עבודה זו מומנה על ידי מענקי מחקר אישיים של קרן Wellcome כדי ביאטה Kampmann (056,608, GRO77273).

1. הכנת מלאי לוקס כתב BCG mycobacteria <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול BCG לוקס (M. בוביס BCG זן מונטריאול הפך עם pSMT1 המעבורת פלסמיד) עם רעד בכל 200rpm לשלב אמצע לוגריתמי ב מידלברוק 7H9 מרק המכיל גליצרול 0.2%, 0.05% tween 80 ו - 10% העשרה ADC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1ml של דילול 1:10 התרבות לוקס BCG ב PBS סטרילי בתוך שפופרת luminometer (900μl PBS + 100μl תרבות BCG לוקס) בשני עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טעינת שפופרת המכילה N-decyl אלדהיד (המצע האנזים בלוציפראז) על חלקו האחורי של המכשיר ולוודא את המכסה מאובטח וצינורות במקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש luminometer מזרק עם המצע באמצעות תוכנית הממשלה, קבע להזרים 100 UCL x 3 לתוך כל אחד 3 שפופרות ריק תחול להציב luminometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את 2 צינורות לתוך luminometer ולקחת קריאות באמצעות תוכנית להגדיר הזרקת 100 UCL של המצע לתוך הצינור כל ולקרוא במשך 20 שניות במרווחים של 1 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר המניה הגיעה 1x10 8 RLU / ml כדי 2x10 8 RLU / מ&quot;ל (זה לוקח בערך 3-4 ימים של צמיחה), מוסיפים נפח שווה של גליצרול 30% סטרילי לתרבות בצינור בז 50 מ&quot;ל לערבב בעדינות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 1.5ml לתוך microtube כרכים שכותרתו בורג מכסה חנות 2ml ובבית -80 ° C. </li></ol> 2. קביעת RLU / CFU מניות קורלציה תוכן aliquots <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 מ&quot;ל של מדיום תרבות 7H9 מידלברוק עם תוספת ADC 10% בבקבוק 200 מ&quot;ל Erlenmeyer עם כובע פרקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15μl של hygromycin ו 30μl Tween של 20%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בקבוקון של BCG לוקס מהמקפיא להפשיר בטמפרטורת החדר (RT) בקבינט בטיחות. מוסיפים את תכולת הבקבוקון למדיום והדק את המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם רעד בכל 200rpm על 37 מעלות צלזיוס למשך 4 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום אחד, להמציא סדרתי של פי 10 דילולים (1:10, 1:100, 1:1000, 1:10,000 ו - 1:100,000) להגדרה CFU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת דילולים אותו במקביל כפולות, כדי לקבוע הארה (ראה חלק 1.2-1.6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין שתי 3-תא צלחות אגר 7H11 מידלברוק (1 l של המדיום נוזל המכיל גליצרול 0.5%, תוספת OADC 10%, 1 מ&quot;ל של Tween 20% ו - 1 מ&quot;ל של hygromycin). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת החוצה 100μl של דילול על כל קטע של כל צלחת באמצעות מפיצי נפרדים, הפצת נוזלי שווה על פני החדר בודדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותם כל צלחת עם parafilm, מקום בתוך שקית פלסטיק סטרילית, חותם עם הקלטת החיטוי, ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שבועות עם מכסים כלפי מטה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק בקביעות עד CFUs להופיע (2-3 שבועות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לספור מושבות, להסיר את הצלחות מן החממה מקום על הדלפק מושבה. חשבו את הממוצע של דילול כל מהצלחות כפולים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב יחס RLU / CFU באמצעות RLU המקבילה וספירת CFU עבור כל דילול. היחס צריך להיות בין 3 ל 5 RLU / CFU. </li></ol> 3. הכנת תרבות לוקס חיסון BCG עבור לדם שלם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 מ&quot;ל של מדיום תרבות 7H9 מידלברוק עם תוספת ADC 10% בבקבוק 200 מ&quot;ל Erlenmeyer עם כובע פרקו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15μl של hygromycin ו 30μl Tween של 20%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר בקבוקון של BCG לוקס מהמקפיא להפשיר ב RT בארון בטיחות. מוסיפים את תכולת הבקבוקון למדיום והדק את המכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה עם רעד בכל 200rpm על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 עד 4 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 1ml של דילול 1:10 התרבות לוקס BCG ב PBS סטרילי בתוך שפופרת luminometer (900μl PBS + 100μl תרבות BCG לוקס) בשני עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Luminometer ראש עם המצע (כמתואר לעיל), מערבולת בעדינות את 2 צינורות לטעון לתוך luminometer ולקחת קריאות (כמתואר לעיל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש קריאה לדלל את התרבות PBS לתת שווה ערך של 6 RLU 7x10 (זה ייתן inoculum דם על 2x10 CFU / 5 מ&quot;ל ו - יחס של BCG על מונוציטים כ 01:01, בהנחה של ספירת מונוציטים כ - 5 עד 2x10 4x10 5 מונוציטים לכל מ&quot;ל דם). </li></ol> 4. הכנה של דם מלא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח 3 עד 5 מ&quot;ל של דם ורידי בתוך שפופרת המכילה הפרין ללא חומר משמר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הדם אל צינור בז 50 