我々は感謝して国立科学財団（CHE - 0847145）、と寛大にこの研究を支援するためのヘンリードレフュス教師学者賞プログラムを認めます。我々は、特にクリスティンデイビス、断面像と彼女の援助のためのリッチモンドの大学で生物学教室の顕微鏡とイメージングのディレクターを認識したいと思います。特別な感謝は、博士に与えられます。 T.レオポルド、R.カンテール、D.ケロッグ、R.ミラー、およびW.ケース、ならびに、ラスコリンズ、フィルジョセフ、キャロマークス、マンディマロリーとジョンWimbush - すべての大学で可能な学部生の研究を行うリッチモンドの。ありがとう非常に個人的にはレオポルドリサーチラボ内のすべての現在、過去、そして未来の学部の研究者に与えられます。

1。 Hexanethiolate単層保護された金クラスターの合成 Hexanethiolate官能性単分子膜保護金クラスター（MPCはは）のように、金225（C6）75の平均構造を生成するために金のモル比は2:1 1 -ヘキサンチオール（C6）。ブラスト反応〜4-9特定の変更に従って合成されています配位子の種類、特定のチオールから金の比率、温度、および反応の配信速度、または合成後の治療、9-11、それぞれ、さまざまなコアのサイズと機能的な保護基でのMPCの多様な範囲を得ることができる4。MPCの近似（様々なアルカンチオール基で官能化されたMPCはの平均）組成物は、プロトン（1 H）ヨウ素分解試料の核磁気共鳴（NMR）分析により決定することができます。 <ol><li>適切なヒュームフードの換気でトルエン30mLに1.1グラムのtetraoctylammoniumブロマイド（TOABrを）溶かす。 </li><li> 18MΩultrapurified水（H 2 O UP）の〜20mLに0.38グラムの水素化ホウ素ナトリウム（NaBH 4の ） を溶解し、少なくとも30分間氷上で冷やしすることができます。 </li><li> UP H 2 Oの〜20mLに0.31グラムの水素テトラクロロ（HAuCl 4）溶解し、定量的なソリューションの混合物は、追加を使用してTOABr -トルエン溶液に移す〜UP、H 2 Oの5 mLを水、金に相転移するために、非水溶液への解決策。濃いオレンジ水溶液と明確な非水性相がよく混合されるように、軽く30分間蓋をしながら厳密にかき混ぜる。 </li><li>分液漏斗に透明な水性と濃いオレンジ色水系相の両方を転送する。きれいなフラスコに非水系（上）層水（底部）層をデカントして捨てます。 </li><li>非水溶液へHAuCl 4 2:1の割合でC6を追加。赤みがかったオレンジ色から淡黄色、ほぼ無色の溶液に色の変化によって検出されたとして、金（I）ポリマーを形成するために30分間かき混ぜる。 </li><li> 〜0℃で撹拌しながら、少なくとも30分間絶縁氷浴とチルに反応混合物を移す。 </li><li>定量的かつ迅速に瞬時に添加時のMPCの太い黒色の溶液を形成し、チオールの存在下で金属の金へのAu（I）を軽減するために反応混合物に冷却したNaBH 4の溶液を添加する。 0℃で一晩反応をかき混ぜる</li><li> 、分液ロートに反応混合物を譲渡する廃棄物のビーカーに水（底面）層を破棄し、フラスコ内の重い黒い汚泥を残してほぼ完全乾燥するまで非水系（上）トルエン層を蒸発させるロータリー。 </li><li>アセトニトリルを追加し、一晩座ってできるようにすることで、MPCのを沈殿させる。 </li><li>アスピレーターでゴム継手とサイドアームフラスコに培地多孔性のガラスフリットを使用して真空濾過によってのMPCを収集し、アセトニトリルのおびただしい量ですすいでください。 </li><li> 、空気乾燥へのMPCを許可する透過型電子顕微鏡（TEM）およびNMR分析により特徴づける、製品の重量を測定し、将来の使用のために頂いた店。ドロップキャスティングのMPCは銅グリッド（400メッシュ）上formvar /カーボン支持膜上にトルエンに溶解し、80から100 kVでTEM装置を動作させることでTEM像を入手。平均コアサイズは、そのようなイメージJ（フリーウェア）などの画像解析ソフトウェアを使って推定することができます。 </li></ol> 2。