この作品は、国立衛生研究所（AI050677、HD-051998、およびGM103433）、マルコム·ファイスト心臓血管研究フェローシップ、アメリカ心臓協会博士号を取得する前のフェローシップ（10PRE4200007）からの補助金によって支えられている。

1。ゼラチンコートしたカバーガラスの作製<ol><li>滅菌したプラスチック製100 mmディッシュ（ES）の場所は、酸洗浄したカバーグラス（直径15ミリメートル）。皿あたり8から9カバーガラスを置き、彼らがお互いに触れたり、お皿の両側いないことを確認してください.. </li></ol> 注：カバーガラス、針やピンセットは可能混入微生物、ならびに運動性を含む細胞機能に影響を与えるでしょうエンドトキシンを除去するために滅菌する必要があります。 <ol start="2"><li>ゼラチン粉末を秤量し、0.5 g/300 mlの最終濃度とゼラチン溶液を作るために、脱イオン水に粉体を懸濁します。次に、ゼラチン溶液は、オートクレーブ滅菌する必要があります。 </li><li>各カバースリップ上にゼラチンのピペット2〜3滴（〜100〜150ミリリットル）。 </li></ol> 注：ゼラチンは皿に触れたり、皿からカバーガラスを削除することはできませんがないようにしてください。 <ol start="4"&gt; <li> 10分間90℃のオーブンで100 mmディッシュでゼラチンコートしたカバーガラスを焼く。 </li><li>穏やかにピペッティングすることによって過剰ゼラチンを削除します。 </li><li> 45分間、70℃のオーブン中で100 mmディッシュ°Cでカバースリップを乾かします。 </li><li>一度乾燥、滅菌、エンドトキシンフリーの針とピンセット（針が優しく除去するために軽くピンセット用アクセスできるようにするためにカバースリップをナッジするために使用されます）を使用して100 mmディッシュからカバーガラスを削除します。 </li><li> 24ウェル皿の別々のウェルに、個々のゼラチンコートしたカバーガラスを置きます。 </li></ol> 2。金コロイドで被覆されたカバーガラスの作製<ol><li>塩化金酸（テトラクロロ金酸三水和物; HAuCl 4·3H 2 O）の適切な量を計量してから、最後の14.5 mMの溶液（毒性）を調製し、無菌の脱イオン水に懸濁します。 8月9日カバースリップあたりの溶液1.5mlを準備します。 </li></ol> 警告：塩化金酸はHであり、ひと抱え飲み込んだ場合は、重篤な皮膚の薬傷·眼の損傷を引き起こし、アレルギー性​​皮膚反応を引き起こす可能性があります。飲み込むと有毒。 <ol start="2"><li>クエン酸ナトリウム適量（三ナトリウム二水素2 -ヒドロキシ-1,2,3 -トリカルボン酸;のNa 3 C 6 H 5 O 7）を計量し、その後、最終0.5％溶液を作るために脱イオン水に粉体を懸濁します。 8月9日カバースリップあたり溶液1mlを準備します。 </li></ol> 警告：クエン酸ナトリウムは、目や皮膚に炎症を起こすことがあります。また、呼吸器や消化管の炎症を引き起こす可能性があります。 <ol start="3"><li>滅菌、エンドトキシンフリーのビーカーに無菌14.5 mMのHAuCl 4溶液および滅菌脱イオン水13.5ミリリットルの1.5ミリリットルを組み合わせ、その結果はかすかな黄色溶液が得られるはずです。前述のボリュームが作られている8月9日、金コロイドのカバーが可能になる。 </li><li>連続的に撹拌しながら、AがBに開始されるまで、ホットプレート上で溶液を加熱オイル。 </li></ol> 警告：蒸気は毒性/害を及ぼす可能性があるとして、溶液の加熱は、ドラフト内で行うべきである。蒸気は粘膜及び上気道の組織に破壊的である。 <ol start="5"><li>ホットプレートからビーカーを取り出します。 </li><li>撹拌しながら、0.5％クエン酸ナトリウム溶液0.7 mlを加える。前述のボリュームが作られている8月9日、金コロイドのカバーが可能になる。 </li><li>約2分間、この統合されたソリューションを撹拌しておく（注：溶液の色が徐々に最終的に赤ワインに到達する前に、深い紫色に、紫色、灰色に、クリアまたは、好ましくは、さび色に、淡い黄色から変更されます） 。