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1。マウスの心臓からミトコンドリアの単離<ol><li>心臓がミトコンドリア単離するためには、あなたの地元の施設内動物のケアと使用委員会によって承認された手順に従って、マウスを麻酔し、生け贄に捧げる。 </li></ol> 注：ミトコンドリア単離プロトコルのすべてのステップは、氷上で行う必要があります。氷冷緩衝液及び予冷ペトリ皿、ファルコンチューブ、エッペンドルフチューブを使用しています。プロトコルで指定されたボリュームは2マウスの心臓を含むサンプル用です。 <ol start="2"><li> 、心を取り除く冷たいミトコンドリア単離緩衝液（300 mMスクロース、10mMのNa-HEPES、200μMのEDTA、pH7.4）に置き、血を洗い流す。 </li></ol> 注：最適な結果を得るためには、ミトコンドリアの緩衝液のpHをKOHと酢酸で調整する必要があります。 <ol start="3"><li>冷たいペトリ皿の上に置いて心が、脂肪と心房を削除して、取得するまで、ブレードを使用して細かくミンチ均質な製品をING。 </li><li> 50mlのFalconチューブにみじん切りにした心を移し、0.1 mg / mlのトリプシンを用いてミトコンドリア単離緩衝液10mlを加え、サンプルを氷上で10分間消化することができます。 </li></ol> 注：分離手順中にトリプシンが単離されたミトコンドリアの収率を増加させ、ミトコンドリアの準備の間に一定に保つ必要があります。我々は、単離された調剤のミトコンドリアの機能をテストすると、酵素が機能を妨害しないことを保証するためにトリプシンの不在であることをお勧めします。 <ol start="5"><li> 0.1パーセント脂肪酸フリーBSAおよび5 mgのトリプシンインヒビター（大豆）とミトコンドリア単離緩衝液10mlを加え、トリプシンを中和するためにチューブを転倒数回混ぜる。 </li></ol> 注：ミトコンドリア単離緩衝液を予め用意することができ、-20℃で保存することができます解凍時のpHをチェックしてください。トリプシン、トリプシンインヒビターまたはBSAがなければなりません実験当日のミトコンドリア分離バッファへdded。 <ol start="6"><li> 4℃で1分のために低〜中速の遠心分離によって消化された組織を回復</li><li>再懸濁し、0.1パーセント脂肪酸フリーBSAで8ミリリットルミトコンドリア単離緩衝液における組織とテフロン乳棒（1,200-14,00 rpmで4月6日経過）と電動ダウンスホモジナイザーを用いてホモジナイズする。ホモジナイズしながらサンプルを氷上に保つ。 </li><li> 4℃で10分間800xgで15mlファルコンチューブと遠心分離機にホモジネート転送℃でペレット核や組織片へ。 </li><li> 4時15分、℃、8,000 xgでエッペンドルフチュー​​ブと遠心分離機にミトコンドリアを含む上清を回収</li><li>慎重に上部白層を除去し、1mlのミトコンドリア分離バッファ内のミトコンドリアを含む残りの濃いペレットを洗浄する。 </li><li> 4℃で15分間8000xgで遠心℃、 150μlのミトコンドリアイゾラ清と再懸ミトコンドリアペレットを捨てるるバッファ。さらなるアッセイのための氷の上でミトコンドリア保つ。 </li></ol> 注：機能アッセイ時の最良の結果を得るためには、分離の4時間以内にミトコンドリアを使用しています。 <ol start="12"><li>ブラッドフォードアッセイを用いてミトコンドリアタンパク質を定量化する。 </li></ol> 2。単離されたミトコンドリアの品質管理 2.1。呼吸調節率（RCR）の測定<ol><li>最大酸素ラインを確立するために空気飽和水でOxytherm酸素電極を校正します。酸素の安定レベルはゼロ酸素ラインを確立するために、新たに調製し、10mMの亜硫酸ナトリウム溶液100μlを加えたとき。 30℃で測定を実行</li><li>チャンバーを密閉、Oxytherm室に1μMのロテノンで2mlミトコンドリア呼吸Bufferを（125のKCl、20mMのHEPES、3mMのMgCl 2、400μMのEGTA、300μMのDTT、5mMのKH 2 PO 4、pH7.2）に追加とスタートrecor鼎。 </li><li>酸素信号が安定していれば、1分間250μgのミトコンドリアとレコード基底呼吸を追加します。ミトコンドリアは内在性基質（状態1呼吸）で呼吸するされるこの時点で呼吸が非常に低くなければならない。 </li><li> 5mMのコハク酸と1分間記録信号を追加します。酸素消費量は、状態2呼吸の間に増加する必要があります。 </li><li> 150μMのADPを追加することで、状態3呼吸を誘導する。この時点で、酸素消費量で酸化的リン酸化によるATP合成のために増加する必要があります。記録信号呼吸がADP消費と4呼吸の状態への遷移を示して、遅くまで。少なくとも1分間レコードの状態4呼吸。 </li><li> 1μMのCCCPと1分間記録信号を追加します。切り離さ呼吸は最大でなければならない。 </li></ol> 注：ミトコンドリアの呼吸にCCCPの効果は用量依存性である：CCCPの高濃度の酸素消費量を抑制することができるので、慎重にトンでなければなりませんitrated。 <ol start="7"><li>状態4呼吸時の酸素消費率で状態3呼吸時の酸素消費速度を分割することによって呼吸調節率（RCR）を計算します。ターゲットRCRは≥4でなければなりません。 </li></ol> 2.2。ミトコンドリア膜の完全性の評価（ シトクロム c 試験 ） <ol><li>徹底的に70％エタノールと水との手順を繰り返し2.1.2 -2.1.4とOxytherm室を洗う。 </li><li> 1mMのADPおよび1分間のレコード酸素消費量を追加します。 </li><li> 10μMのシトクロムcを追加します。シトクロムcが無傷ミトコンドリアの膜に不浸透性であるので、呼吸の増加が故障または破損してミトコンドリア膜を示しています。 </li></ol> 3。ミトコンドリア透過性遷移孔の開口部の測定<ol><li> mtPTP開口部のマルチパラメータ測定用の蛍光分光光度計を設定します。 FelixGxプログラムを使用して、新しいハードウェア構成（クアンタマスター着実STAを作成TE）は、光源、励起分光器、試料室および励起分光器（ 図4）に対して90°と270°に位置する2つの検出器を含む。最大時間分解能を達成するために、両方の発光分光器（90°、270°）に無効とサンプルコンパートメントで90°と270°での発光フィルタは、ハードウェア構成のメニューで有効にする必要があります。このステップでは、発光波長のモータ制御を削除し、特定の波長で各単色光分光器を修正します。発光分光器が無効になっていない場合は、各検出器は波長と重複測定の両方の間でサイクルが記録されます。 </li><li>マルチ染料タイプを使用して新しい取得プロトコルを作成し、次の染料のように入力します。 <ul><li>フラ（高Ca + +）：励起340 nmで発光525 nmの（検出器1） </li><li>フラ（低Ca + +）：励起は380nm、発光525nmの（検出器1） </li><li> JC1（集約）：励起543 nmの、放出595nmの（検出器2） </li><li> JC1（モノマー）：励起498 nmであり、放出52​​5nmの（検出器1） </li><li>腫れ：励起525 nmであり、放出52​​5nmの（検出器1） </li></ul></li><li> 37℃に1 nmの励起および発光スリットと温度を設定</li><li>フラとJC-1のレシオメトリック信号を得るために、2つの派生トレースを生成：フラ（高Ca + +）/フラ（低Ca + +）とJC1（集計）/ JC1（モノマー）。 </li><li>それぞれ手動で、検出器1と2から525 nmと595 nmの発光波長を調整します。 </li><li> 1μMのロテノン、5mMのコハク酸、800 nMの使い捨ての4面でフラFFで1ミリリットルミトコンドリアアッセイ緩衝液（120mMのKCl、10mMのNaCl、1mMのKH 2 PO 4、20mMのHEPES-トリス、pH 7.2）を混ぜてメタクリレートキュベット。サンプルコンパートメントに250μgのミトコンドリアと場所のサンプルを追加します。マグネチックスターラーの電源がオンになっていることを確認します。 </li><li>記録を開始します。 1分後、買収を一時停止し、500nMのJC-1を追加してから再起動cquisition。 JC-1の比信号は、アクティブなミトコンドリアによる色素の取り込みを示し、増加する必要があります。 JC-1は信号がプラトー（通常は5分以内）に達するまで、記録を続けます。 </li><li> 20μMのCaCl 2を追加します。フラのFF比信号の瞬間的増加はミトコンドリアCa 2 +取り込みに起因する漸進的な減少が続いアッセイ緩衝液中で増加したCa 2 +の存在によって観察されるべきである。 JC-1の比信号はわずかミトコンドリア膜の脱分極を示す簡潔な一時的減少を示すべきである。 </li><li>基礎レベルの前に別のCaCl 2のパルス（1〜1.5分）のほかにフラFFの比信号が戻るまで待ちます。ミトコンドリアのCa 2を蓄積できなくなるまで、一定の間隔で脈打つ続ける+と+アッセイバッファーへのCa 2を放出し始める。 mtPTP開口部はCa 2 +放出、膜poteに起因するJC-1の信号比が減少したことにより、フラFFの比率信号の同時増加によって可視化されるntial崩壊、ミトコンドリアの膨張に起因する光散乱が減少します（ 図5）。 </li><li> mtPTP活性化に続いて、1mMのEGTA、1μMCCCP及び5μg/ mlのアラメチシンでそれぞれフラFF、JC-1や腫れ信号の特異性を確認します。 </li><li>シクロフィリンD阻害剤シクロスポリン（サイクロフィリンDはmtPTPのコンポーネントである）を1μMの存在下で3.9 - mtPTP開口部の特異性を確認するには、手順3.6を繰り返します。シクロスポリンの存在下では、mtPTPを開くと、対照試料（ 図6）よりもはるかに多くのCaCl 2のパルスを必要とします。 </li></ol> 4。代表的な結果 図2は、単離ミトコンドリアマウス心臓の典型的な呼吸制御を示しています。