Nous remercions la National Science Foundation (CHE-0847145), et le professeur Henry Dreyfus Scholar-Programme de bourses pour les généreusement soutenir cette recherche. Nous tenons à reconnaître spécifiquement Christine Davis, directeur de la microscopie et d&#39;imagerie dans le département de biologie de l&#39;Université de Richmond pour son aide transversale d&#39;imagerie. Un merci spécial est donnée à MM. T. Léopold, affaire R. Kanters, D. Kellogg, R. Miller, et W., ainsi que, Russ Collins, Phil Joseph, Carolyn Marks, Mandy et John Mallory Wimbush - qui tous font de la recherche de premier cycle à l&#39;Université possibles de Richmond. Un merci très personnelle est donnée à tous les cours, passées et futures de chercheurs de premier cycle dans le laboratoire de recherche Léopold.

1. Hexanethiolate monocouche protégées Synthèse d&#39;or clusters Hexanethiolate fonctionnalisés grappes monocouche d&#39;or protégées (PPM) sont synthétisés après une 1-02h01 hexanethiol (C6) au rapport molaire d&#39;or pour produire une structure moyenne de Au 225 (C6) 75. 4-9 modifications spécifiques à la réaction Brust, comme traitements de type ligand, spécifique thiol-à-or des ratios, la température et le taux de livraison de réaction, ou post-synthèse, 9-11 peut produire une gamme diversifiée de PPM avec des tailles différentes et fonctionnelles fondamentales des groupes protecteurs, respectivement. 4 Le approximative MPC ( moyenne) des compositions du PPM fonctionnalisés avec divers groupes alcanethiol peut être déterminé par proton (1 H) par résonance magnétique nucléaire (RMN) l&#39;analyse des échantillons d&#39;iode-décomposés. <ol><li> Dissoudre 1,1 g de bromure de tétraoctylammonium (TOABr) dans 30 ml de toluène avec une ventilation appropriée capuche fumées. </li><li> Dissoudre 0,38 g de borohydrure de sodium (NaBH 4) dans ~ 20 ml d&#39;eau de 18 MQ ultrapurifiée (UP H 2 O) et laisser refroidir sur glace pendant au moins 30 min. </li><li> Dissoudre 0,31 g d&#39;hydrogène tétrachloroaurate (HAuCl 4) dans ~ 20 mL de H 2 O UP et transvaser quantitativement le mélange de solution à la solution TOABr-toluène en utilisant un supplément de ~ 5 mL de H 2 O UP afin de transfert de phase aqueuse de l&#39;or solution à la solution non aqueuse. Remuer avec rigueur tout en sollicitant légèrement plafonné pendant 30 min afin de l&#39;orange brûlé aqueux et non aqueux sont claires phases en mélangeant bien. </li><li> Transfert à la fois la phase aqueuse claire et orange brûlé phases non aqueux à une ampoule à décanter. Jeter la solution aqueuse (en bas) et décanter la couche de non-aqueux (en haut) la couche dans un flacon propre. </li><li> Ajouter C6 dans un rapport de 2:1 avec HAuCl 4 à la solution non aqueux. Remuez pendant 30 min pour former une Au (I) polymère, tel que détecté par un changement de couleur de l&#39;orange rougeâtre à jaune pâle, solution presque incolore. </li><li> Transférer le mélange réactionnel à un bain de glace isolés et refroidir à 0 ° C pendant au moins 30 min en remuant. </li><li> Quantitativement et ajouter rapidement l&#39;réfrigérée solution de NaBH4 au mélange réactionnel afin de réduire Au (I) pour une médaille d&#39;or métallique en présence de thiols, instantanément, formant une solution noire épaisse du PPM lors de l&#39;addition. Incorporer une nuit de réaction à 0 ° C. </li><li> Transférer le mélange réactionnel dans une ampoule à décanter, éliminer la phase aqueuse (en bas) la couche dans un bécher de déchets, et rotatifs évaporer les non aqueux (en haut) couche de toluène à la sécheresse complète proximité laissant une boue noire épaisse dans le ballon. </li><li> Précipiter les PPM en ajoutant l&#39;acétonitrile et permettant de s&#39;asseoir pendant la nuit. </li><li> Recueillir des PPM par filtration sous vide en utilisant une fritte de verre de porosité moyenne avec des raccords en caoutchouc et secondaires armés flacon avec aspirateur et rincer avec une grande quantité d&#39;acétonitrile. </li><li> Laisser sécher à l&#39;air PPM, peser produit, caractériser par microscopie électronique en transmission (TEM) et analyse par RMN, et stocker plafonnés pour une utilisation future. Obtenir des images TEM à goutte-casting PPM dissous dans le toluène sur formvar / film de support de carbone sur grille de cuivre (400 mesh) et de fonctionnement de l&#39;instrument TEM à 80-100 kV. La taille moyenne de coeur peut être estimée en utilisant le logiciel d&#39;analyse d&#39;images telles que Image J (freeware). </li></ol> 2. Film Assemblée: dithiol liés Assemblée film MPC pour l&#39;électrochimie monocouche de protéines Le substrat d&#39;or est d&#39;abord nettoyé et électrochimique modifié avec un SAM C6 avant de l&#39;immerger en alternant les solutions de molécules de liaison et de dithiol PPM C6 modifié pour le rendre un «cycle de baisse», ce qui est répété plusieurs fois pour finalement former un assemblage de films liés dithiol-MPC . Comme décrit dans les études antérieures, 2 plasmide d&#39;origine pour le Pseudomonas aeruginosa azurine (AZ) protéine a été gracieusement donné par le Dr. Corey Wilson de l&#39;Université Rice et AZ a été fournie sous forme de poudre lyophilisée purifiée et par l&#39;Université de Richmond professeur, le Dr Jonathan Dattelbaum, qui a ensuite été réhydraté avec 4,4 