本製品は、金コロイド溶液である。 </li><li> 1〜2分（金コロイド溶液が追加されたときに融解カバースリップ上にゼラチン層を維持するために）のために10ミリリットルピペット内の金コロイド溶液を冷却してからcolloidaの1.0〜2.0ミリリットルを追加以前に24ウェルディッシュ（ES）に置かれ、各ゼラチン被覆カバーガラス上にlの金溶液（あなたはゼラチンコートしたカバーガラスに追加した金コロイド溶液の量は、金粒子が溶液中に沈殿どれだけに依存する - を参照してください下のコメント欄）。 </li></ol> 注：金粒子の析出効率の変動があるかもしれないので、それが最初にゼラチンコートしたカバーガラスに金コロイド溶液0.5〜1 mlを加え、その後0.5時間インキュベーター内で24ウェル皿を置くことをお勧めします。このインキュベーション時間後、カバーはカバースリップ上の金粒子の適切な密度のために、光学顕微鏡下でチェックする必要があります。金粒子の低すぎるとあまりにも高濃度の例の20倍の顕微鏡写真を図1を参照してください。金粒子の理想的な濃度の40倍の顕微鏡画像（少なくとも単球と使用）については、 図2を参照してください。オプトインスライド上の金ナノ粒子のimal密度は、実験的に異なる細胞の特性はカバースリップ上に運動の強さが決まりますので、使用される各細胞型のために決定されるべきである。金粒子の濃度が不足している場合は、ゼラチンコートしたカバーガラスに金コロイド溶液の追加0.5〜1ミリリットルを追加します。 セルの大きさに応じて、金粒子の適切な濃度は変わることができると、このように最終的に運動性を検討し、セルのサイズに依存します。例えば、ヒト単球は小型の細胞（10月20日〜28ミクロン）であることと、金粒子の高い濃度は我々の分析では必須であった。金ナノ粒子の適切な配分を簡単かつ効率的に細胞のトラックのエッジを区別する能力を持つ研究者を提供しています。高すぎると、金粒子の濃度が正確に測定することが移動するとする細胞の能力を妨げる値が低すぎるものが運動能力の正確な軌道を描くことである金粒子の濃度はしばらくその運動、。 重要な注意：金ナノ粒子の合成に問題がある場合には、合成された金ナノ粒子が5〜400nmのサイズで市販されている。さらに、蛍光ミクロスフェアは、細胞の運動性29の研究にも使用されてきた。しかし、これらの微小球の使用は、細胞遊走の分析のための蛍光顕微鏡を必要とします。 <ol start="9"><li> 37℃インキュベーター中のコロイド金で覆われたカバーグラスで24ウェル皿を置き、1時間から一晩℃にインキュベートする。 </li><li>インキュベーション後、リンス/（PBS; pH7.4）で緩衝化生理食塩水、滅菌リン酸にカバースリップ（3X）を浸漬することによって結合していない金を削除します。 </li><li> PBSを含むクリーンな12ウェルディッシュ（es）は、これらのコロイド金でコーティングされたカバーガラスを置きます。 </li><li> 4℃まで、これらのカバーガラスを格納する準備（パラフィルム冷蔵庫に置く前板）を使用します。 </li></ol> 重要な注意：金粒子がカバーガラスから剥がれ落ち、できるだけ乾燥させた場合は、常に液体/メディアのいくつかのタイプに金コロイドコーティングしたカバースリップを保つ。金コロイドのカバーは、それらが作られた日付2から3ヶ月以内にご使用ください。 品質管理：単一phagokineticトラック運動アッセイでは、それは金粒子の同様の濃度によって特徴付けられるカバーグラスを使用することが重要です。この簡単なポイントは、治療ではなく、金コロイドコーティングしたカバーガラスの物理的性質の性質のみに起因するサンプル間の細胞運動性の定量的な違いを考慮するでしょう。我々は、金ナノ粒子の密度がある限りが等しいことが示されているが、我々は、個々の実験で同時に作られる唯一のカバーガラスを使用して好む、カバーガラスの使用異なる調製物から適切である。 3。細胞運動性の解析<ol><li>目的の細胞に適した細胞の培地中でコロイド金でコーティングされたカバーガラスを置きます。 </li><li> 24ウェルディッシュ（ES）に置かれた金コロイドコーティングしたカバーガラス上に適切に処理された細胞を転送</li></ol> 注：単一のウェルに移した細胞の数は、各細胞型が研究のために決定する必要があります。