מ&quot;ל ו לדלל עם נפח שווה של RPMI 1640 המכיל HEPES גלוטמין ו 25mm (לא עט / סטרפטוקוקוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot 900μl דם מדולל בשלושה עותקים תוך סטרילי צינורות תכשיט לכל נקודת זמן (6 צינורות סה&quot;כ: 3. עבור 0hrs ו -3 עבור 96hrs הגדרת צינורות נוספים timepoints נוספות, במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 900μl Aliquot של המדיום תרבות Middlebrooks 7H9 עם 10% + תוספת ADC 50μg/ml hygromycin (המדיום זהה בשימוש לתרבות לוקס BCG) בשני עותקים עבור פקדי צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 100μl של BCG בדילול לוקס אל צינור אחד של דם, כדי לשלוט על 2 הצמיחהצינורות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים היטב את המקום 3 bijous עבור 96hr זמן נקודות ו 2 שולטת צמיחה בצד שלהם בחממה נדנדה ב 37 ° C, 20 rev / min (CO 2 לא חובה). </li></ol> 5. מדידת הארה (ב 0hr ו 96hrs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 3 bijous ב 2000g במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות 300μl של supernatant מבלי להפריע גלולה ומניחים בורג מכסה microtubes 2ml להקפיא ב -80 ° C לניתוח ציטוקינים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 300μl של PBS על כל תכשיט להחליף את נפח supernatant הוסרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את תוכנו של כל תכשיט לתוך הצינור המקביל בז 50 מ&quot;ל ולהוסיף מים מזוקקים 8ml על צינור אחד. בגין טיימר 10 דקות. הערה: זהו צעד זמן רגיש, הדגירה זה לא חייב להיות כל דקות יותר מ 10, החל כאשר התאים הראשונים לבוא במגע עם מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את כל תכשיט עם 2ml מערבולת של מים מזוקקים למשך 5 שניות לפני מפנה לתוך הצינור בז המקביל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הדגירה של 10 דקות, צנטריפוגה צינורות בז ב 2000g במשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג לתוך supernatant חיטוי Surfanios. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת חרוזי זכוכית מעטים כל גלולה ו מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1ml של PBS סטרילי כדי צינור כל מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב צינורות luminometer, לעשות דילולים 1:10 למדגם כל כפולות עם (מדגם + 900μl PBS 100μl) PBS ובבית 96hr נקודת זמן. הפוך את דילולים זהה עבור כל אחד שולט צמיחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת בעדינות את הצינורות לטעון לתוך luminometer ולקחת קריאות (כמתואר לעיל) הערה: הקריאות בין triplicates מדגם זהה צריך להיות בתוך 15% של אחד אחר. </li></ol> 6. נציג התוצאות: חשוב להשתמש בחיידקים בשלב לוגריתמי של צמיחה עבור מבחני לוקס כולו דם, גדל כלומר מעל 48-72 שעות לפני inoculating דגימות, כמו הפעילות המטבולית הוא הכי מוצלח, אם את או ישר מהמקפיא או בשלב נייח. הגידול לפני צריכה להיות סטנדרטית עבור סדרה של ניסויים כדי או 48 או 72 שעות כדי למנוע השתנות. איור 1 מציג את עקומת הגידול של התרבות נציג BCG לוקס. זמן ההכפלה הוא כ 24 שעות עד השלב נייח הוא הגיע. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig1.jpg" /> 1. איור נציג צמיחה עקומה של BCG לוקס מעל 96 שעות בינוני 7H9 ואת המתאם של RLU ו CFU. למרות הערכים RLU תמיד לתאם עם CFU, מספר RLU המתאים CFU יחיד יכול להשתנות בהתאם למלאי, ולכן הוא מומלץ להשתמש המניות קפוא אותו לאורך סדרה של ניסויים כדי להבטיח ריבוי עקביים של זיהום ( משרד הפנים). טבלה 1 מציגה דוגמא תאריך הגלם בזמן של חיסון (ט 0) ו - ב 96 שעות. יחסי הצמיחה מחושבים באמצעות הנוסחה T 96 / T 0, אך מרווחי הזמן אחרים יכולים כמובן גם להימדד. היא, לעומת זאת, מומלץ לא להשתמש תרבויות מעבר 96 שעות, כמו מוות של תאים משמעותי מתרחש. <img alt="טבלה 1" src="/files/ftp_upload/3332/3332table1.jpg" /> טבלה 1. דוגמא של נתונים גולמיים בזמן של חיסון (T0) ו ב 96 שעות (T96) ויחסים הצמיחה מחושב מ 3 תורמים מבוגר. בהתאם זמין אנטיגן ספציפי לערמונית התגובות זיכרון לספור ואולי גם נויטרופילים, יחס צמיחה להשתנות בין יחידים, כפי שמוצג כאן באיור 2 בדמם של ילדים עם ובלי זיהום HIV. בממוצע, ילדים צעירים יש יחס צמיחה גבוה יותר מאשר מבוגרים, מבחן טוברקולין עור (TST) + אנשים יש להם יחסי צמיחה נמוך מ-TST יש אנשים, ו-HIV-נגועים יש יחס צמיחה גבוה בשל מחסור של האוכלוסייה תא T מסוג CD4, אחד המתווכים העיקריים של התגובה החיסונית התאית mycobacteria. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig2.jpg" /> איור 2 Inter-התורם השתנות:. יחסי צמיחה של T 0 לעומת 96 שעות עבור קבוצה של חולים, בהתאם למצב HIV הבסיסית. שחזור של יחסי צמיחה על פני תקופה של זמן מוצג באיור 3, אשר מסכם את התוצאות של 64 תורמים זוב דם פעמיים במשך תקופה של 12 חודשים מאותו תורם דימם שוב ושוב ניסויים שליטה. סיבות אפשריות של השתנות יכול להיות שינויים רגישות השתנות mycobacterial או בתוך רמות ציטוקינים המארח, כפי שנצפה ב bioassays רבים. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3332/3332fig3.jpg" /> איור 3. (א) תורם יחיד על 12 מקרים במשך 12 חודשים. (ב) מרובות (64) תורמים על 2 מקרים מעל 12 מ &#39;onths.