mM de tampon phosphate de potassium (KPB, pH = 7,0, μ = 10 mm) pour créer une solution uM 50-10 tel que vérifié par l&#39;analyse visible (UV-Vis) ultraviolets. <ol><li> Assemblez la cellule électrochimique sandwich (Echem) dans l&#39;ordre suivant de haut en bas: d&#39;abord la plaque de retenue Lucite, substrat d&#39;or comme une électrode de travail, contactez cuivres électriques à l&#39;électrode de travail en or, tout d&#39;abord joint en caoutchouc, joint torique en Viton qui définit la zone d&#39;électrode (0,32 cm 2), corps de la cellule de verre, joint en caoutchouc seconde, et la deuxième plaque de retenue Lucite. La cellule entière est maintenue par des tiges filetées et soigneusement serré les écrous à oreilles. La cellule est équipée d&#39;une électrode de référence achetés dans le commerce qui abrite un cylindre en verre avec 1 M de KCl saturée, Ag / AgCl fils, et un fil de platine électrode auxiliaire. </li><li> Électrochimiquement ème propressubstrat d&#39;or e en effectuant voltamétrie cyclique (CV) dans les fenêtres potentielles de 0,2 à 0,9 V, 0,2 à 1,2 V, et de 0,2 à 1,35 V (par rapport à Ag / AgCl, KCl) à 100 mV / s dans une solution de 0,1 MH 2 SO 4 et 0,01 M de KCl. </li><li> Mesurez le courant de charge du substrat d&#39;or nue nettoyé en effectuant CV à &quot;conditions standard&quot;, y compris une fenêtre de potentiel de 0,1 à 0,4 V (versus Ag / AgCl, KCl) scannés à 100 mV / s dans KPB. Jeter une KPB et rincer successivement avec UP H 2 O, de l&#39;éthanol (EtOH), UP H 2 O, et EtOH. </li><li> Exposez le substrat d&#39;or nettoyé à ~ 300 pi de solution à 5 mM dans EtOH C6 et laisser reposer toute la nuit pour former un commandés C6 SAM. Jeter la solution C6 de la cellule et rincez avec de l&#39;EtOH successivement, UP H 2 O, EtOH, et UP H 2 O. </li><li> Mesurer le courant de charge de la SAM dans des conditions standard. Jeter KPB et rincer successivement avec UP H 2 O, EtOH, UP H 2 O, et EtOH. Le courant de charge doit être nettement diminué, passant de celle de la mesure d&#39;or nu (étape 2.3) 1. </li><li> Exposer le substrat d&#39;or SAM modifié pour ~ 300 pl de 5 mM 1,9-nonanedithiol (HAT) solution dans EtOH et laisser reposer pendant 1 heure pour interdisperse NDT reliant molécules au sein du SAM C6. Jeter la solution et rincer NDT successivement et de manière approfondie avec EtOH, UP H 2 O, EtOH, UP H 2 O, et le chlorure de méthylène (CH 2 Cl 2). </li><li> Exposez le substrat d&#39;or à une solution PPM de CH 2 Cl 2 (~ 1 mg / ml) avec agitation par lentement bouillonne de gaz N 2 pendant 1 heure. Si nécessaire, remplacez évaporé solution de PPM avec plus de CH 2 Cl 2. Il s&#39;agit de la couche d&#39;ancrage PPM de l&#39;assemblage du film. Jeter la solution MPC et rincez à nouveau successivement avec CH 2 Cl 2, H 2 O UP, et KPB. </li><li> Mesurer le courant de charge de la couche MPC dans des conditions standard. Jeter KPB et rincer successivement avec UP H 2 O et CH 2 Cl 2. </li><li> Exposez le substrat d&#39;or à ~ 300 pi de solution à 5 mM de NDT CH 2 Cl 2 avec agitation par lentement bouillonne de gaz N 2 pendant 20 min. </li><li> Jeter NDT et rincez soigneusement avec du CH 2 Cl 2. Répétez les étapes 2,7 et 2,8 pour déposer la deuxième couche MPC de l&#39;assemblage du film. </li><li> Pour déposer des couches supplémentaires de MPC, les étapes 2,9 et 2,10 sont répétées. Avec chaque couche supplémentaire MPC une augmentation correspondante dans le courant de charge est observée. </li><li> Après le film en réseau MPC est terminée, rincer le substrat de film modifié avec KPB. Protéines AZ est adsorbé sur le montage du film MPC en injectant ~ 150 pi de solution de ~ uM AZ 5-10 de KPB dans la cellule sandwich au Echem et permettant de s&#39;asseoir plafonné et réfrigérés pendant au moins 1 heure. </li><li> Retirez la cellule Echem du réfrigérateur et laissez revenir à température ambiante proche. Rincer abondamment à l&#39;KPB, remplissez Echem cellule avec KPB, et la bulle KPB avec N 2 gazeux pendant 10 min. </li><li> Protéines monocouche études électrochimiques sont effectuées comme CV dans la fenêtre de potentiel de -0,25 V à 0,25 V (par rapport à Ag / AgCl, KCl) scannés à 100 mV / sec dans KPB. </li></ol> 3. Film Assemblée: dithiol liés Assemblée film MPC pour repérage optique Avant de croissance des films MPC pour l&#39;évaluation optique, sections lame de verre sont pré-nettoyées avec une solution Piranha (Attention! 02:01 concentrée de H 2 SO 4 et H 2 O 2) et traitée avec (3-mercaptopropyle)-triméthoxysilane (3-MPTMS ). 