状態3呼吸はコハク酸でミトコンドリア呼吸するにADPを添加することによって達成され、substraに関して有意に増加した酸素消費量によって特徴付けられる単独でTE。追加されたADPの枯渇は、酸素消費量が低下し、事前のADP添加達成率に匹敵し、その間状態4呼吸を開始する。 RCRは状態4呼吸のそれによって状態3呼吸のための酸素消費速度を割ることによって得られる。 シトクロム c試験は、アッセイミトコンドリア外膜の完全性を目的に使用されます。 シトクロム cコハク酸とADP、観察される呼吸においてさらなる増加にミトコンドリアが呼吸するに追加されたときに、無傷のミトコンドリア外膜（ 図3）を示す。 ミトコンドリア単離心臓でmtPTP開口するための代表的なイメージは、 図4に示されている。この場合mtPTP開口部は1.5分間隔で4 CaCl 2のパルス（20μMずつ）を添加することによって引き起こされた。 mtPTP開口部は、ミトコンドリアCa 2 +のほぼ同時リリース+（フラのFF比信号の増加）、mitochondの崩壊によって明らかであるリアル膜電位（JC-1の比信号の減少）と増加したミトコンドリアの体積（腫れ信号の減少）。 mtPTPのシクロフィリンD成分に結合する、追加されたとき、シクロスポリン、mtPTP開口部は7 CaCl 2のパルスの代わりに4（ 図5）が必要です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig1.jpg" /> 図1：ミトコンドリア単離心臓用のマルチパラメータミトコンドリア透過性遷移孔の開口プロトコルのフロー· ​​チャート。心臓はマウスから採取され、ミトコンドリアは、差動遠心分離により分離されています。ミトコンドリアの調製物を定性的にシトクロム cの存在下で呼吸調節率およびミトコンドリア膜無傷のポーラログラフ測定によって評価されます。単離されたミトコンドリアにおけるミトコンドリア透過性遷移孔の開口部は、シーケンシャルCACによってトリガされます2リットルの追加およびCa 2 +のミトコンドリアマトリックスのミトコンドリア膜電位の崩壊や腫れからの放出を監視することにより、蛍光分光光度計を用いて測定される。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig2.jpg" /> 図2の測定 ミトコンドリア単離心臓の呼吸調節率（RCR）。ミトコンドリア単離心臓の酸素消費量は状態3コハク酸とADPの存在下で、呼吸、およびADP消費後の状態4呼吸時の間に測定される。脱共役剤に単離されたミトコンドリアの応答はCCCPの添加により測定されます。グラフ上の数字は、nmol /分/ mgタンパク質の単離されたミトコンドリアによる酸素消費の料金です。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig3.jpg" /> 図3測定<html>ミトコンドリア単離心臓の膜完全性のリーメント。ミトコンドリア膜の完全性は、コハク酸とADPの存在下およびシトクロム cの添加後に分離したミトコンドリアの酸素消費量を測定することによって決定される。グラフ上の数字は、nmol /分/ mgタンパク質の単離されたミトコンドリアによる酸素消費の料金です。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig4.jpg" /> mtPTP開口部のマルチパラメータ測定については、 図4。光度計のハードウェア構成。蛍光分光光度計のハードウェア構成は、光源、励起モノクロメータ、試料室および525 nmと595 nmで一定の発光波長を持つ2つの検出器を含む。検出器1はフラFFのハイとローのCa 2 +、JC-1モノマー、腫れ信号の信号検出に使用されます。検出器2は、JC-1は集約信号を測定します。 jove_content &quot;のfo：キープtogether.withinページ=&quot; always &quot;を&gt; <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig5.jpg" /> 図5ミトコンドリア単離心臓でmtPTP開口のマルチパラメータ測定。 mtPTP開口部は、20μMのCaCl 2およびミトコンドリア、ミトコンドリア膜電位の崩壊からのCa 2 +放出をすることによって特徴付けられ、ミトコンドリアマトリックス容積（腫れ）が増加したの逐次付加によって引き起こされました。ミトコンドリア外のCa 2 +および膜電位は、レシオメトリック指標フラFF（緑のトレース）とJC-1（赤線）を用いて測定した。ミトコンドリアの膨潤が525ナノメートル（黒いトレース）での光散乱を記録することにより測定した。 JC-1や腫れ信号の特異性は、1μMのCCCP及び5μg/ mlのアラメチシン（微生物毒素）でテストされています。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig6.jpg" /> 図6マルチシクロスポリンAシクロスポリン（1μM）の存在下でミトコンドリア単離心臓でmtPTP開口部のパラメータ測定は、単離ミトコンドリア中心にmtPTPを開くのに必要なCaCl 2のパルス数を増加させます。