<ol>
	<li>Cheng, S. H., Walker, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+increased+anti-mycobacterial+activity+in+peripheral+blood+monocytes+after+BCG+vaccination+in+British+school+children.">Demonstration of increased anti-mycobacterial activity in peripheral blood monocytes after BCG vaccination in British school children.</a> Clin Exp Immunol. 74, 20-205 (1988).</li><li>Cheng, S. H., Walker, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+antimycobacterial+activity+before+and+after+Mycobacterium+bovis+BCG+vaccination+in+Chingleput,+India,+and+London,+United+Kingdom.">Monocyte antimycobacterial activity before and after Mycobacterium bovis BCG vaccination in Chingleput, India, and London, United Kingdom.</a> Infect Immun. 61, 4501-4503 (1993).</li><li>Silver, R. F., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+virulence+of+Mycobacterium+tuberculosis+within+human+monocytes:+virulence+correlates+with+intracellular+growth+and+induction+of+tumor+necrosis+factor+alpha+but+not+with+evasion+of+lymphocyte-dependent+monocyte+effector+functions.">Expression of virulence of Mycobacterium tuberculosis within human monocytes: virulence correlates with intracellular growth and induction of tumor necrosis factor alpha but not with evasion of lymphocyte-dependent monocyte effector functions.</a> Infect Immun. 66, 1190-1199 (1998).</li><li>Hoft, D. F., Worku, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+relationships+between+immune-mediated+inhibition+of+mycobacterial+growth+and+other+potential+surrogate+markers+of+protective+Mycobacterium+tuberculosis+immunity.">Investigation of the relationships between immune-mediated inhibition of mycobacterial growth and other potential surrogate markers of protective Mycobacterium tuberculosis immunity.</a> J Infect Dis. 186, 1448-1457 (2002).</li><li>Worku, S., Hoft, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+of+control+and+antigen-specific+T+cells+on+intracellular+mycobacterial+growth.">Differential effects of control and antigen-specific T cells on intracellular mycobacterial growth.</a> Infect Immun. 71, 1763-1773 (2003).</li><li>Kampmann, B., Gaora, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+human+antimycobacterial+immunity+using+recombinant+reporter+mycobacteria.">Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria.</a> J Infect Dis. 182, 895-901 (2000).</li><li>Cheon, S. H., Kampmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bactericidal+activity+in+whole+blood+as+a+potential+surrogate+marker+of+immunity+after+vaccination+against+tuberculosis.">Bactericidal activity in whole blood as a potential surrogate marker of immunity after vaccination against tuberculosis.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9, 901-907 (2002).</li><li>Janulionis, E., Sofer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lack+of+activity+of+orally+administered+clofazimine+against+intracellular+Mycobacterium+tuberculosis+in+whole-blood+culture.">Lack of activity of orally administered clofazimine against intracellular Mycobacterium tuberculosis in whole-blood culture.</a> Antimicrob Agents Chemother. 48, 3133-3135 (2004).</li><li>Kampmann, B., Tena, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+human+in+vitro+system+for+evaluating+antimycobacterial+vaccines.">Novel human in vitro system for evaluating antimycobacterial vaccines.</a> Infect Immun. 72, 6401-6407 (2004).</li><li>Kampmann, B., Tena-Coki, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+antimycobacterial+immune+responses+in+HIV-infected+children+receiving+HAART.">Reconstitution of antimycobacterial immune responses in HIV-infected children receiving HAART.</a> Aids. 20, 1011-1018 .</li><li>Martineau, A. R., Wilkinson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+single+dose+of+vitamin+D+enhances+immunity+to+mycobacteria.">A single dose of vitamin D enhances immunity to mycobacteria.</a> Am J Respir Crit Care Med. 176, 208-213 (2007).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