1-2 films CPP sont ensuite assemblés sur ces diapositives de verre modifiés à l&#39;aide du &quot;cycle de baisse&quot; technique que précédemment décrit ci-dessus. <ol><li> Rincer une lame de verre de 3 MPTMS modifié avec CH 2 Cl 2 et le placer dans une solution PPM de CH 2 Cl 2 (~ 1 mg / ml) pendant 1 heure tout en agitant sur ​​un agitateur à faible vitesse. Ceci termine la première couche MPC de l&#39;assemblée du film par l&#39;ancrage PPM les groupes terminaux mercaptans du silane. Rincer la lame soigneusement avec CH 2 Cl 2, et sécher avec un gaz N 2. Prenez un spectre UV-Vis (de 400 à 1000 nm) de la diapositive, puis rincer à nouveau avec CH 2 Cl 2. </li><li> Placer la lame dans une solution HAT 5 mM de CH 2 Cl 2 pendant 1 heure tout en agitant sur ​​un agitateur à faible vitesse. Rincer la lame avec du CH 2 Cl 2. </li><li> Placer la lame dans une solution PPM pendant 1 heure tout en agitant sur un agitateur à faible vitesse. Ceci achève la deuxième couche MPC de l&#39;assemblée du film. Rincer la lame soigneusement avec CH 2 Cl 2, sécher avec du gaz N 2, et de prendre un spectre UV-Vis (de 400 à 1000 nm) de la diapositive. L&#39;absorbance dans le spectre devrait être plus que des couches supplémentaires de MPC sont adsorbés à l&#39;assemblée du film. </li><li> Pour déposer des couches supplémentaires de MPC, steps 3.2 à 3.3 sont répétées. </li></ol> 4. Caractérisation des monocouches protégées assemblées Or Cluster film par la Croix-microscopie électronique à transmission sectionnelles TEM sections sont préparés par re-enrobage visage fr films embarqués. 2, 12 Cela se fait d&#39;abord par la fixation d&#39;un film MPC assemblés sur une lame de verre de 3 MPTMS modifiés sur un chiffon propre, microscope standard diapositives à l&#39;aide de résine époxy Embed 812 pour permettre meilleure manipulation lors de la procédure ci-dessous. Soyez prudent avec la chaleur appliquée que des températures plus élevées se décomposent les PPM dans le film. <ol><li> Mélanger 812 Intégrer résine époxy et laisser épaissir pendant au moins 12 hr. </li><li> Remplissez un &quot;00&quot; capsule de SEEB avec une résine époxy et inverser sur le dessus de l&#39;échantillon de film MPC (préparé dans la section 3). Placez la pression sur la capsule afin que la bulle monte vers le haut de la capsule, la création d&#39;un joint d&#39;étanchéité entre la résine époxy et échantillon de film MPC. Laisser polymériser pendant au moins 18 h à 60 ° C, puis refroidir les diapositives montées à température ambiante. </li><li> Chauffer diapositives pendant 20 sec sur une plaque en aluminium coulé à chaud à 200 ° C afin de faciliter le retrait du bloc avec un film MPC visage attachés fr. </li><li> Couper l&#39;échantillon contenant le film hors du bloc de la capsule à l&#39;aide de SEEB scie de bijoutier. </li><li> Re-embed la partie enlevée dans un moule en silicone à plat avec le côté film MPC jusqu&#39;à tournée vers l&#39;intérieur du silicium ainsi. Remplissez le silicium et de résine époxy à température ambiante et laisser polymériser pendant au moins 18 h à 60 ° C. Refroidir l&#39;échantillon à température ambiante. </li><li> Obtenir sections échantillon mince de 60-80 nm sur un Leica UCT ultramicrotome en utilisant un couteau de diamant pour couper des sections perpendiculaires à bord du couteau. </li><li> Placez tranché sections sur formvar / film de support de carbone sur grille de cuivre (400 mesh) et de prendre des images TEM de préparer des coupes des assemblées du film MPC. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig1.jpg" /> Figure 1 double couche de charge le suivi actuel de croissance du film MPC pour un total de 5 cycles de trempage (alternant exposition au MPC et des solutions NDT). Le courant de charge accrue systématiquement à chaque cycle trempage, ajoutant &quot;couches&quot; de MPC pour le film (Fig. 2). Les voltampérogrammes cycliques ont été recueillies en utilisant une fenêtre de potentiel de 0,1 à 0,4 V (versus Ag / AgCl, KCl) scannés à 100 mV / s en 4,4 mM de tampon phosphate de potassium (pH = 7,0, μ = 10 mm). Reproduit avec la permission de ML Vargo, CP Gulka, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB Marques, NT-Laurent, ML Trawick, et MC Léopold, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig2.jpg" /> Figure 2 (a) Représentation schématique de la protéine Z adsorbées à un assemblage de films liés dithiol-MPC. (B) voltamogramme cyclique typique pour AZ adsorbés à MPC du film de montage recueillies en utilisant une fenêtre de potentiel de -0,25 à 0,25 V (par rapport à Ag / AgCl, KCl) scannés à 100 mV / s en 4,4 mM de tampon phosphate de potassium (pH = 7,0, μ = 10 mm). <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig3.jpg" /> La figure 3 représentant UV-Vis de surveillance spectrale d&#39;une croissance liée dithiol films MPC sur une lame de verre de 3 MPTMS modifiés. Un cycle se compose d&#39;un creux d&#39;exposition de la lame de verre à NDT solution de linker suivie d&#39;une exposition à la solution de PPM. Chaque résultat DIP ultérieurs de la croissance en épaisseur du film et une augmentation de l&#39;absorbance concurrente. Comme le nombre de cycles augmente DIP, la bande de plasmon de surface est progressivement définie à ~ 520 nm. Reproduit avec la permission de ML Vargo, CP Gulka, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB Marques, NT-Laurent, ML Trawick, et MC Léopold, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3441/3441fig4.jpg" /> Figure 4 microscopie électronique à transmission (MET) de la Croix d&#39;analyse d&#39;images en coupe d&#39;un assemblage dithiol liés film de MPC. Encart: image MET typique de hexanethiolate PPM fonctionnalisés utilisés dans l&#39;assemblage du film. Analyse MET déterminée d&#39;un diamètre moyen de l&#39;or cœur de la PPM à ~ 2 nm en utilisant une analyse Image J. Reproduit avec la permission de ML Vargo, CP Gulka, JK Gerig, CM Manieri, JD Dattelbaum, CB Marques, NT-Laurent, ML Trawick, et MC Léopold, Langmuir 26 (1), 560-569. Copyright 2010 American Chemical Society.