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A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+transition+pore+controls+cardiac+mitochondrial+maturation+and+myocyte.">The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte.</a> 21, 469-478 (2011).</li><li>Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">What is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).</li><li>Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. L., O'Rourke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+Ca2++influx+and+efflux+rates+in+guinea+pig+cardiac+mitochondria:+low+and+high+affinity+effects+of+cyclosporine+A.">Mitochondrial Ca2+ influx and efflux rates in guinea pig cardiac mitochondria: low and high affinity effects of cyclosporine A.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1813, 1373-1381 (2011).</li><li>Saks, V. A., Kuznetsov, A. V., Kupriyanov, V. V., Miceli, M. V., Jacobus, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creatine+kinase+of+rat+heart+mitochondria.+The+demonstration+of+functional+coupling+to+oxidative+phosphorylation+in+an+inner+membrane-matrix+preparation.">Creatine kinase of rat heart mitochondria. 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T., Rosenfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-+and+tissue-specific+relationships+between+mitochondrial+permeability+transition+and+generation+of+ROS+in+brain+and+liver+mitochondria+of+rats+and+mice.">Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice.</a> Am. J. Physiol. 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特別な利害関係は宣言されません。

ここで紹介するプロトコルはミトコンドリア単離心臓（ 図1および図4）に透過性遷移孔の開口部を評価するために必要な実験手順を説明します。マウス心臓ミトコンドリアを単離するための手順を、それらの整合性と機能性を確保呼吸のコントロールは、ミトコンドリアのパラメータが中に監視mtPTP開口部とその測定に用いる染料、蛍光分光計測器のセットアップ、?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td>トリプシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T3030 </td></tr><tr><td>トリプシンインヒビター（大豆） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T9128 </td></tr><tr><td>ヒドロ亜硫酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 71699 </td></tr><tr><td>ロテノン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> R8875 </td></tr><tr><td> シトクロム c </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C7752 </td></tr><tr><td>アラメチシン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A4665 </td></tr><tr><td> CCCP </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> C2759 </td></tr><tr><td>シクロスポリン</td><td>カルビオケム</td><td> 239835 </td></tr><tr><td>フラFF </td><td>インビトロジェン</td><td> F14180 </td></tr><tr> &lt;TD&gt; JC-1 </td><td>インビトロジェン</td><td> T3168 </td></tr><tr><td>テフロン乳棒15mlで組織グラインダーポッターエルベージェム</td><td>ウィートンインダストリーズ</td><td></td></tr><tr><td>オーバーヘッドスターラー</td><td>ウィートンインダストリーズ</td><td> 903475 </td></tr><tr><td> Oxytherm（温度制御された酸素極） </td><td> Hansatechインスツルメンツ</td><td></td></tr><tr><td> QuantaMaster 80デュアルエミッション蛍光分光光度計</td><td>フォトンテクノロジーインターナショナル、Inc。 </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria

ミトコンドリア透過性遷移孔（mtPTP）が1.5 kDaのより小さい分子量を有する溶質を輸送するためにミトコンドリア内膜で形成し、非特定のチャンネルです。細孔の決定的な分子的同一性が議論中であるが、そのようなシクロフィリンD、VDACとANTのようなタンパク質は、形成をmtPTPに貢献します。細胞死におけるmtPTP開口部の関 ​​与は十分に1を確立されている間、累積証拠はmtPTPは、ミトコンドリアのCa 2 +恒常性2、バイオエナジェティックスと3シグナル伝達レドックス中に生理的な役割を果たしていることを示しています。 mtPTP開口部はマトリックスのCa 2 +が、その活性は、酸化ストレスなどのいくつかの他の要因によって変調することができ、アデニンヌクレオチド枯渇、Piの高濃度、ミトコンドリア膜の脱分極や脱共役、および長鎖脂肪酸酸4。 インビトロ 、mtPTPによってトリガされる開口部は、ACHすることができますCa 2 +の外因性の追加（カルシウム保持能力）を介してミトコンドリアのマトリックス内のCa 2 +濃度を増加させることによりieved。 のCa 2 +レベルのミトコンドリア内部の特定のしきい値に達したときに、mtPTPが開き、のCa 2 +放出を容易にする 、プロトン駆動力の損失、膜電位が崩壊し、最終的に破裂につながるミトコンドリアマトリックス容積（腫れ）の増加ミトコンドリア外膜およびオルガネラ機能の不可逆的な損失。 ここでは、単離ミトコンドリアマウス心臓におけるmtPTP開口部の総合的な特性評価を可能にする蛍光分析について説明します。ミトコンドリアのCa 2 +ハンドリング（取り込みと放出は、Ca 2によって測定されたアッセイ培地中+濃度）、ミトコンドリア膜電位、及びmitocho：アッセイはmtPTP開口部が発生したときに変更されている3つのミトコンドリアのパラメータの同時測定を含むndrialボリューム。アッセイ培地とミトコンドリア膜電位のCa 2 +測定を採用染料はフラFF、膜透過性は、Ca 2 +の存在下で励起波長のシフトを受けるレシオメトリックインジケータ、JC-1は、カチオン性であり、それぞれ、低域と高膜電位でグリーンモノマー又は赤凝集体を形成レシオメトリックインジケータ。ミトコンドリアの体積の変化はミトコンドリア懸濁液による光散乱を記録することによって測定されます。高品質で機能的なミトコンドリアがmtPTP開アッセイに必要とされるため、我々はまた、無傷ミトコンドリア、高度に結合されており、機能的な孤立した心を得るために必要な手順について説明します。