מבחני bactericidal בהקשר של מחקר החיסון לשחפת מבוססים היטב במודלים של בעלי חיים, שם הם מוחלים על המסך מועמדים החיסון פוטנציאל מבטיח. הפחתת עומס חיידקי בפונקציות איברים שונים כמו הראשי לקריאה מתוך immunogenicity. הדור הראשון של מבחני bactericidal א?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מגיב </td><td> חברה </td><td> חתול לא </td></tr><tr><td> BCG לוקס </td><td> שונים </td><td> n / a </td></tr><tr><td> מידלברוק אגר 7H11 </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 283810 </td></tr><tr><td> מידלברוק 7H9 מרק </td><td> BD Biosciences </td><td> 271,310 (500 גרם) </td></tr><tr><td> מידלברוק העשרה ADC </td><td> BD Biosciences </td><td> 212352 </td></tr><tr><td> מידלברוק תוספת OADC </td><td> בקטון דיקינסון </td><td> 212240 </td></tr><tr><td> Tween 80 </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> 274364 </td></tr><tr><td> גליצרול </td><td> סיגמא אולדריץ </td><td> G5150 </td></tr><tr><td> Hygromycin B </td><td> רוש </td><td> 10843555001 (20ml) </td></tr><tr><td> N-decyl אלדהיד </td><td> סיגמא </td><td> D7384-100 גרם </td></tr><tr><td> אתנול (&gt; 99.7%) </td><td> VWR </td><td> 101077 </td></tr><tr><td> סטרילי PBS </td><td> ב בית </td><td> n / a </td></tr><tr><td> RPMI-1640 עם L-גלוטמין, HEPES 25mm </td><td> סיגמא </td><td> R0883 </td></tr><tr><td> מים מזוקקים מעוקרים </td><td> ב בית </td><td> n / a </td></tr><tr><td colspan="3"> ציוד </td></tr><tr><td> Tube luminometer (נמל בזריקות חובה) </td><td> ברטולד AutoLumat LB953 או יחיד צינור luminometer סיריוס </td><td></td></tr><tr><td> Luminometer צינורות, 12 x 75mm, פיירקס נטולי מסגרת </td><td> קורנינג מ VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> Erlenmeyer צלוחיות עם כובעים פרקו, סטרילי פוליקרבונט 250 מ&quot;ל </td><td> קורנינג באמצעות פישר סיינטיפיק </td><td> 2150329 </td></tr><tr><td> BD אוסף Vacutainer צינורות דם (ללא חומר משמר הפרין) </td><td> BD </td><td> 367676 </td></tr><tr><td> פלקון 50 מ&quot;ל צינורות, חרוטי </td><td> BD </td><td> 352077 </td></tr><tr><td> 7ml Sterilin הדגימה פוליפרופילן תכשיט צינורות </td><td> VWR </td><td> 99445-12 </td></tr><tr><td> Sterilin יוניברסל מכולות (30 מ&quot;ל) </td><td> מעבדת ניתוח בע&quot;מ </td><td> 128C </td></tr><tr><td> חרוזי זכוכית בקוטר 2 מ&quot;מ </td><td> SigmaAldrich </td><td> Z143928 </td></tr><tr><td> 10 מ&quot;ל pipettes והילד פיפטה </td><td> כל </td><td></td></tr><tr><td> 1000μl ו 200μl pipettes וטיפים מסנן </td><td> כל </td><td></td></tr><tr><td colspan="3"> כללי ציוד מעבדה: </td></tr><tr><td> Class II בטיחות ארון ארון </td><td></td><td></td></tr><tr><td> מקרר (4 ° C) </td><td></td><td></td></tr><tr><td> סרכזת </td><td></td><td></td></tr><tr><td> נדנדה שייקר פלטפורמה (180 0) לערבב צינורות </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Orbital שאכר החממה נקבע על 37 מעלות צלזיוס למשך גדל תרבויות חיידקי </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a functional whole blood assay to measure viability of mycobacteria, using reporter-gene tagged bcg or m.tb (bcg lux/m.tb lux)