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Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Électrochimie monocouche de protéines est une technique efficace utilisée pour étudier les interactions entre protéines redox et de synthèse des plates-formes d&#39;adsorption. L&#39;efficacité de cette stratégie, cependant, dépend de la capacité de construire une interface d&#39;adsorption avec un degré élevé de contrôle au niveau moléculaire. Les plates-formes de MPC-base créé par ce protocole représentent les plates-formes spécialement conçues qui sont en mesure de fournir une protéine plus homog...

<table border="1"><tr><th> Nom du réactif et de l&#39;équipement </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th></tr><tr><td> Bromure de tétraoctylammonium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 294136 </td></tr><tr><td> Le borohydrure de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 213462 </td></tr><tr><td> Hydrogène tétrachloroaurate </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 254 169-5G </td></tr><tr><td> 1-hexanethiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 234192 </td></tr><tr><td> Microscope électronique à transmission </td><td> JEOL </td><td> 1010 </td></tr><tr><td> Spectromètre à résonance magnétique nucléaire </td><td> Bruker Avance </td><td> 300 MHz </td></tr><tr><td> Film support Formvar / carbone sur grille de cuivre (400 mesh) </td><td> Sciences Electron Microscopy </td><td> FCF400-Cu </td></tr><tr><td> Substrat d&#39;or </td><td> Évaporé Métal Films Corp </td><td> Personnalisé </td></tr><tr><td> L&#39;électrode de référence Ag / AgCl </td><td> Microélectrodes, Inc </td><td> MI-401F </td></tr><tr><td> Potentiostats </td><td> CH Instruments, Inc </td><td> CHI650A, CHI610B </td></tr><tr><td> 1,9-Nonanedithiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> N29805 </td></tr><tr><td> (3-mercaptopropyle)-triméthoxysilane </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 175617 </td></tr><tr><td> Spectrophotomètre visible ultraviolet </td><td> Agilent </td><td> 8453 </td></tr><tr><td> De résine époxy Embed 812 </td><td> Sciences Electron Microscopy </td><td> 14120 </td></tr><tr><td> &quot;00&quot; capsule de SEEB </td><td> Sciences Electron Microscopy </td><td> 70000-B </td></tr><tr><td> Silicon moule plat </td><td> Sciences Electron Microscopy </td><td> 70900 </td></tr><tr><td> Couteaux diamant </td><td> Diatome </td><td> 21-ULE, S12801 </td></tr></table>