フィルムアセンブリ：タンパク質単分子層の電気化学のためのジチオールリンクされたMPCの映画アセンブリ金基板は、最初の電気化学的に最終的にはジチオールリンクされたMPCのフィルムのアセンブリを形成するために数回繰り返される&quot;ディップサイクルを、&quot;補うためにジチオールリンク分子とC6変更のMPCのソリューションを交互に浸漬する前に洗浄し、C6 SAMで修飾されている。として緑膿菌アズリン（AZ）タンパク質が優雅にライス大学とアリゾナ州の博士コーリーウィルソンによって与えられたため、元のプラスミドはドクタージョナサン、リッチモンド教授の大学で精製し、凍結乾燥粉末として提供されていた2、先行研究で説明その後、紫外可視（UV - VIS）の分析によって検証として5〜10μmのソリューションを作成、4.4 mMリン酸カリウム緩衝液（KPB、pHは= 7.0、μ= 10 mM）で再水和したDattelbaum、。 <ol><li>第一ルーサイトのリテーナプレート、作用電極、作用電極、金に真鍮の電気接点、電極面積を定義する最初のゴム製ガスケット、バイトンO -リングなどの金基板：下から上へ、次の順序で電気化学（EChemを）サンドイッチセルを組み立て（0.32 cm 2）を、ガラスの細胞体、第二ゴムのガスケット、もうルーサイトのリテーナープレート。セル全体がねじ山付きロッドによって一緒に保持し、慎重にウィングナットを締めている。セルは、1 M飽和KCl、Ag / AgCl参照線、および白金補助電極のワイヤーでガラスバレルを収納する、市販の参照電極が装備されています。 </li><li>電気化学的にきれいな目100℃0.2〜0.9 V、0.2〜1.2 V、0.2〜1.35 Vの潜在的な窓でサイクリックボルタンメトリー（CV）を実行することにより電子の金基板（対Ag / AgCl電極、塩化カリウム）0.1の溶液中mVの/ sのMH 2 SO 4、0.01 M KClを。 </li><li> 0.1〜0.4 V（対Ag / AgCl電極、塩化カリウム）100でスキャンKPBでMV / sの1破棄KPBの電位窓を含む&quot;標準的な条件、&quot;でCVを行うことにより、洗浄裸の金基板の充電電流を測定し、すすぎ逐次UP H 2、H 2 O UP O、エタノール（EtOH）、、及びEtOHで。 </li><li> EtOH中5mMのC6のソリューションの〜300μlに洗浄金基板を公開し、注文したC6 SAMを形成するために一晩座ってすることができます。セルからC6の液を捨て、H 2 O UPエタノール、エタノール、およびUP H 2 Oで連続的に洗い流し</li><li>標準条件でのSAMの充電電流を測定します。 KPBを破棄し、H 2、H 2 O UP O、エタノール、およびエタノールUPで連続的に洗い流してください。充電電流は著しく裸の金の測定（ステップ2.3）のそれから減少させるべきである。1 </li><li> EtOH中5mMの1,9 - nonanedithiol（NDT）ソリューションの〜300μlにSAM修飾金基板を公開し、C6 SAM内の分子を結びつけるinterdisperse NDTに1時間放置することができます。 NDTの液を捨て、H 2 O UP H 2 O、エタノール、および塩化メチレン（CH 2 Cl 2）をアップ、EtOHで連続して、よくすすぐ。 </li><li>ゆっくりと1時間のためにN 2ガ ​​スでバブリングすることにより攪拌しながらCHのMPC溶液を2 Cl 2中 （〜1 mg / mLの）に金基板を公開。必要に応じて、より多くのCH 2 Cl 2で蒸発MPCソリューションを交換してください。これはフィルムのアセンブリのアンカーMPCの層です。 MPCの液を捨て、再びCH 2 H 2 O UP Cl 2の 、、とKPBで連続してすすいでください。 </li><li>標準条件でのMPCの層の充電電流を測定します。 KPBを破棄し、UP H 2 OとCH 2 Cl 2で連続してすすいでください。 </li><li>ゆっくりと20分間N 2ガ ​​スでバブリングすることにより攪拌しながらCHの5mM NDTソリューション2 Cl 2中の〜300μlのために金基板を公開。 </li><li> NDTを破棄し、CH 2 Cl 2でよくすすぐ。フィルムのアセンブリの第2 MPCの層を堆積するステップ2.7および2.8を繰り返します。 </li><li>追加のMPCの層を堆積させるために、手順2.9、2.10繰り返されます。各追加のMPCの層と充電電流の増加に対応が観察される。 </li><li>ネットワーク化されたMPCのフィルムが完了​​すると、KPBと基板改質膜をすすいでください。 AZのタンパク質は、EChemをサンドイッチセルにKPBの5〜10μMAZソリューションの〜150μLを注入し、蓋をし、少なくとも1時間冷蔵座ってできるようにすることで、MPCのフィルムのアセンブリに吸着される。 </li><li>冷蔵庫からEChemをセルを削除し、それが室温近くに戻ることができます。徹底的に10分間N 2ガ ​​スとKPB、KPBを補充EChemをセル、およびバブルKPBですすいでください。 </li><li>タンパク質単分子層の電気化学的研究が0.25 -0.25 Vから潜在的なウィンドウのCVとして実行されるV（対Ag / AgCl電極、塩化カリウム）100でスキャンしたMV / KPBの秒。 </li></ol> 3。フィルムアセンブリ：オプティカルトラッキングのためのジチオールリンクされたMPCの映画アセンブリ前の光学的評価のための成長MPCフィルム、スライドグラスのセクションピラニア溶液（注意2時01濃H 2 SO 4とH 2 O 2）であらかじめ洗浄とで処理している（3 -メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（3 - MPTMSへ）1-2 MPC膜は、その後、以前に上記のような&quot;ディップサイクル&quot;技術を使用して、これらの修正されたスライドガラス上に組み立てています。 <ol><li> CH 2 Cl 2で3 MPTMS変更したスライドガラスをリンスし、低速でシェーカーで攪拌しながらCH 2のMPCソリューションCl 2の （〜1 mg / mL）は1時間に入れてください。これは、シランのメルカプタンの末端基にMPCはアンカリングによる膜アセンブリの最初のMPCの層を完了します。 CH 2 Cl 2で完全にスライドをすすぎ、およびN 2ガ ​​スで乾燥させます。スライドの紫外可視スペクトル（400から1000nmから）取る、そしてCH 2 Cl 2で、再度洗い流す。 </li><li>低速でシェーカーで攪拌しながら1時間CH 2 Cl 2中の5mM NDTソリューションでスライドを置きます。 CH 2 Cl 2でスライドを洗浄します。 </li><li>低速でシェーカーで攪拌しながら1時間、MPCの溶液中でスライドを置きます。これはフィルムのアセンブリの第2 MPCの層を完了します。 CH 2 Cl 2を 、N 2ガ ​​スと乾燥で十分にスライドをすすぎ、およびスライドの紫外可視スペクトル（400から1000nmから）を取る。追加のMPCの層がフィルムのアセンブリに吸着されるスペクトル全体吸光度は増加する必要があります。 </li><li>追加のMPCの層を堆積させるために、STEPS 3.2から3.3までが繰り返されます。 </li></ol> 4。単分子膜のキャラクタリゼーションは、断面透過型電子顕微鏡による金クラスターのフィルムアセンブリを保護 TEM断面が顔の埋め込 ​​み膜EN RE -埋め込 ​​むことによって調製される。2、12これは、最初にきれいな、標準的な顕微鏡の上に3 - MPTMS改質ガラススライド上に組み立てられたMPCのフィルムを取り付けることによって行われるために可能にするために埋め込 ​​む812エポキシ樹脂を使用してスライド以下の手順の実行中に処理を改善。より高い温度は、フィルム内のMPCを分解するように適用される熱で、十分に注意してください。 <ol><li>ミックスは812エポキシ樹脂を埋め込み、少なくとも12時間太くすることができます。 </li><li>エポキシ樹脂との&quot;00&quot;BEEMカプセルを記入し、MPCのフィルムのサンプル（セクション3で調製した）の上に反転させる。バブルは、カプセルの上部に上昇するようにカプセルの上に置いて圧力、エポキシ樹脂とMPCのフィルムのサンプルの間にシールを作成する。 60歳で少なくとも18時間重合することを許可° Cとし、室温にマウントされているスライドを冷却する。 </li><li>熱は、接続されているMPC 専用の顔のフィルムでブロックの除去を容易にするために200℃アルミダイキャスト、ホットプレート上で20秒間スライドをマウント。 </li><li>宝石商の鋸を使用してBEEMカプセルブロックからフィルムを含むサンプルをカット。 </li><li>よくシリコンの内部に直面してまでMPCフィルム側にシリコンフラット型で取り外した部分を再度埋め込む。室温でエポキシ樹脂と、シリコンを充填し60℃で少なくとも18時間重合することができます℃まで室温に試料を冷却する。 </li><li>ナイフのエッジに対して垂直にセクションをカットするダイヤモンドナイフを使用してライカUCTウルトラミクロトームを60から80 nmの薄いサンプルのセクションを取得します。 </li><li>場所は銅グリッド（400メッシュ）上formvar /カーボン支持膜上のセクションをスライスし、MPCのフィルムのアセンブリの準備断面のTEM像を取る。 </li></ol> 5。代表的な結果： <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig1.jpg" /> 5浸漬サイクル（MPC及びNDTソリューションへの露出を交互）の合計MPC膜成長の電流監視を充電1ダブルレイヤー図 。充電電流は、（図2）フィルムへのMPCの&quot;レイヤー&quot;を追加し、各浸漬サイクルを体系的に増加した。サイクリックボルタモグラムは0.1〜0.4、4.4 mMリン酸カリウム緩衝液では100 mV / sの液（pH = 7.0、μ= 10 mm）でのスキャンV（対Ag / AgCl電極、KClを）電位窓を用いて収集した。 ML Vargo、CP Gulka、JK Gerig、CM Manieri、JD Dattelbaum、CBマークス、NTローレンス、ML Trawick、およびMCレオポルド、 ラングミュア26（1）、560〜569から許可を得て転載。著作権2010 American Chemical Societyの。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig2.jpg" /> 図2ジチオール架橋MPCのフィルムのアセンブリに吸着AZ蛋白質の（）模式図。 （b）のMPCフィルムアセンブリに吸着AZの典型的なサイクリックボルタモグラムは、Vが（対Ag / AgCl電極、塩化カリウム）4.4 mMのリン酸カリウム緩衝液（pH = 7.0では100 mV / sでスキャン-0.25から0.25への潜在的なウィンドウを使用して収集μ= 10 mM）を。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig3.jpg" /> 図3代表的な3 - MPTMS修正されたスライドガラス上にジチオール架橋MPC膜成長の紫外可視スペクトルのモニタリング。ディップのサイクルは、リンカのソリューションは、MPCのソリューションへの暴露を続けてNDTにスライドガラスの露出で構成されています。膜厚の成長と同時吸光度増加の後続の各​​ディップ結果。ディップサイクルの数が増えるにつれて、表面プラズモンのバンドは徐々に〜520nmで定義されています。 ML Vargo、CP Gulka、JK Gerig、CM Manieri、JD Dattelbaum、CBマークス、NTローレンス、ML Trawick、およびMCレオポルド、 ラングミュア26（1）、560〜569から許可を得て転載。著作権2010 American Chemical Societyの。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig4.jpg" /> ジチオールリンクされたMPCのフィルムのアセンブリの図4透過電子顕微鏡（TEM）断面画像解析。挿入図：フィルムのアセンブリで使用されているhexanethiolate官能基のMPCの代表的なTEM像。 TEM分析は、画像Jの分析を用いて〜2 nmとするのMPCの平均金のコア径を決定する。 ML Vargo、CP Gulka、JK Gerig、CM Manieri、JD Dattelbaum、CBマークス、NTローレンス、ML Trawick、およびMCレオポルド、 ラングミュア26（1）、560〜569から許可を得て転載。著作権2010 American Chemical Societyの。