מבחני פונקציונלית שיחקו זמן רב תפקיד מרכזי מדידה של immunogenicity של החיסון נתון. זה בא לידי ביטוי קונבנציונלית כמו titers bactericidal בסרום. מחקרים titers bactericidal בסרום בתגובה חיסונים בילדות אפשרו לנו לפתח לאמת חתוכים רמות המערכת החיסונית מגן כגון לחתוך-offs נמצאים בשימוש שגרתי. מבחני אין כאלה ננקטו קדימה לתוך הערכה שגרת חיסונים לגרום בעיקר התא בתיווך חסינות בדמות מפעיל התגובות תא T, כגון שחפת חיסונים. במודל חיה, הביצועים של מועמד חיסון נתון מוערך באופן שגרתי מבחני bactericidal סטנדרטית, וכל הנוכחית TB-חיסון מועמדים הרומן היה נתון בשלב זה להערכה שלהם לפני שלב 1 בניסויים בבני אדם. הערכת immunogenicity ולכן הסבירות של יעילות ההגנה של החיסון נגד שחפת רומן רצוי לעבור הערכה דומה צעד חכם של מודלים אנושיים עכשיו, כולל מדידות מבחני bactericidal. מבחני bactericidal בהקשר של מחקר חיסון שחפת כבר מבוססים היטב במודלים של בעלי חיים, שם הם מוחלים על המסך מועמדים החיסון פוטנציאל מבטיח. הפחתת עומס חיידקי בפונקציות איברים שונים כמו הראשי לקריאה מתוך immunogenicity. עם זאת, אין מבחני כאלה שולבו ניסויים קליניים עבור חיסון נגד שחפת הרומן עד כה. אמנם יש עדיין אי ודאות לגבי המנגנונים המדויקים שהובילו להרג של mycobacteria בתוך מקרופאגים אדם, האינטראקציה של מקרופאגים ותאי T עם mycobacteria נדרש בבירור. Assay המתואר במאמר זה מייצג דור חדש של מבחני bactericidal המאפשר מחקרים כאלה רכיבים סלולריים מפתח עם כל הגורמים הסלולר הלחות אחרים הנמצאים בדם שלם מבלי לעשות הנחות על התרומה היחסית הפרט שלהם. Assay שתואר על ידי הקבוצה שלנו משתמשת בנפחים קטנים של דם שלם כבר המועסקים מחקרים על מבוגרים וילדים TB-אנדמיים הגדרות. הראינו immunogenicity של חיסון BCG, גדל צמיחה של mycobacteria ב חולי איידס, כמו גם את ההשפעה של טיפול אנטי retroviral וויטמין D על הישרדות mycobacterial במבחנה. כאן אנחנו מסכמים את המתודולוגיה, ולהציג נתונים reproducibility שלנו באמצעות מודל פשוט יחסית, בעלות נמוכה ושדה ידידותי. הערה: הגדרות / קיצורים BCG לוקס = M. בוביס BCG, זן במונטריאול, הפך עם pSMT1 מעבורת הפלסמיד נושא את הגנים luxAB מ Vibrio harveyi, תחת שליטה של GroEL mycobacterial (hsp60) מקדם. CFU = יחידת יצירת המושבה (מדד הכדאיות mycobacterial).

Watch this Scientific Journal Video about A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux at JoVE.com

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

אנו מתארים גישה חלופית כדי ספירה של mycobacteria<em&gt; במבחנה</em&gt;, אשר משתמשת הכתב, גן מתויג mycobacteria במקום להרכיב המושבה יחידות (CFU). &quot;הישרדות&quot; של אורגניזמים כמו גם לארח בתגובה-סמנים נמדדים בעת ובעונה אחת, מתן בעלות נמוכה, מערכת תכליתי ופונקציונלי ללימודים של המארח / הפתוגן אינטראקציות בהקשר של שחפת.