理想的には、細胞が均等に順番に単一のセルで作成されたトラックのみの統計的分析を可能とする金コロイドコーティングしたカバースリップ上で配布する必要があります。細胞があまりにも高濃度で播種している場合は、複数のセルの重複トラックが見られる可能性が高いことになります。重複トラックを正確に定量することはできませんし、従って、それらはテストされた細胞の動きの最終解析において考慮することができません。の結果として、トラックを重複複数のセルの関与は通常容易に観察される、2つ以上のセルが同じ連続クリアされた領域で観察することができる合併または交差トラック（分析の分野で）。 <ol start="3"><li> 37℃で24時間のためのC / 5％CO 2（または任意の適切な時間のために、我々は6時間と12時間の後処理で24時間、後処理と内皮細胞との間で単球の運動性を解析した例を参照 ）。細胞型が研究し、こうして実験的に各細胞型（ - 12時間の治療後の良い出発点は、しかし、6である）のために決定されるべきであると細胞運動性を決定し、測定するための最適な時間枠は異なります。 </li></ol> 注：実験コロイド金でコーティングされたカバースリップを後で保存および/ ​​または分析する必要がある場合、セルと金ナノ粒子は、カバーガラス上に固定する必要があります。この固定ステップを達成するために、以下のステップ3.3、最初の洗浄は1xで慎重に2回カバースリップPBSは（カバーガラスから金ナノ粒子の除去は避けなければならないようにカバーガラスを浸漬することが好ましい）、そのような室温3％パラホルムアルデヒドとのインキュベーションなどの標準的な細胞固定法を使用します。 15分間インキュベートした後、3％パラホルムアルデヒドを除去する必要があり、カバーガラスは、1x PBSで注意深く3回洗浄した。固定されたカバースリップを冷蔵庫に保存することができます。 <ol start="4"><li>光学顕微鏡を使用して、単一の可動セル（：確かに、調査中の細胞のタイプによって異なります携帯トラックの写真を撮るために使用される倍率注）によって作成されたトラックの画像をキャプチャします。コロイド金でコーティングされたカバースリップ上で非運動性と運動性の細胞によって作成された携帯電話のトラックの例を図2に示します。 </li></ol> 注：phagokineticトラック運動性アッセイで使用されるサイズの金ナノ粒子はセル30に対して完全に無毒であることが判明している。必要に応じて、調べた細胞の生存率はトリパンブルーで染色することによって評価または細胞生存の他のマーカーを調べることができます。一つは、このステップが実施する必要がある場合は、アカウントに固定等の固定、型の必要性を取らなければならないだろう。 <ol start="5"><li> ImageJのようなソフトウェア（自由に利用できるソフトウェア、使い方<a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ）またはNIHイメージ（ <a href="http://rsb.info.nih.gov/nih-image/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/</a>で開発）、両方を米国立衛生研究所（NIH）、またはImageToolを（ <a href="http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html" target="_blank">http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.htmlは</a> ）サンアントニオのテキサス健康科学センターによりクリアコロイド金の平均面積（任意の単位）の大学で開発された10から20以上のセル（サンプルあたり）撮影した画像から、各実験群のために決定される。統計情報は、トンでも実行でき彼は結果を収集した。たとえば、結果は平均±スチューデント実行t検定 、および&lt; のP値のサンプル間の統計的有意性の尺度として使用さ0.05の平均値の標準誤差（SEM）としてプロットすることができます。 図3および図4のステップは、セルでクリアコロイド金の面積の分析。 </li></ol>

