乏に起因する高い成長率を持っている抗酸菌に対する細胞性免疫応答の重要なメディエーターの一つ。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig2.jpg" /> 図2間ドナーの変動性：基本的なHIV感染の状況に応じて患者を、一組のためのT 0に対する96時間の成長率。 一定期間における成長率の再現性は64のドナー12ヶ月の期間にわたって、単一ドナーの制御実験のために繰り返し出血から二回採血から結果をまとめたものを図3に示されています。変動の潜在的な原因は、多くのバイオアッセイで観察されたホストのサイトカインのレベルの範囲内でマイコバクテリア感作または変動性の変化である可能性があります。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig3.jpg" /> 図3。 12ヶ月で12の場面で（a）シングルドナー。12メートル以上に2回上に（B）複数（64）ドナーonths。

<ol>
	<li>Cheng, S. H., Walker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+increased+anti-mycobacterial+activity+in+peripheral+blood+monocytes+after+BCG+vaccination+in+British+school+children.">Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children.</a> Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).</li><li>Cheng, S. H., Walker, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+antimycobacterial+activity+before+and+after+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+in+Chingleput,+India,+and+London,+United+Kingdom.">Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom.</a> Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).</li><li>Silver, R. F., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+human+monocytes:+virulence+correlates+with+intracellular+growth+and+induction+of+tumor+necrosis+factor+alpha+but+not+with+evasion+of+lymphocyte-dependent+monocyte+effector+functions.">Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions.</a> Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).</li><li>Hoft, D. F., Worku, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+relationships+between+immune-mediated+inhibition+of+mycobacterial+growth+and+other+potential+surrogate+markers+of+protective+Mycobacterium+tuberculosis+immunity.">Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity.</a> J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).</li><li>Worku, S., Hoft, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+control+and+antigen-specific+T+cells+on+intracellular+mycobacterial+growth.">Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth.</a> Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).</li><li>Kampmann, B., Gaora, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+human+antimycobacterial+immunity+using+recombinant+reporter+mycobacteria.">Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria.</a> J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).</li><li>Cheon, S. H., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bactericidal+activity+in+whole+blood+as+a+potential+surrogate+marker+of+immunity+after+vaccination+against+tuberculosis.">Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).</li><li>Janulionis, E., Sofer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+activity+of+orally+administered+clofazimine+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis+in+whole-blood+culture.">Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).</li><li>Kampmann, B., Tena, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+human+in+vitro+system+for+evaluating+antimycobacterial+vaccines.">Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines.</a> Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).</li><li>Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+antimycobacterial+immune+responses+in+HIV-infected+children+receiving+HAART.">Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART.</a> Aids. 20, 1011-1018 .</li><li>Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+dose+of+vitamin+D+enhances+immunity+to+mycobacteria.">A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria.</a> Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