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Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

単離ミトコンドリアマウス心臓におけるミトコンドリア透過性遷移孔の開口部を測定するための分光蛍光プロトコルがここに提示されます。アッセイは、ミトコンドリアCaの同時測定を含む<sup&gt; 2 +</sup&gt;ハンドリング、ミトコンドリア膜電位およびミトコンドリアボリューム。ミトコンドリアは、高品質で機能的な心臓を取得するための手順も記載されている。

単離ミトコンドリアマウス心臓における透水性遷移孔の開口部のマルチパラメータ測定

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

multi-parameter-measurement-permeability-transition-pore-opening

Research

JoVE Journal

Biology

21.4K ビュー.  University of Washington, Seattle. 単離ミトコンドリアマウス心臓におけるミトコンドリア透過性遷移孔の開口部を測定するための分光蛍光プロトコルがここに提示されます。アッセイは、ミトコンドリアCaの同時測定を含む 2 +ハンドリング、ミトコンドリア膜電位およびミトコンドリアボリューム。ミトコンドリアは、高品質で機能的な心臓を取得するための手順も記載され...

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Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

ミトコンドリアは密結合のラットの心臓の準備

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

生物学

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

シングルミトコンドリアスーパーオキシド無傷ハートや点滅の共焦点イメージング<em&gt;インビボ</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

単離された血液灌流ラットの肺の準備にシングル微小血管透過性を定量化する

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

浸透水透過係数（Pの測定<sub&gt; F</sub&gt;）球状細胞の：例として単離された植物プロトプラスト

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

単離されたミトコンドリアのフローサイトメトリーによる外膜タンパク質の免疫検出

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

薬理研究に単離された組織のバース·アプリケーションにおける平滑筋機能の測定

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウスの骨格筋の最小量からミトコンドリアの単離

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

単離されたワーキングラット心臓におけるグルコースおよび脂肪酸酸化の宿泊料金を決意するための方法

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

マウス単離された灌流腎臓テクニック

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found responsible for very diverse diseases, ranging from neurological pathologies to cancer. Interestingly, mitochondria have recently been shown to display the capacity to be transferred between cell types, notably from human mesenchymal stem cells (MSC) to cancer cells in coculture conditions, with metabolic and functional consequences for the mitochondria recipient cells, further enhancing the current interest for the biological properties of these organelles.
Evaluating the effects of the transferred MSC mitochondria in the target cells is of primary importance to understand the biological outcome of such cell-cell interactions. The MitoCeption protocol described here allows the transfer of the mitochondria isolated beforehand from the donor cells to the target cells, using MSC mitochondria and glioblastoma stem cells (GSC) as a model system. This protocol has previously been used to transfer mitochondria, isolated from MSCs, to adherent MDA-MB-231 cancer cells. This mitochondria transfer protocol is adapted here for GSCs that present the specific particularity of growing as neurospheres in vitro. The transfer of the isolated mitochondria can be followed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and confocal imaging using mitochondria vital dyes. The use of mitochondria donor and target cells with distinct haplotypes (SNPs) also allows detection of the transferred mitochondria based on the concentration of their circular mitochondrial DNA (mtDNA) in the target cells. Once the protocol has been validated with these criteria, the cells harboring the transferred mitochondria can be further analyzed to determine the effects of the exogenous mitochondria on biological properties such as cell metabolism, plasticity, proliferation and response to therapy.

Here, a protocol (MitoCeption) is presented to transfer mitochondria, isolated from human mesenchymal stem cells (MSC), to glioblastoma stem cells (GSC), with the goal of studying their biological effects on GSC metabolism and functions. A similar protocol can be adapted to transfer mitochondria between other cell types.