synthesis, assembly, and characterization of monolayer protected gold nanoparticle films for protein monolayer electrochemistry

Nanoparticules d&#39;or colloïdal protégée avec des ligands alkanethiolate appelés clusters monocouche d&#39;or protégées (PPM) sont synthétisés et ensuite incorporées dans les assemblées du film qui servent de plates-formes d&#39;adsorption pour l&#39;électrochimie monocouche de protéines (PME). PME est utilisé comme système modèle pour l&#39;étude des propriétés électrochimiques des protéines redox en les confinant à une plateforme d&#39;adsorption à une électrode modifiée, qui sert également comme un partenaire redox pour le transfert d&#39;électrons (HE) des réactions. Des études ont montré que l&#39;or assemblées film de nanoparticules de cette nature à assurer un environnement plus homogène adsorption des protéines et de promouvoir HE sans dépendance à distance par rapport aux systèmes plus traditionnels modifiés avec alcanethiol monocouches auto-assemblées (SAM). 1-3 Dans ce papier, PPM fonctionnalisés par des ligands hexanethiolate sont synthétisés en utilisant une réaction Brust modifiés 4 et caractérisés par spectroscopie visible (UV-Vis) ultraviolette, microscopie électronique à transmission (MET), et le proton (1 H) par résonance magnétique nucléaire (RMN). MPC films sont assemblés sur des interfaces modifiées SAM électrode en or en utilisant un «cycle de baisse&quot; méthode des couches alternées MPC et dithiol molécules de liaison. La croissance du film à l&#39;électrode d&#39;or est suivi électrochimique en mesurant les changements de la double couche de courant de charge du système. Films analogues montés sur lames de verre modifiés silane permettre un suivi optique de croissance du film et de l&#39;analyse TEM transversale fournit une épaisseur du film estimé. Lors du montage du film, la manipulation de la protection de ligand MPC ainsi que le mécanisme de liaison entre particules permettent de films en réseau, qui sont facilement adaptables, pour s&#39;interfacer avec des protéines redox ayant différents mécanismes d&#39;adsorption. Par exemple, Pseudomonas aeruginosa azurine (AZ) peut être adsorbé hydrophobiquement au dithiol liés films de PPM hexanethiolate et cytochrome c (cyt c) peuvent être immobilisés électrostatiquement à un acide carboxylique modifiés MPC couche interfaciale. Dans ce rapport, nous nous concentrons sur le protocole de films pour le système de AZ exclusivement. Enquêtes impliquant l&#39;adsorption des protéines sur des plates-formes modifiées MPC synthétique pourrait approfondir la compréhension des interactions entre biomolécules et matériaux synthétiques, et par conséquent l&#39;aide au développement des régimes de biocapteur, la modélisation des systèmes HE, et les matériaux synthétiques biocompatibles. 5-8