結核ワクチン研究の文脈における殺菌アッセイは、それらが潜在的に有望なワクチン候補をスクリーニングするために適用される動物モデル、年に設立されています。免疫原性の読み出しメインとして様々な臓器の機能の細菌負荷の低減。 人間の殺菌アッセイの第一世代はM.に感染し、単独でマクロファージを用いて設計され結核 。 CFUは、3週間の最小時間...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬 </td><td> 会社 </td><td> 猫なし </td></tr><tr><td> BCG ルクス </td><td>様々な</td><td> N / A </td></tr><tr><td>ミドル7H11寒天培地</td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 283810 </td></tr><tr><td>ミドル7H9ブロス</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 271310（500グラム） </td></tr><tr><td>ミドルADCの濃縮</td><td> BDバイオサイエンス</td><td> 212352 </td></tr><tr><td>ミドルOADCサプリメント</td><td>ベクトンディッキンソン</td><td> 212240 </td></tr><tr><td> Tween 80を</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 274364 </td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G5150 </td></tr><tr><td>ハイグロマイシンB </td><td>ロッシュ</td><td> 10843555001（20ミリリットル） </td></tr><tr><td> N -デシルアルデヒド</td><td>シグマ</td><td> D7384 - 100G </td></tr><tr><td>エタノール（&gt; 99.7％） </td><td> VWR </td><td> 101077 </td></tr><tr><td>滅菌PBS </td><td>ハウスで</td><td> N / A </td></tr><tr><td> L -グルタミン、25mMのHEPESを含むRPMI - 1640 </td><td>シグマ</td><td> R0883 </td></tr><tr><td>滅菌蒸留水</td><td>ハウスで</td><td> N / A </td></tr><tr><td colspan="3"> 機器の </td></tr><tr><td>チューブルミノメーター（注射ポート必須） </td><td>ベルトルトAutoLumat LB953またはシングルチューブルミノメーターシリウス</td><td></td></tr><tr><td>ルミノメーター用チューブ、12 × 75ミリメートル、パイレックス縁なしの</td><td> VWRからコーニング</td><td> 99445〜12 </td></tr><tr><td>ベントキャップ付き三角フラスコ、滅菌ポリカーボネート250ミリリットル</td><td>コー​​ニング経由フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 2150329 </td></tr><tr><td> BDバキュテイナ採血管（防腐剤フリーヘパリン） </td><td> BD </td><td> 367676 </td></tr><tr><td> 50ミリリットルファルコンチューブ、円錐形の</td><td> BD </td><td> 352077 </td></tr><tr><td> 7ミリリットルSterilin試料ポリプロピレンビジューチューブ</td><td> VWR </td><td> 99445〜12 </td></tr><tr><td> Sterilinユニバーサル容器（30ml）に</td><td>実験室の分析LTD </td><td> 128C </td></tr><tr><td>ガラスビーズ直径2mm </td><td> SigmaAldrich </td><td> Z143928 </td></tr><tr><td> 10ミリリットルピペットとピペットの少年</td><td>あらゆる</td><td></td></tr><tr><td> 1000μlと200μlのピペットとフィルタのヒント</td><td>あらゆる</td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> 一般的な実験装置： </td></tr><tr><td>クラスII安全キャビネットキャビネット</td><td></td><td></td></tr><tr><td>冷蔵庫（4℃） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心</td><td></td><td></td></tr><tr><td>チューブを混合するロッキングシェーカープラットフォーム（180 0） </td><td></td><td></td></tr><tr><td>オービタルシェーカーインキュベーターは、細菌培養を成長させるため37℃に設定</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged bcg or m.tb (bcg lux/m.tb lux)

機能アッセイは、長い間、特定のワクチンの免疫原性を測定する際に重要な役割を果たしてきました。これは、従来、血清殺菌力価として表されます。幼年期のワクチンへの応答における血清殺菌力価の研究は、防御免疫応答と、カットオフのためにカットオフレベルを開発し、検証するために私たちを有効にしているルーチンを使用しています。そのようなアッセイは、このような結核ワクチンなどのエフェクターT細胞応答の形で主に細胞性免疫を誘導するワクチンのルーチン評価に前方に取られている。動物モデルでは、与えられたワクチン候補のパフォーマンスは、日常的に標準化された殺菌アッセイで評価され、現在のすべての小説TB -ワクチン候補は、1人間の臨床試験を段階的に廃止する前に、彼らの評価では、この工程に供されています。免疫原性とそのため新規抗結核ワクチンの予防効果の可能性の評価は、理想的に殺菌アッセイで測定を含む、現在は人間のモデルに類似した段階的な評価を受けるべきである。 結核ワクチン研究の文脈における殺菌アッセイは、既によく、それらが潜在的に有望なワクチン候補をスクリーニングするために適用される動物モデル、年に設立されています。免疫原性の読み出しメインとして様々な臓器の機能の細菌負荷の低減。しかし、そのようなアッセイは、これまでの新規抗結核ワクチンの臨床試験に組み込まれていません。 ヒトマクロファージ内部のマイコバクテリアの死滅につながる正確なメカニズムについての不確実性が依然としてあるものの、抗酸菌とマクロファージとT細胞の相互作用が明らかに必要です。このホワイトペーパーに記載のアッセイは、それらの相対的な個々の貢献についての仮定を行うことなく、全血中に存在するすべての他の細胞性および体液性因子とそのような重要な細胞成分の研究を可能にする殺菌アッセイの小説世代を表します。私たちのグループによって記述されるアッセイは、全血の少量を使用し、既に結核流行の設定で、大人と子供の研究で用いられている。我々は、BCGワクチンの免疫原性を示すHIV陽性患者におけるマイコバクテリアの成長だけでなく、in vitroでの抗酸菌の生存に対する抗レトロウイルス療法とビタミンDの効果を増加している。ここでは、方法論を要約し、そしてこの比較的単純な、低コストとフィールドフレンドリーなモデルを使用して、私たちの再現性のデータを提示する。 注：定義/略語 BCG ルクス = M.ウシ型 BCG、モントリオールの株は、抗酸菌のGroEL（HSP60）のプロモーターの制御下で、 ビブリオharveyiからluxAB遺伝子を有するシャトルプラスミドpSMT1で形質転換。 CFU =コロニー形成単位（マイコバクテリア生存率の測定）。