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	<li>Armstrong, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+control+of+cell+motility+during+embryogenesis.">The control of cell motility during embryogenesis.</a> Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stop+and+go+traffic+to+tune+T+cell+responses.">Stop and go traffic to tune T cell responses.</a> Immunity. 21, 305-314 (2004).</li><li>Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+tissue+repair:+from+wound+healing+to+fibrosis.">Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).</li><li>Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+proteins+in+migration+and+invasion.">Polarity proteins in migration and invasion.</a> Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).</li><li>Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion:+integrating+cytoskeletal+dynamics+and+cellular+tension.">Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).</li><li>Mitchison, T. J., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin-based+cell+motility+and+cell+locomotion.">Actin-based cell motility and cell locomotion.</a> Cell. 84, 371-379 (1996).</li><li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments.">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112, 453-465 (2003).</li><li>Bretscher, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+membrane+flow+and+the+cytoskeleton+to+cooperate+in+moving+cells.">Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells.</a> Cell. 87, 601-606 (1996).</li><li>Albrecht-Buehler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagokinetic+tracks+of+3T3+cells.">The phagokinetic tracks of 3T3 cells.</a> Cell. 11, 395-404 (1977).</li><li>Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cytomegalovirus+induces+monocyte+differentiation+and+migration+as+a+strategy+for+dissemination+and+persistence.">Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence.</a> J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).</li><li>Palmisano, R., Itoh, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix+Metalloproteinase+Protocols.">Matrix Metalloproteinase Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 622, 379-392 (2010).</li><li>Ohta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOXD3-Overexpression+Increases+Integrin+Alpha+V+Beta+3+Expression+and+Deprives+E-Cadherin+while+It+Enhances+Cell+Motility+in+A549+Cells.">HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells.</a> Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).</li><li>Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+chemotactic+motility+and+trans-endothelial+migration+of+human+neutrophils+by+sphingosine+1-phosphate.">Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate.</a> FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).</li><li>Kawamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-WASP+and+WAVE2+acting+downstream+of+phosphatidylinositol+3-kinase+are+required+for+myogenic+cell+migration+induced+by+hepatocyte+growth+factor.">N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor.</a> J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).</li><li>Ando, Y., Jensen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+and+insulin-like+growth+factor+I+enhance+keratinocyte+migration.">Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration.</a> J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).</li><li>Todt, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+tumor+necrosis+factor-alpha+on+human+trophoblast+cell+adhesion+and+motility.">Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility.</a> Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).</li><li>McAuslan, B. R., Reilly, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cell+phagokinesis+in+response+to+specific+metal+ions.">Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions.</a> Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).</li><li>Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCMV+activates+PI(3)K+in+monocytes+and+promotes+monocyte+motility+and+transendothelial+migration+in+a+PI(3)K-dependent+manner.">HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner.</a> J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).</li><li>Smith, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+phosphatidylinositol+3-kinase+and+NF-kappaB+in+human+cytomegalovirus-mediated+monocyte+diapedesis+and+adhesion:+strategy+for+viral+persistence.">Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence.</a> J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).</li><li>Bentz, G. L., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CMV+infection+of+endothelial+cells+induces+an+angiogenic+response+through+viral+binding+to+EGF+receptor+and+beta1+and+beta3+integrins.">Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).</li><li>Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+EGFR+on+monocytes+is+required+for+human+cytomegalovirus+entry+and+mediates+cellular+motility.">Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).</li><li>Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCMV-Regulated+Paxillin+in+Monocytes+Links+Cellular+Pathogenic+Motility+to+the+Process+of+Viral+Entry.">HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry.</a> J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).</li><li>Turkevich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+nucleation+and+growth+processes+in+the+synthesis+of+colloidal+gold.">A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold.</a> Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).</li><li>Frens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+size+and+sol+stability+in+mental+colloids.">Particle size and sol stability in mental colloids.</a> Colloid &#38; Polymer Science. 250, 736-741 (1972).</li><li>Frens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+nucleation+for+the+regulation+of+the+particle+size+in+monodisperse+gold+suspensions.">Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions.</a> Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).</li><li>Zetter, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assay+of+capillary+endothelial+cell+migration.">Assay of capillary endothelial cell migration.</a> Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).</li><li>Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+method+for+the+production+of+gold+colloid+monolayers+for+use+in+the+phagokinetic+track+assay+for+cell+motility.">Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility.</a> Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).</li><li>Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+human+blood+monocyte:+two+subpopulations+with+different+sizes,+phenotypes+and+functions.">Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions.</a> Immunology. 77, 298-303 (1992).</li><li>Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+behavior+screen:+identification,+sorting,+and+enrichment+of+cells+based+on+motility.">A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility.</a> BMC Cell Biol. 6, 14 (2005).</li><li>Pan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+cytotoxicity+of+gold+nanoparticles.">Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles.</a> Small. 3, 1941-1949 (2007).</li><li>Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound-healing+assay.">Wound-healing assay.</a> Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).</li><li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes.">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li><li>Brooks, D. M., Brooks, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Invasion+Assay+Using+Matrigel(R).">In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R).</a> Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).</li><li>Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+DAPK+inhibits+cell+motility+by+blocking+the+integrin-mediated+polarity+pathway.">The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway.</a> J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).</li><li>Benazeraf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+random+cell+motility+gradient+downstream+of+FGF+controls+elongation+of+an+amniote+embryo.">A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo.</a> Nature. 466, 248-252 (2010).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