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distance+Dependence+of+Electron+Transfer+Kinetics+for+Azurin+Protein+Adsorbed+to+Monolayer+Protected+Nanoparticle+Film+Assemblies.">Distance Dependence of Electron Transfer Kinetics for Azurin Protein Adsorbed to Monolayer Protected Nanoparticle Film Assemblies.</a> Langmuir. 26, 560-569 (2010).</li><li>Doan, T. T., Vargo, M. L., Gerig, J. K., Gulka, C. P., Trawick, M. L., Dattelbaum, J. D., Leopold, M. 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利害の衝突は宣言されません。

タンパク質の単分子層の電気化学は酸化還元蛋白質と合成吸着プラットフォーム間の相互作用を研究するために使用される有効な手法です。この戦略の有効性は、しかし、分子レベルの制御性の高い吸着インタフェースを設計する能力に依存しています。このプロトコルによって作成されたMPCベースのプラットフォームは、より均質なタンパク質吸着環境3を提供し、alkanethiolateのSAM?...

<table border="1"><tr><th>試薬と装置の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th></tr><tr><td> Tetraoctylammonium臭化</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 294136 </td></tr><tr><td>水素化ホウ素ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 213462 </td></tr><tr><td>水素テトラクロロ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 254169 - 5G </td></tr><tr><td> 1 - ヘキサンチオール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 234192 </td></tr><tr><td>透過電子顕微鏡</td><td> JEOL </td><td> 1010 </td></tr><tr><td>核磁気共鳴分光装置</td><td>ブルカーアヴァンセ</td><td> 300 MHzの</td></tr><tr><td>銅グリッド（400メッシュ）上Formvar /カーボン支持膜</td><td>電子顕微鏡学</td><td> FCF400 - Cu系</td></tr><tr><td>金基板</td><td>蒸発した金属フィルム（株） </td><td>カスタム</td></tr><tr><td> Ag / AgCl参照電極</td><td>微小電極、（株） </td><td> MI - 401F </td></tr><tr><td>ポテンショスタット</td><td> CHインスツルメンツ株式会社</td><td> CHI650A、CHI610B </td></tr><tr><td> 1,9 - Nonanedithiol </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> N29805 </td></tr><tr><td> （3 - メルカプトプロピル）トリメトキシシラン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 175617 </td></tr><tr><td>紫外可視分光光度計</td><td>アジレント</td><td> 8453 </td></tr><tr><td> 812エポキシ樹脂を埋め込む</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 14120 </td></tr><tr><td> &quot;00&quot;BEEMカプセル</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 70000 - B </td></tr><tr><td>シリコンフラット型</td><td>電子顕微鏡学</td><td> 70900 </td></tr><tr><td>ダイヤモンドナイフ</td><td> Diatome </td><td> 21 - ULE、S12801 </td></tr></table>

synthesis, assembly, and characterization of monolayer protected gold nanoparticle films for protein monolayer electrochemistry