Watch this Scientific Journal Video about A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux at JoVE.com

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

我々は、マイコバクテリアの列挙に​​別のアプローチを説明します<em&gt; in vitroで</emコロニー形成単位（CFU）の代わりに抗酸菌タグ付けされたレポーター遺伝子を使用する&gt;、。生物の&quot;生存&quot;だけでなく、宿主応答 - マーカーが結核のコンテキストでのホスト/病原体相互作用の研究のための低コスト、汎用性と機能的なシステムを提供し、同時に測定されています。

BCGまたはM. TB（BCGタグレポーター遺伝子を用いて、抗酸菌の生存率を測定するための機能全血アッセイルクス / M. Tbをルクス）

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

a-functional-whole-blood-assay-to-measure-viability-mycobacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

13.8K ビュー.  Imperial College London. 我々は、マイコバクテリアの列挙に​​別のアプローチを説明します in vitroで、。生物の"生存"だけでなく、宿主応答 - マーカーが結核のコンテキストでのホスト/病原体相互作用の研究のための低コスト、汎用性と機能的なシステムを提供し、同時?...

ビデオ: A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

拡大、精製、及びヒト末梢血NK細胞の機能的評価

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

免疫・感染学

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many advantages for ease and standardization of immunological assessments, but detrimental effects of this process have been observed on some cell subsets, such as granulocytes, B cells, and dendritic cells 1-3. Assaying fresh leukocytes gives a more accurate picture of the in vivo state of the cells, but is often difficult to perform in the context of large clinical trials. Fresh cell assays are dependent upon volunteer commitments and timeframes and, if time-consuming, their application can be impractical due to the working hours required of laboratory personnel. In addition, when trials are conducted at multiple centers, laboratories with the resources and training necessary to perform the assays may not be located in sufficient proximity to clinical sites. To address these issues, we have developed an 11-color antibody staining panel that can be used with Trucount tubes (Becton Dickinson; San Jose, CA) to phenotype and enumerate the major leukocyte populations within the peripheral blood, yielding more robust cell-type specific information than assays such as a complete blood count (CBC) or assays with commercially-available panels designed for Trucount tubes that stain for only a few cell types. The staining procedure is simple, requires only 100 &mu;l of fresh whole blood, and takes approximately 45 minutes, making it feasible for standard blood-processing labs to perform. It is adapted from the BD Trucount tube technical data sheet (<a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">version 8/2010</a>). The staining antibody cocktail can be prepared in advance in bulk at a central assay laboratory and shipped to the site processing labs. Stained tubes can be fixed and frozen for shipment to the central assay laboratory for multicolor flow cytometry analysis. The data generated from this staining panel can be used to track changes in leukocyte concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific cell types of interest. In this report, we demonstrate the procedure used by blood-processing lab technicians to perform staining on fresh whole blood and the steps to analyze these stained samples at a central assay laboratory supporting a multicenter clinical trial. The video details the procedure as it is performed in the context of a clinical trial blood draw in the HIV Vaccine Trials Network (HVTN).