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Synthesis, Assembly, and Characterization of Monolayer Protected Gold Nanoparticle Films for Protein Monolayer Electrochemistry

Colloïdes d&#39;or stabilisées Alkanethiolate connus comme des grappes monocouche protégée (PPM) sont synthétisés, caractérisés, et assemblés en couches minces comme une interface d&#39;adsorption pour l&#39;électrochimie monocouche de protéines de protéines redox simples comme<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Azurine (AZ) et le cytochrome<em&gt; C</em&gt; (CYT<em&gt; C</em&gt;).

Synthèse, l&#39;Assemblée, et caractérisation des nanoparticules Monocouche protégées Films d&#39;or pour Electrochimie monocouche de protéines

Colloidal gold nanoparticles protected with alkanethiolate ligands called monolayer protected gold clusters (MPCs) are synthesized and subsequently ...

synthesis-assembly-characterization-monolayer-protected-gold

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.4K vues.  University of Richmond. Colloïdes d'or stabilisées Alkanethiolate connus comme des grappes monocouche protégée (PPM) sont synthétisés, caractérisés, et assemblés en couches minces comme une interface d'adsorption pour l'électrochimie monocouche de protéines de protéines redox simples comme Pseudomonas aeruginosa Azurine (AZ) et le cytochrome C (CYT C).

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Gold Nanostar Synthesis with a Silver Seed Mediated Growth Method

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest in using nano-colloids for photo-thermal ablation, drug delivery and many other biomedical applications 6. Gold is particularly used because of its low toxicity 7-9. A property of metal nano-colloids is that they can have a strong surface plasmon resonance 10. The peak of the surface plasmon resonance mode depends on the structure and composition of the metal nano-colloids. Since the surface plasmon resonance mode is stimulated with light there is a need to have the peak absorbance in the near infrared where biological tissue transmissivity is maximal 11, 12.
We present a method to synthesize star shaped colloidal gold, also known as star shaped nanoparticles 13-15 or nanostars 16. This method is based on a solution containing silver seeds that are used as the nucleating agent for anisotropic growth of gold colloids 17-22. Scanning electron microscopy (SEM) analysis of the resulting gold colloid showed that 70 % of the nanostructures were nanostars. The other 30 % of the particles were amorphous clusters of decahedra and rhomboids. The absorbance peak of the nanostars was detected to be in the near infrared (840 nm). Thus, our method produces gold nanostars suitable for biomedical applications, particularly for photo-thermal ablation.

We synthesized star shaped gold nanostars using a silver seed mediated growth method. The diameter of the nanostars ranges from 200 to 300 nm and the number of tips vary from 7 to 10. The nanoparticles have a broad surface plasmon resonance mode centered in the near infrared.

Or Nanostar synthèse avec une méthode de graines Silver croissance Mediated

The physical, chemical and optical properties of nano-scale colloids depend on their material composition, size and shape 1-5. There is a great interest ...

Recherche

Bio-ingénierie

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Faible enrichissement moléculaire des protéines de poids sur les films minces de silice mésoporeuse de recherche de biomarqueurs

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

Combinatorial Synthesis of and High-throughput Protein Release from Polymer Film and Nanoparticle Libraries