この記事で紹介phagokineticトラック運動性アッセイは、細胞遊走の定量分析のためのシンプルで非常に効果的な方法です。複数の細胞型が9月17日を分析することができるので、この方法は、複数の分野にまたがる広範な潜在的な用法を持っています。コロイド金コートしたカバーガラスの使用は、移動セルでクリアトラック領域の測定が可能になる。アッセイは、細胞の運動性で異な?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>カバーガラス（15ミリメートル） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 12-545-83 </td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン300ブルーム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G-1890 </td><td></td></tr><tr><td>テトラクロロ金酸三水和物</td><td>フィッシャーケミカル</td><td> G54-1 </td><td> 14.5ミリメートル（最終作業溶液） </td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BP327-500 </td><td> 0.5％（最終的な作業溶液） </td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> O4042 </td><td> 3％（最終的な作業溶液） </td></tr><tr><td> 100mmの組織培養皿</td><td>ザルスタット</td><td> 83.1802 </td><td></td></tr><tr><td> 12ウェルプレート</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 08-772-29 </td><td></td></tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 07-200-84 </td><td></td></tr><tr><td>テクネオーブンHybridiser HB-1D </td><td> LabPlanet </td><td> 2040500 </td><td>標準的な実験室のオーブンで十分でしょう</td></tr><tr><td> 10ミリリットル血清ピペット</td><td>ザルスタット</td><td> 86.1254.001 </td><td></td></tr><tr><td>ピペットエイドフィラー/ディスペンサー</td><td>ドラモンド</td><td> 13-681-15 </td><td></td></tr><tr><td> P200シングルチャンネルピペットマニュアル</td><td>レイニン</td><td> PR-200 </td><td></td></tr><tr><td> 200ミリリットルバリアのヒント</td><td> CLP </td><td> BT200 </td><td></td></tr><tr><td> ImageJのソフトウェア</td><td> <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">HTT</a>P :/ / rsb.info.nih.gov / IJ / </td><td></td><td>ライセンス：パブリックドメイン</td></tr><tr><td> photometrics CoolSNAPfxニコンエクリプスTE300は、12ビットCCDカメラをモノクロ</td><td>ニコン</td><td></td><td>中止、ほとんど匹敵する仕様は、ニコンエクリプスTiを持っていますが、下端ニコン80Iも適しています。他のブランドも匹敵する顕微鏡を提供する。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 注：下記の試薬 ​​および機器は私たちの様々な研究で我々が利用されてきた。その他の消耗品サプライヤー、試薬、機器がある限り、彼らは同様の仕様を持っているとして、使用することができます。 </td></tr></tbody></table>

