この言葉は、マウスの骨格筋からミトコンドリアを処理する際の呼吸分析を表しています。このプロトコルにより、精製時間が大幅に短縮され、複数のサンプルを同時に処理できます。ユナイテッドバックグラウンドの任意の8つの性別の動物由来のミトコンドリアは、このプロトコールを使用して切断することができ、多種多様な実験条件下での呼吸の研究を可能にする。
この方法は、加齢、薬物検査、癌、または発達を含むミトコンドリア機能が関連するすべての研究分野に適しています。他の組織や生物にも適応させることができます。ミトコンドリアを損傷から保護するために、手順中にすべてを氷の上に置き、すべての材料が冷たいことを確認してください。
1サンプルあたり3つの50ミリリットルのビーカーを氷の上に置き、ビーカー1つに10ミリリットルのPBS、ビーカー2に10ミリモルEDTA PBSを10ミリリットル、ビーカー3に4ミリリットルのIB1を加えます。安楽死させたマウスの右後肢に70%エタノールをスプレーして毛皮が脱落するのを防ぎ、四肢をコルク解剖板にテープで固定し、左前肢をテープで固定します。膝からつま先までの皮膚を通して滅菌使い捨てメスで切開を行います。
足首の高さで歯付きの鉗子で皮膚をつかみ、足首の周りを細かいはさみで切ります。片手に細かい先端ピンセットで皮膚を下層の筋肉組織から離し、もう片方の手に歯付きの鉗子で引き上げます。足首から膝までのすべての骨格筋を解剖し、細かいピンセットとハサミを使用して脛骨前筋上のすべての結合組織を除去します。
伸筋桁長筋の4つの遠位腱を見つけ、つま先の挿入の近くにそれらを切断する。脛骨前遠位腱を見つけ、足首の下の挿入の近くで切断する。足首の上の脛骨前部と伸筋桁長腱を引っ張って、緩んだ端を解放します。
腱の緩んだ端をつかみ、筋肉を引き上げることによって骨の他の筋肉組織から筋肉を緩めます。これらの筋肉の近位腱を膝蓋骨にできるだけ近づけて切断する。マウスを逆さまにして、腓腹筋とヒラメの筋肉の抽出を進めます。
上腕二頭筋、大腿骨、腓腹筋の間に形成されたポケットをつかみ、細いはさみを使ってこれらの筋肉を分離して近位腱を視覚化します。遠位アキレス腱を細かいハサミで掴んで慎重に切ります。近位腓腹筋腱を切断し、下層のヒラメでそれを解放する。
残りの筋肉を慎重に解剖し、マウスを初期位置に再固定して大腿四頭筋を解剖します。脂肪組織を捨て、大腿四頭筋と大腿骨の間に細かいピンセットを挿入して、筋肉を骨から分離します。遠位大腿四頭筋腱をつかみ、膝蓋骨にできるだけ近づけて腱を切断する。
大腿四頭筋を引き上げ、近位挿入時に細かいはさみで解放します。左後肢についても同じことを繰り返します。すべての筋肉をビーカーで1つ、次に2つ、続いてビーカー3つをすすいでください。
最後に、ビーカー3のすべての筋肉を氷の上の鋭いはさみでミンチにします。懸濁液をCチューブに移し、しっかりと閉じ、ホモジナイザーのスリーブに逆さまに取り付けます。ホモジネートを2本の2ミリリットルの予め冷却したマイクロ遠心管に分割し、10分間遠心分離する。
その後、上清を新しい予め冷却したチューブに移し、さらに10分間遠心分離する。ペレットを500マイクロリットルのIB2に混ぜ合わせ、上清を新しい2ミリリットルの予め冷却されたマイクロ遠心管に移し、それを上清番号2またはSN2としてラベル付けする。最終ミトコンドリアペレットを200マイクロリットルの再懸濁緩衝液に再懸濁する。
タンパク質定量のために10マイクロリットルを素早く取っておき、損傷を防ぐために残りのミトコンドリア懸濁液に10マイクロリットルの10%FFA BSAを直ちに加える。濃縮ミトコンドリア懸濁液を摂氏4度で10分間、500回Gで遠心分離する。ミトコンドリアペレットを、実施するプロトコールに応じて、BSAを有する1X結合アッセイ培地、BSAを有する1X電子流アッセイ培地、またはBSAを有する1Xβ酸化培地の100マイクロリットルに再懸濁する。
この濃縮ミトコンドリアサンプルを、対応するアッセイ培地を用いて1マイクロリットルあたり0.2マイクログラムに希釈する。種子を1ウェルあたり50マイクロリットルの懸濁液を氷上で予め冷却した24ウェルマイクロプレートに入れた。バックグラウンド補正ウェルに、対応するアッセイ培地のみを添加する。
残りのミトコンドリア懸濁液をマイナス80°Cに保存して、断片化純度を測定します。マイクロプレートを予めチルドした分取遠心分離機で20分間回転させる。その間、残りのアッセイ培地を摂氏37度に加温する。
遠心分離後、マイクロプレートをベンチに5分間放置して平衡化します。ミトコンドリアの剥離を避けるために、ウェルあたり450マイクロリットルの温かいアッセイ培地をゆっくりと慎重に加える。マイクロプレートを蓋のない酸素消費量測定器に直ちに入れ、測定プログラムを起動します。
最初のステップがマイクロプレートをウォームアップできるように10分間のインキュベーションであることを確認してください。実験が終了したら、カートリッジとマイクロプレートを取り外し、機器の電源を切り、分析を開始します。連続遠心分離によって得られた異なる画分からの一般的なタンパク質プロファイルは、単離された画分において別個のタンパク質集団を示した。
すべてのミトコンドリア含量の存在は、外側および内側のミトコンドリア膜および核会合タンパク質のマーカーに対する強いシグナルによって明らかである。フラクションNは、核および未破壊物質を表す。SN1またはSN2画分中の小胞体、原形質膜、または細胞質マーカーの大部分は、単離中に得られる高純度を強調する。
酸素消費量の増加は、カップリングおよびベータ酸化アッセイにおけるADP添加後に観察された。カルボニルシアン化物-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン添加後、酸素消費量は最高レベルに達した。低い呼吸制御比は、単離されたミトコンドリアの完全性を保証する。
電子フローアッセイは、特定の基質および阻害剤の注入を介して、電子輸送鎖複合体の活性を個々にまたは組み合わせて調べた。孤立ミトコンドリアは非常に敏感です。したがって、組織緩和後のすべてのステップは、その生存率を維持するために勤勉かつ慎重に行う必要があります。
実験アッセイは、主要なミトコンドリア分子の決定論的セマティック分析、または青色天然ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた呼吸数測定複合体の集合の研究によって補完することができます。