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with conventional one-sample-at-a-time synthesis techniques, a more recent high-throughput approach has been developed enabling the synthesis and testing of large libraries of polyanhydrides1. This will facilitate more efficient optimization and design process of these biomaterials for drug and vaccine delivery applications. The method in this work describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries. In this robotically operated method (Figure 1), linear actuators and syringe pumps are controlled by LabVIEW, which enables a hands-free automated protocol, eliminating user error. Furthermore, this method enables the rapid fabrication of micro-scale polymer libraries, reducing the batch size while resulting in the creation of multivariant polymer systems. This combinatorial approach to polymer synthesis facilitates the synthesis of up to 15 different polymers in an equivalent amount of time it would take to synthesize one polymer conventionally. In addition, the combinatorial polymer library can be fabricated into blank or protein-loaded geometries including films or nanoparticles upon dissolution of the polymer library in a solvent and precipitation into a non-solvent (for nanoparticles) or by vacuum drying (for films). Upon loading a fluorochrome-conjugated protein into the polymer libraries, protein release kinetics can be assessed at high-throughput using a fluorescence-based detection method (Figures 2 and 3) as described previously1. This combinatorial platform has been validated with conventional methods2 and the polyanhydride film and nanoparticle libraries have been characterized with 1H NMR and FTIR. The libraries have been screened for protein release kinetics, stability and antigenicity; in vitro cellular toxicity, cytokine production, surface marker expression, adhesion, proliferation and differentiation; and in vivo biodistribution and mucoadhesion1-11. The combinatorial method developed herein enables high-throughput polymer synthesis and fabrication of protein-loaded nanoparticle and film libraries, which can, in turn, be screened in vitro and in vivo for optimization of biomaterial performance.

This method describes the combinatorial synthesis of biodegradable polyanhydride film and nanoparticle libraries and the high-throughput detection of protein release from these libraries.

Synthèse combinatoire des protéines et de décharge à haut débit à partir du film polymère et bibliothèques nanoparticules

Polyanhydrides are a class of biomaterials with excellent biocompatibility and drug delivery capabilities. While they have been studied extensively with ...

Synthesis of an Intein-mediated Artificial Protein Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of this hydrogel are two protein block-copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. A highly hydrophilic random coil is inserted into one of the block-copolymers for water retention. Mixing of the two protein block copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit with crosslinkers at either end that rapidly self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is very stable under both acidic and basic conditions, at temperatures up to 50 &#176;C, and in organic solvents. The hydrogel rapidly reforms after shear-induced rupture. Incorporation of a &#34;docking station peptide&#34; into the hydrogel building block enables convenient incorporation of &#34;docking protein&#34;-tagged target proteins. The hydrogel is compatible with tissue culture growth media, supports the diffusion of 20 kDa molecules, and enables the immobilization of bioactive globular proteins. The application of the intein-mediated protein hydrogel as an organic-solvent-compatible biocatalyst was demonstrated by encapsulating the horseradish peroxidase enzyme and corroborating its activity.

We present the synthesis of a split-intein-mediated protein hydrogel. The building blocks of this hydrogel are two protein copolymers each containing a subunit of a trimeric protein that serves as a crosslinker and one half of a split intein. Mixing of the two protein copolymers triggers an intein trans-splicing reaction, yielding a polypeptide unit that self-assembles into a hydrogel. This hydrogel is highly pH- and temperature-stable, compatible with organic solvents, and easily incorporates functional globular proteins.

Synthèse d&#39;une protéine artificielle induite par une intéine Hydrogel

We present the synthesis of a highly stable protein hydrogel mediated by a split-intein-catalyzed protein trans-splicing reaction. The building blocks of ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

Récupération de fluorescence après Fusionner une Droplet mesurer la Diffusion bidimensionnelle d&#39;une monocouche de phospholipides

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Synthesis of Gold Nanoparticle Integrated Photo-responsive Liposomes and Measurement of Their Microbubble Cavitation upon Pulse Laser Excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control over the drug release. However, most of the relevant technologies are still in the development process and are unprocurable by clinics. Here, we describe a facile fabrication of these photo-responsive NPs with commercially available gold NPs and thermo-responsive liposomes. Calcein is used as a model drug to evaluate the encapsulation efficiency and the release kinetic profile upon heat/light stimulation. Finally, we show that this photo-triggered release is due to the membrane disruption caused by microbubble cavitation, which can be measured with hydrophone.

This protocol describes a simple preparation method for gold nanoparticle integrated photo-responsive liposomes with the commercially available materials. It also shows how to measure the microbubble cavitation process of the synthesized liposomes upon the treatment of pulsed laser.

Synthèse de l&#39;or nanoparticules liposomes intégré photosensible et mesurer leur microbulles cavitation sur Pulse Laser excitation

Photo-responsive nanoparticles (NPs) have received considerable attention because of their potential in providing spatial, temporal, and dosage control ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micromodelage et l&#39;Assemblée des microvaisseaux 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPIONs). Achieving sufficient cellular uptake of SPIONs is a challenge that has traditionally been met by exposing cells to elevated concentrations of SPIONs or by prolonging exposure times (up to 72 hr). However, these strategies are likely to mediate toxicity. Here, we present the synthesis of the protein-based SPION magnetoferritin as well as a facile surface functionalization protocol that enables rapid cell magnetization using low exposure concentrations. The SPION core of magnetoferritin consists of cobalt-doped iron oxide with an average particle diameter of 8.2 nm mineralized inside the cavity of horse spleen apo-ferritin. Chemical cationization of magnetoferritin produced a novel, highly membrane-active SPION that magnetized human mesenchymal stem cells (hMSCs) using incubation times as short as one minute and iron concentrations as lows as 0.2 mM.