Assay פונקציונלית הדם כולו כדי למדוד את הכדאיות של mycobacteria, באמצעות הכתב-Gene Tagged BCG או מ Tb (BCG לוקס / מ Tb לוקס)

Functional assays have long played a key role in measuring of immunogenicity of a given vaccine. This is conventionally expressed as serum bactericidal ...

a-functional-whole-blood-assay-to-measure-viability-mycobacteria

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb (BCG lux/M.Tb lux)

13.8K Views.  Imperial College London. אנו מתארים גישה חלופית כדי ספירה של mycobacteria במבחנה, אשר משתמשת הכתב, גן מתויג mycobacteria במקום להרכיב המושבה יחידות (CFU). "הישרדות" של אורגניזמים כמו גם לארח בתגובה-סמנים נמדדים בעת ובעונה אחת, מתן בעלות נמוכה, מערכת תכליתי ופונקציונלי ללימודים של המארח / ה...

Video: A Functional Whole Blood Assay to Measure Viability of Mycobacteria, using Reporter-Gene Tagged BCG or M.Tb BCG lux/M.Tb lux

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

הרחבה, טיהור, והערכה תפקודית של האדם תאים דם היקפיים NK

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many advantages for ease and standardization of immunological assessments, but detrimental effects of this process have been observed on some cell subsets, such as granulocytes, B cells, and dendritic cells 1-3. Assaying fresh leukocytes gives a more accurate picture of the in vivo state of the cells, but is often difficult to perform in the context of large clinical trials. Fresh cell assays are dependent upon volunteer commitments and timeframes and, if time-consuming, their application can be impractical due to the working hours required of laboratory personnel. In addition, when trials are conducted at multiple centers, laboratories with the resources and training necessary to perform the assays may not be located in sufficient proximity to clinical sites. To address these issues, we have developed an 11-color antibody staining panel that can be used with Trucount tubes (Becton Dickinson; San Jose, CA) to phenotype and enumerate the major leukocyte populations within the peripheral blood, yielding more robust cell-type specific information than assays such as a complete blood count (CBC) or assays with commercially-available panels designed for Trucount tubes that stain for only a few cell types. The staining procedure is simple, requires only 100 &mu;l of fresh whole blood, and takes approximately 45 minutes, making it feasible for standard blood-processing labs to perform. It is adapted from the BD Trucount tube technical data sheet (<a href="http://www.bdbiosciences.com/external_files/is/doc/tds/Package_Inserts_CE/live/web_enabled/23-3483-06_PI_Trucount tubes_CE_EN.pdf" target="_blank">version 8/2010</a>). The staining antibody cocktail can be prepared in advance in bulk at a central assay laboratory and shipped to the site processing labs. Stained tubes can be fixed and frozen for shipment to the central assay laboratory for multicolor flow cytometry analysis. The data generated from this staining panel can be used to track changes in leukocyte concentrations over time in relation to intervention and could easily be further developed to assess activation states of specific cell types of interest. In this report, we demonstrate the procedure used by blood-processing lab technicians to perform staining on fresh whole blood and the steps to analyze these stained samples at a central assay laboratory supporting a multicenter clinical trial. The video details the procedure as it is performed in the context of a clinical trial blood draw in the HIV Vaccine Trials Network (HVTN).

In this report, we demonstrate the staining and analysis steps of a phenotyping assay performed on fresh whole blood to enumerate major innate and adaptive leukocyte populations. We emphasize considerations for performing these procedures in the context of a multicenter clinical trial.

ספירה של אוכלוסיות גדולות דם היקפיות יקוציט לניסויי multicenter קליניים באמצעות Assay phenotyping דם מלא

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Antigens Protected Functional Red Blood Cells By The Membrane Grafting Of Compact Hyperbranched Polyglycerols

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell anemia 1-3. Due to the presence of multitude of antigens on the RBC surface (~308 known antigens 4), patients in the chronic blood transfusion therapy develop alloantibodies due to the miss match of minor antigens on transfused RBCs 4, 5. Grafting of hydrophilic polymers such as polyethylene glycol (PEG) and hyperbranched polyglycerol (HPG) forms an exclusion layer on RBC membrane that prevents the interaction of antibodies with surface antigens without affecting the passage of small molecules such as oxygen ,glucose, and ions3. At present no method is available for the generation of universal red blood donor cells in part because of the daunting challenge presented by the presence of large number of antigens (protein and carbohydrate based) on the RBC surface and the development of such methods will significantly improve transfusion safety, and dramatically improve the availability and use of RBCs. In this report, the experiments that are used to develop antigen protected functional RBCs by the membrane grafting of HPG and their characterization are presented. HPGs are highly biocompatible compact polymers 6, 7, and are expected to be located within the cell glycocalyx that surrounds the lipid membrane 8, 9 and mask RBC surface antigens10, 11.