a quantitative evaluation of cell migration by the phagokinetic track motility assay

細胞の運動性は単細胞と多細胞生物の両方にとって重要な生物学的プロセスである。これは、ほんの数1,2,3役割に言及し、組織の発達、免疫監視および創傷治癒には不向きな条件からだけでなく、多細胞生物に離れて栄養源に向かって、または単細胞生物の動きのために不可欠です。このプロセスの規制緩和は重大な、神経、心血管および免疫疾患につながるだけでなく、腫瘍の形成と拡散4,5を悪化させたことができます。分子、アクチンの重合と受容体のリサイクルは、セル6,7,8の前方への移動を駆動する携帯電話の拡張（葉状仮足）の作成 ​​に重要な役割を果たすことが示されている。しかし、細胞の遊走についての多くの生物学的な疑問は未解決のままです。 ヒトの健​​康と疾患における細胞の運動性のための中心的な役割は、特定のMECを理解することの重要性を強調hanismsは、このプロセスに関与しており、特に重要な細胞の運動性を評価するための正確な方法になります。顕微鏡は、通常の細胞の動きを視覚化するために使用されています。しかし、細胞は運動性細胞の定量的な時間経過のムービーを作成するために高価なカメラとソフトウェアを必要とするリソースのかかるプロセスで細胞遊走の定量的な測定を行うことではなく、徐々に移動します。したがって、費用対効果が細胞移動の定量的な測定を実行する能力、非骨の折れる、共通実験装置を利用し、多くの研究者のための大きい必要があります。 phagokineticトラック運動性アッセイは、金コロイドで被覆されたガラスカバースリップ9,10に測定可能なトラックを作成し、そのパスから金粒子をクリアする移動細胞の能力を利用しています。自由に利用できるソフトウェアを使用して、複数のトラックが統計的要件を達成するために、各治療のために評価することができます。アッセイは、評価するために利用することができがん細胞など多くの細胞型、11,12、線維芽9、好中球13、骨格筋細胞14、ケラチノサイト15トロホブラスト16、内皮細胞17、および単球の運動性10,18-22。プロトコルは、クエン酸ナトリウムによって塩化金酸の還元金（Au 3 +）によって生成された金ナノ粒子（金°）で被覆されたスライドの作成 ​​が含まれます。この方法は、1951年23インチ Turkevich らによって開発された後、Frens らによって1970年代に改善された。24,25。この化学還元工程の結果として、金粒子（直径10〜20 nm）は、反応混合物から沈殿させ、その後、細胞移動の解析9,26,27で使用するための準備ができているカバーガラスに適用することができます。 一般的に、phagokineticトラック運動性アッセイは、細胞の運動性、迅速かつ簡単に定量的な尺度である。加えて、それ時間経過イメージング、ならびに研究者のニーズに応じて他の用途に適さない種類の細胞で使用するために、単純なハイスループットアッセイとして利用することができる。一緒に、定量的に高価な顕微鏡やソフトウェアを必要とせずに、複数の種類の細胞の細胞の運動性を測定する能力は、一般的な実験器具や薬品の使用とともに、phagokineticトラック運動分析セルラーを理解することに関心を持つ科学者のための堅実な選択肢作る運動性。

示されている単一電池（我々の実験から単球を図2に示されている）によってクリアトラック領域を示す光学顕微鏡下で撮影した画像の一例です。非運動性の細胞は、特徴的な、小さな楕円形またはこれらの刺激細胞（ 図2Aおよび2B）のための運動の低い基底レベルを示す自身の周りに円形の管を作成します。これとは対照的に、非常に運動性の細胞[私た...

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A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

phagokinetic運動追跡アッセイは、細胞の動きを評価するために使用される方法です。具体的には、アッセイは、定量的な方法で時間をかけてケモキネシス（ランダム細胞の運動性）を測定します。アッセイは、コロイド金でコーティングされたカバースリップ上で彼らの動きの測定可能なトラックを作成する細胞の能力を活用しています。

Phagokineticトラック運動アッセイによる細胞遊走の定量的評価

Cellular motility is an important biological process for both unicellular and multicellular organisms. It is essential for movement of unicellular ...

a-quantitative-evaluation-cell-migration-phagokinetic-track-motility

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.8K ビュー.  Louisiana State University Health Sciences Center. phagokinetic運動追跡アッセイは、細胞の動きを評価するために使用される方法です。具体的には、アッセイは、定量的な方法で時間をかけてケモキネシス（ランダム細胞の運動性）を測定します。アッセイは、コロイド金でコーティングされたカバースリップ上で彼らの動きの測定可能なトラックを作成する細胞の能力を活用しています。

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Quantitative Assessment of Immune Cells in the Injured Spinal Cord Tissue by Flow Cytometry:  a Novel Use for a Cell Purification Method