A protocol for the synthesis and cationization of cobalt-doped magnetoferritin is presented, as well as a method to rapidly magnetize stem cells with cationized magnetoferritin.

Synthèse de cationisé Magnetoferritin pour magnétisation ultra-rapide des cellules

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

Synthesis of Functionalized 10-nm Polymer-coated Gold Particles for Endothelium Targeting and Drug Delivery

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting and drug delivery are some of the applications of these AuNPs, but endothelial extracellular matrices&#39; defensive properties hamper particle uptake. To address this issue, we describe a synthesis method for ultrasmall gold nanoparticles to improve vascular delivery, with customizable functional groups and polymer lengths for further adjustments. The protocol yields 2.5 nm AuNPs that are capped with tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC). The replacement of THPC with hetero-functional polyethylene glycol (PEG) on the surface of the AuNP increases the hydrodynamic radius to 10.5 nm while providing various functional groups on the surface. The last part of the protocol includes an optional addition of a fluorophore to allow the AuNPs to be visualized under fluorescence to track nanoparticle uptake. Dialysis and lyophilization were used to purify and isolate the AuNPs. These fluorescent nanoparticles can be visualized in both in vitro and in vivo experiments due to the biocompatible PEG coating and fluorescent probes. Additionally, the size range of these nanoparticles render them an ideal candidate for probing the glycocalyx without disrupting normal vasculature function, which may lead to improved delivery and therapeutics.

We describe a method of synthesizing biocompatible 10-nm gold nanoparticles, functionalized by coating poly-ethylene glycol onto the surface. These particles can be used in vitro and in vivo for delivering therapeutics to nanoscale cellular and extracellular spaces that are difficult to access with conventional nanoparticle sizes.

Synthèse des fonctionnalisées 10 nm revêtement polymère des particules d’or pour le ciblage de l’endothélium et MEDICAMENTS

Gold nanoparticles (AuNPs) have been used extensively in medical research due to their size, biocompatibility, and modifiable surface. Specific targeting ...

Assembly and Characterization of Biomolecular Memristors Consisting of Ion Channel-doped Lipid Membranes

The ability to recreate synaptic functionalities in synthetic circuit elements is essential for neuromorphic computing systems that seek to emulate the cognitive powers of the brain with comparable efficiency and density. To date, silicon-based three-terminal transistors and two-terminal memristors have been widely used in neuromorphic circuits, in large part due to their ability to co-locate information processing and memory. Yet these devices cannot achieve the interconnectivity and complexity of the brain because they are power-hungry, fail to mimic key synaptic functionalities, and suffer from high noise and high switching voltages. To overcome these limitations, we have developed and characterized a biomolecular memristor that mimics the composition, structure, and switching characteristics of biological synapses. Here, we describe the process of assembling and characterizing biomolecular memristors consisting of a 5 nm-thick lipid bilayer formed between lipid-functionalized water droplets in oil and doped with voltage-activated alamethicin peptides. While similar assembly protocols have been used to investigate biophysical properties of droplet-supported lipid membranes and membrane-bound ion channels, this article focuses on key modifications of the droplet interface bilayer method essential for achieving consistent memristor performance. Specifically, we describe the liposome preparation process and the incorporation of alamethicin peptides in lipid bilayer membranes, and the appropriate concentrations of each constituent as well as their impact on the overall response of the memristors. We also detail the characterization process of biomolecular memristors, including measurement and analysis of memristive current-voltage relationships obtained via cyclic voltammetry, as well as short-term plasticity and learning in response to step-wise voltage pulse trains.

Soft, low-power, biomolecular memristors leverage similar composition, structure, and switching mechanisms of bio-synapses. Presented here is a protocol to assemble and characterize biomolecular memristors obtained from insulating lipid bilayers formed between water droplets in oil. The incorporation of voltage-activated alamethicin peptides results in memristive ionic conductance across the membrane.

Assembly and Characterization of Biomolecular Memristors consistant en des Membranes lipidiques dopé au canal ionique

The ability to recreate synaptic functionalities in synthetic circuit elements is essential for neuromorphic computing systems that seek to emulate the ...