金コロイドは、タンパク質の単分子膜の電気化学（PME）の吸着のプラットフォームとして機能フィルムのアセンブリに合成され、その後に組み込まれている単分子膜保護金クラスター（MPCは）と呼ばれるalkanethiolate配位子で保護されたナノ粒子。 PMEは、電子伝達（ET）反応の酸化還元パートナーとして機能する修飾電極、少なくとも吸着プラットフォームにそれらを制限することで酸化還元タンパク質の電気化学的特性を研究するためのモデル系として利用されている。研究は、このような性質の金ナノ粒子膜のアセンブリは、より均質なタンパク質吸着の環境を提供し、アルカンチオール自己組織化単分子膜（SAM）で修飾された従来のシステムに比べて距離依存せずにETを促進することが示されている。本論文では1-3、のMPCをhexanethiolateリガンドで官能化されたが変更されたブラスト反応4を用いて合成し、紫外可視（UV - VIS）分光法、透過型電子顕微鏡（TEM）、およびプロトン（1 H）核磁気共鳴（NMR）で特徴付けられる。 MPCのフィルムは、MPCの層とジチオールリンク分子を交互の&quot;ディップサイクル&quot;メソッドを使用してSAM修飾金電極のインターフェイス上で組み立てられます。金電極での膜成長は、システムの充電電流二重層の変化を測定することにより電気化学的に追跡されます。シラン改質ガラススライド上に組み立てられた類似した膜は、膜成長及び断面TEM解析の光学的モニタリングを可能に推定膜厚が用意されています。フィルムのアセンブリの間に、MPCの配位子の保護だけでなく、粒子間のリンク機構の操作は、別の吸着機構を有する酸化還元蛋白質とのインタフェースに、容易に適応可能なネットワーク化されたフィルム、を可能にする。例えば、 緑膿菌アズリン（AZ）はhexanethiolate MPCとシトクロム c（CYT C）MPC界面層を変更したカルボン酸で静電的に固定化することができるのジチオール架橋フィルムに疎水性吸着させることができる。このレポートでは、我々は排他的にAZのシステムのためのフィルムのプロトコルに焦点を当てる。 MPC変更された合成プラットフォーム上のタンパク質の吸着を伴う調査では、生体分子と人工材料との相互作用の理解を深める、その結果、バイオセンサー方式、ETモデリングシステム、及び合成生体適合性材料の開発を支援することができます。5-8

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Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

単分子層保護のクラスタ（MPCは）として知られているAlkanethiolate安定化金コロイドは、合成の特徴、とのような単純な酸化還元蛋白質の蛋白質の単分子層の電気化学のための吸着インタフェースなどの薄膜に組み立てられる<em&gt;緑膿菌</em&gt;アズリン（AZ）とシトクロム<em&gt; C</em&gt;（CYT<em&gt; C</em&gt;）。

合成、組立、および単分子膜のキャラクタリゼーションは、タンパク質単分子層の電気化学のための金ナノ粒子膜を保護

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

synthesis-assembly-characterization-monolayer-protected-gold

Research

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Bioengineering

14.4K ビュー.  University of Richmond. 単分子層保護のクラスタ（MPCは）として知られているAlkanethiolate安定化金コロイドは、合成の特徴、とのような単純な酸化還元蛋白質の蛋白質の単分子層の電気化学のための吸着インタフェースなどの薄膜に組み立てられる緑膿菌アズリン（AZ）とシトクロム C（CYT C）。

ビデオ: Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

シルバーシード媒介成長法によるゴールドNanostarの合成

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

生物工学

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

バイオマーカー探索のためのメソポーラスシリカ薄膜の低分子量蛋白質の濃縮

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

組合せの合成と高分子膜とナノ粒子のライブラリからのハイスループットタンパクリリース

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

インテイン媒介人工タンパク質ヒドロゲルの合成

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

リン脂質単層の二次元拡散を測定するためにドロップレットをマージした後蛍光回復

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

This protocol describes a simple preparation method for gold nanoparticle integrated photo-responsive liposomes with the commercially available materials. It also shows how to measure the microbubble cavitation process of the synthesized liposomes upon the treatment of pulsed laser.