In this report, we demonstrate the staining and analysis steps of a phenotyping assay performed on fresh whole blood to enumerate major innate and adaptive leukocyte populations. We emphasize considerations for performing these procedures in the context of a multicenter clinical trial.

全血の表現型アッセイを用いて多施設臨床試験のための主要な末梢血白血球集団の列挙

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell anemia 1-3. Due to the presence of multitude of antigens on the RBC surface (~308 known antigens 4), patients in the chronic blood transfusion therapy develop alloantibodies due to the miss match of minor antigens on transfused RBCs 4, 5. Grafting of hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) and hyperbranched polyglycerol (HPG) forms an exclusion layer on RBC membrane that prevents the interaction of antibodies with surface antigens without affecting the passage of small molecules such as oxygen ,glucose, and ions3. At present no method is available for the generation of universal red blood donor cells in part because of the daunting challenge presented by the presence of large number of antigens (protein and carbohydrate based) on the RBC surface and the development of such methods will significantly improve transfusion safety, and dramatically improve the availability and use of RBCs. In this report, the experiments that are used to develop antigen protected functional RBCs by the membrane grafting of HPG and their characterization are presented. HPGs are highly biocompatible compact polymers 6, 7, and are expected to be located within the cell glycocalyx that surrounds the lipid membrane 8, 9 and mask RBC surface antigens10, 11.

The cell membrane modification of red blood cells (RBCs) with hyperbranched polyglycerol (HPG) is presented. Modified RBCs were characterized by aqueous two phase partitioning, osmotic fragility and complement mediated lysis. The camouflage of surface proteins and antigens was evaluated using the flow cytometry and Micro Typing System (MTS) blood phenotyping cards.

抗原は、コンパクトな多分岐ポリグリセロールのグラフト膜によって機能赤血球を保護

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

定性的にオーバーレイアッセイを使用すると、肺炎球菌バクテリオシンに対する細菌の産生と感度を測定します

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

シンプルなフローサイトメトリー法は、全血における単球亜集団のためのグルコース取り込みおよびグルコーストランスポーターの発現を測定するために

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

防御効力および肺免疫応答は、マウスに皮下および鼻腔内BCG投与後の

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

Fcγ受容体媒介食作用を評価するために、単球単層アッセイの使用

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for protection against children&#39;s severe TB meningitis and some forms of disseminated TB, but fails to protect against pulmonary TB, which is the most prevalent form of the disease. Promising strategies to improve BCG currently rely either on its transformation with genes encoding immunodominant M. tuberculosis (Mtb)-specific antigens and/or complementation with genes encoding co-factors that would stimulate antigen presenting cells. Major limitations to these approaches include low efficiency, low stability, and the uncertain level of safety of expression vectors. In this study, we present an alternative approach to vaccine improvement, which consists of BCG complementation with exogenous proteins of interest on the surface of bacteria, rather than transformation with plasmids encoding corresponding genes. First, proteins of interest are expressed in fusion with monomeric avidin in standard E. coli expression systems and then used to decorate the surface of biotinylated BCG. Animal experiments using BCG surface decorated with surrogate ovalbumin antigen demonstrate that the modified bacterium is fully immunogenic and capable of inducing specific T cell responses. Altogether, the data presented here strongly support a novel and efficient method for reshaping the current BCG vaccine that replaces the laborious conventional approach of complementation with exogenous nucleic acids.

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

A novel technique for rapid antigen display on a bacterial surface is presented, which involves surface biotinylation followed by exposure to proteins of interest in fusion with monomeric avidin. Loading BCG with selected antigens successfully improves its immunogenicity, suggesting that surface decoration can replace traditional genetic approaches.

アビジン-ビオチン システムと非遺伝の表面装飾を介してウシ結核BCG ワクチンの外因性抗原の発現

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

ワクチン接種後のモルモット モデル メジャー T 細胞反応に最適化されたインターフェロン-γ しなさいアッセイ

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...