The cell membrane modification of red blood cells (RBCs) with hyperbranched polyglycerol (HPG) is presented. Modified RBCs were characterized by aqueous two phase partitioning, osmotic fragility and complement mediated lysis. The camouflage of surface proteins and antigens was evaluated using the flow cytometry and Micro Typing System (MTS) blood phenotyping cards.

אנטיגנים מוגנים תאי דם אדומים פונקציונליים על ידי ההשתלה של ממברנה Polyglycerols Hyperbranched הקומפקטי

Red blood cell (RBC) transfusion is vital for the treatment of a number of acute and chronic medical problems such as thalassemia major and sickle cell ...

Cell-based Flow Cytometry Assay to Measure Cytotoxic Activity

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells to kill CD4+ T cells loaded with their cognate peptide. Target CD4+ T cells are divided into two populations, labeled with two different concentrations of CFSE. One population is pulsed with the peptide of interest (CFSE-low) while the other remains un-pulsed (CFSE-high). Pulsed and un-pulsed CD4+ T cells are mixed at an equal ratio and incubated with an increasing number of purified CD8+ T cells. The specific killing of autologous target CD4+ T cells is analyzed by flow cytometry after coculture with CD8+ T cells containing the antigen-specific effector CD8+ T cells detected by peptide/MHCI tetramer staining. The specific lysis of target CD4+ T cells measured at different effector versus target ratios, allows for the calculation of lytic units, LU30/106 cells. This simple and straightforward assay allows for the accurate measurement of the intrinsic capacity of CD8+ T cells to kill target CD4+ T cells.

This protocol describes a sensitive, cell-based cytotoxicity assay. By enumerating the decrease in frequency of live target CD4+ T cells in the presence of an increasing number of effector CD8+ T cells, this assay allows for the direct assessment of cytolytic activity of antigen-specific CD8+ T cells.

Cytolytic activity of CD8+ T cells is rarely evaluated. We describe here a new cell-based assay to measure the capacity of antigen-specific CD8+ T cells ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

באמצעות assay הכיסוי למדוד את הייצור בקטריאלי ורגישות לדלקת הריאות Bacteriocins איכותי

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of monocytes induces effector functions and a concomitant shift from oxidative to glycolytic metabolism that is accompanied by increased glucose transporter expression. This increased glycolytic metabolism is also observed for trained immunity of monocytes, a form of innate immunological memory. Although in vitro protocols examining glucose transporter expression and glucose uptake by monocytes have been described, none have been examined by multi-parametric flow cytometry in whole blood. We describe a multi-parametric flow cytometric protocol for the measurement of fluorescent glucose analog 2-NBDG uptake in whole blood by total monocytes and the classical (CD14++CD16-), intermediate (CD14++CD16+) and non-classical (CD14+CD16++) monocyte subpopulations. This method can be used to examine glucose transporter expression and glucose uptake for total monocytes and monocyte subpopulations during homeostasis and inflammatory disease, and can be easily modified to examine glucose uptake for other leukocytes and leukocyte subpopulations within blood.

Monocytes are integral components of the human innate immune system that rely on glycolytic metabolism when activated. We describe a flow cytometry protocol to measure glucose transporter expression and glucose uptake by total monocytes and monocyte subpopulations in fresh whole blood.

Cytometric זרימה פשוט שיטה למדוד ספיגת הגלוקוז ואת ביטוי נשא גלוקוז עבור מונוציטים subpopulations ב דם מלא

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Protective Efficacy and Pulmonary Immune Response Following Subcutaneous and Intranasal BCG Administration in Mice

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data have encouraged pulmonary tuberculosis vaccines as a promising strategy to prevent pulmonary disease, which is responsible for transmission. In this work, we describe the methodology used to demonstrate in the mouse model the benefits of intranasal BCG vaccination when compared to subcutaneous. Our data revealed greater protective efficacy following intranasal BCG administration. In addition, our results indicate that pulmonary vaccination triggers a higher immune response in lungs, including Th1 and Th17 responses, as well as an increase of immunoglobulin A (IgA) concentration in respiratory airways. Our data show correlation between protective efficacy and the presence of IL17-producing cells in lungs post-Mycobacterium tuberculosis challenge, suggesting a role for this cytokine in the protective response conferred by pulmonary vaccination. Finally, we detail the global workflow we have developed to study respiratory vaccination in the mouse model, which could be extrapolated to other tuberculosis vaccines, apart from BCG, targeting the mucosal response or other pulmonary routes of administration such as the intratracheal or aerosol.