パルスレーザー励起時の金ナノ粒子の統合フォト応答性リポソームとそのマイクロバブルキャビテーションの測定の合成

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

微細と3D微小血管の組立

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

細胞の超高速磁化のためのカチオン化Magnetoferritinの合成

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting and drug delivery are some of the applications of these AuNPs, but endothelial extracellular matrices&#39; defensive properties hamper particle uptake. To address this issue, we describe a synthesis method for ultrasmall gold nanoparticles to improve vascular delivery, with customizable functional groups and polymer lengths for further adjustments. The protocol yields 2.5 nm AuNPs that are capped with tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC). The replacement of THPC with hetero-functional polyethylene glycol (PEG) on the surface of the AuNP increases the hydrodynamic radius to 10.5 nm while providing various functional groups on the surface. The last part of the protocol includes an optional addition of a fluorophore to allow the AuNPs to be visualized under fluorescence to track nanoparticle uptake. Dialysis and lyophilization were used to purify and isolate the AuNPs. These fluorescent nanoparticles can be visualized in both in vitro and in vivo experiments due to the biocompatible PEG coating and fluorescent probes. Additionally, the size range of these nanoparticles render them an ideal candidate for probing the glycocalyx without disrupting normal vasculature function, which may lead to improved delivery and therapeutics.

We describe a method of synthesizing biocompatible 10-nm gold nanoparticles, functionalized by coating poly-ethylene glycol onto the surface. These particles can be used in vitro and in vivo for delivering therapeutics to nanoscale cellular and extracellular spaces that are difficult to access with conventional nanoparticle sizes.

粒子の合成機能 10 nm ポリマー コーティング金対象化、血管内皮細胞とドラッグデリバリー

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Assembly and Characterization of Biomolecular Memristors Consisting of Ion Channel-doped Lipid Membranes

The ability to recreate synaptic functionalities in synthetic circuit elements is essential for neuromorphic computing systems that seek to emulate the cognitive powers of the brain with comparable efficiency and density. To date, silicon-based three-terminal transistors and two-terminal memristors have been widely used in neuromorphic circuits, in large part due to their ability to co-locate information processing and memory. Yet these devices cannot achieve the interconnectivity and complexity of the brain because they are power-hungry, fail to mimic key synaptic functionalities, and suffer from high noise and high switching voltages. To overcome these limitations, we have developed and characterized a biomolecular memristor that mimics the composition, structure, and switching characteristics of biological synapses. Here, we describe the process of assembling and characterizing biomolecular memristors consisting of a 5 nm-thick lipid bilayer formed between lipid-functionalized water droplets in oil and doped with voltage-activated alamethicin peptides. While similar assembly protocols have been used to investigate biophysical properties of droplet-supported lipid membranes and membrane-bound ion channels, this article focuses on key modifications of the droplet interface bilayer method essential for achieving consistent memristor performance. Specifically, we describe the liposome preparation process and the incorporation of alamethicin peptides in lipid bilayer membranes, and the appropriate concentrations of each constituent as well as their impact on the overall response of the memristors. We also detail the characterization process of biomolecular memristors, including measurement and analysis of memristive current-voltage relationships obtained via cyclic voltammetry, as well as short-term plasticity and learning in response to step-wise voltage pulse trains.

Soft, low-power, biomolecular memristors leverage similar composition, structure, and switching mechanisms of bio-synapses. Presented here is a protocol to assemble and characterize biomolecular memristors obtained from insulating lipid bilayers formed between water droplets in oil. The incorporation of voltage-activated alamethicin peptides results in memristive ionic conductance across the membrane.

アセンブリおよびイオン チャネルをドープした脂質膜から成る分子 Memristors のキャラクタリゼーション

The ability to recreate synaptic functionalities in synthetic circuit elements is essential for neuromorphic computing systems that seek to emulate the ...