We herein detail the methodology followed to compare protective efficacy and lung immune response induced by intranasal and subcutaneous immunization with BCG in mouse model. Our results show the benefits of pulmonary vaccination and suggest a role for IL17-mediated response in vaccine-induced protection.

מגן היעילות ריאתי החיסונית בתגובה תת עורי ואת אפי BCG מינהל עכברים

Despite global coverage of intradermal BCG vaccination, tuberculosis remains one of the most prevalent infectious diseases in the world. Preclinical data ...

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&#947; Receptor-mediated Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly versatile in vitro assay that can be modified to examine different aspects of antibody and Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis in both research and clinical settings. The assay utilizes adherent monocytes from peripheral blood mononuclear cells isolated from mammalian whole blood. MMA has been described for use in both human and murine investigations. These monocytes express Fc&#947;Rs (e.g., Fc&#947;RI, Fc&#947;RIIA, Fc&#947;RIIB, and Fc&#947;RIIIA) that are involved in immune responses. The MMA exploits the mechanism of Fc&#947;R-mediated interactions, phagocytosis in particular, where antibody-sensitized red blood cells (RBCs) adhere to and/or activate Fc&#947;Rs and are subsequently phagocytosed by the monocytes. In vivo, primarily tissue macrophages found in the spleen and liver carry out Fc&#947;R-mediated phagocytosis of antibody-opsonized RBCs, causing extravascular hemolysis. By evaluating the level of phagocytosis using the MMA, different aspects of the in vivo Fc&#947;R-mediated process can be investigated. Some applications of the MMA include predicting the clinical relevance of allo- or autoantibodies in a transfusion setting, assessing candidate drugs that promote or inhibit phagocytosis, and combining the assay with fluorescent microscopy or traditional Western immunoblotting to investigate the downstream signaling effects of Fc&#947;R-engaging drugs or antibodies. Some limitations include the laboriousness of this technique, which takes a full day from start to finish, and the requirement of research ethics approval in order to work with mammalian blood. However, with diligence and adequate training, the MMA results can be obtained within a 24-h turnover time.

Use of a Monocyte Monolayer Assay to Evaluate Fc&amp;#947; Receptor-mediated Phagocytosis

The monocyte monolayer assay (MMA) is an in vitro assay that utilizes isolated primary monocytes obtained from mammalian peripheral whole blood to evaluate Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)-mediated phagocytosis.

שימוש Assay מונוציטים חד שכבתי להערכת Fcγ קולטן בתיווך Phagocytosis

Although originally developed for predicting transfusion outcomes of serologically incompatible blood, the monocyte monolayer assay (MMA) is a highly ...

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for protection against children&#39;s severe TB meningitis and some forms of disseminated TB, but fails to protect against pulmonary TB, which is the most prevalent form of the disease. Promising strategies to improve BCG currently rely either on its transformation with genes encoding immunodominant M. tuberculosis (Mtb)-specific antigens and/or complementation with genes encoding co-factors that would stimulate antigen presenting cells. Major limitations to these approaches include low efficiency, low stability, and the uncertain level of safety of expression vectors. In this study, we present an alternative approach to vaccine improvement, which consists of BCG complementation with exogenous proteins of interest on the surface of bacteria, rather than transformation with plasmids encoding corresponding genes. First, proteins of interest are expressed in fusion with monomeric avidin in standard E. coli expression systems and then used to decorate the surface of biotinylated BCG. Animal experiments using BCG surface decorated with surrogate ovalbumin antigen demonstrate that the modified bacterium is fully immunogenic and capable of inducing specific T cell responses. Altogether, the data presented here strongly support a novel and efficient method for reshaping the current BCG vaccine that replaces the laborious conventional approach of complementation with exogenous nucleic acids.

Expression of Exogenous Antigens in the Mycobacterium bovis BCG Vaccine via Non-genetic Surface Decoration with the Avidin-biotin System

A novel technique for rapid antigen display on a bacterial surface is presented, which involves surface biotinylation followed by exposure to proteins of interest in fusion with monomeric avidin. Loading BCG with selected antigens successfully improves its immunogenicity, suggesting that surface decoration can replace traditional genetic approaches.

ביטוי של אנטיגנים אקסוגני חיסון ה-BCG Mycobacterium חיידקי סטרפטקוקוס בוביס דרך קישוט משטח שאינו גנטי עם מערכת אבידין-ביוטין

Tuberculosis (TB) is a serious infectious disease and the only available vaccine M. bovis bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG) is safe and effective for ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

אופטימיזציה אינטרפרון-גמא ELISpot Assay מידה תגובות תא T במודל שפן לאחר החיסון

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...