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true quantitative analysis of cellular inflammation. Flow cytometry is a quick alternative method to quantify immune cells in the injured brain or spinal cord tissue. Historically, flow cytometry has been used to quantify immune cells collected from blood or dissociated spleen or thymus, and only a few studies have attempted to quantify immune cells in the injured spinal cord by flow cytometry using fresh dissociated cord tissue. However, the dissociated spinal cord tissue is concentrated with myelin debris that can be mistaken for cells and reduce cell count reliability obtained by the flow cytometer. We have advanced a cell preparation method using the OptiPrep gradient system to effectively separate lipid/myelin debris from cells, providing sensitive and reliable quantifications of cellular inflammation in the injured spinal cord by flow cytometry. As described in our recent study (Beck &amp; Nguyen et al., Brain. 2010 Feb; 133 (Pt 2): 433-47), the OptiPrep cell preparation had increased sensitivity to detect cellular inflammation in the injured spinal cord, with counts of specific cell types correlating with injury severity. Critically, novel usage of this method provided the first characterization of acute and chronic cellular inflammation after SCI to include a complete time course for polymorphonuclear leukocytes (PMNs, neutrophils), macrophages/microglia, and T-cells over a period ranging from 2 hours to 180 days post-injury (dpi), identifying a surprising novel second phase of cellular inflammation. Thorough characterization of cellular inflammation using this method may provide a better understanding of neuroinflammation in the injured CNS, and reveal an important multiphasic component of neuroinflammation that may be critical for the design and implementation of rational therapeutic treatment strategies, including both cell-based and pharmacological interventions for SCI.

Quantification of cellular inflammation in the injured/pathological CNS by flow cytometry is complicated by lipid/myelin debris that can have similar size and granulation to cells, decreasing sensitivity/accuracy. We have advanced a cell preparation method to remove myelin debris and improve cell detection by flow cytometry in the injured spinal cord.

フローサイトメトリーによって負傷した脊髄組織における免疫細胞の定量的評価：セルの精製方法のための新しい使用法

Detection of immune cells in the injured central nervous system (CNS) using morphological or histological techniques has not always provided true ...

免疫・感染学

Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle and the induction of protective immune responses1,2. As the main target for neutralizing antibodies, HA is currently used as the influenza vaccine potency marker and is measured by single radial immunodiffusion (SRID)3. However, the dependence of SRID on the availability of the corresponding subtype-specific antisera causes a minimum of 2-3 months delay for the release of every new vaccine. Moreover, despite evidence that NA also induces protective immunity4, the amount of NA in influenza vaccines is not yet standardized due to a lack of appropriate reagents or analytical method5. Thus, simple alternative methods capable of quantifying HA and NA antigens are desirable for rapid release and better quality control of influenza vaccines.
Universally conserved regions in all available influenza A HA and NA sequences were identified by bioinformatics analyses6-7. One sequence (designated as Uni-1) was identified in the only universally conserved epitope of HA, the fusion peptide6, while two conserved sequences were identified in neuraminidases, one close to the enzymatic active site (designated as HCA-2) and the other close to the N-terminus (designated as HCA-3)7. Peptides with these amino acid sequences were synthesized and used to immunize rabbits for the production of antibodies. The antibody against the Uni-1 epitope of HA was able to bind to 13 subtypes of influenza A HA (H1-H13) while the antibodies against the HCA-2 and HCA-3 regions of NA were capable of binding all 9 NA subtypes. All antibodies showed remarkable specificity against the viral sequences as evidenced by the observation that no cross-reactivity to allantoic proteins was detected. These universal antibodies were then used to develop slot blot assays to quantify HA and NA in influenza A vaccines without the need for specific antisera7,8. Vaccine samples were applied onto a PVDF membrane using a slot blot apparatus along with reference standards diluted to various concentrations. For the detection of HA, samples and standard were first diluted in Tris-buffered saline (TBS) containing 4M urea while for the measurement of NA they were diluted in TBS containing 0.01% Zwittergent as these conditions significantly improved the detection sensitivity. Following the detection of the HA and NA antigens by immunoblotting with their respective universal antibodies, signal intensities were quantified by densitometry. Amounts of HA and NA in the vaccines were then calculated using a standard curve established with the signal intensities of the various concentrations of the references used. 
Given that these antibodies bind to universal epitopes in HA or NA, interested investigators could use them as research tools in immunoassays other than the slot blot only.

A simple slot blot method was developed for the quantification of influenza viral hemagglutinin and neuraminidase using universal antibodies targeting their most conserved sequences identified through bioinformatics analyses. This innovative approach may provide a useful alternative to quantitative determination of all viral hemagglutinin and neuraminidase.

すべてのインフルエンザA型の定量的な分析シンプルなスロットブロットアッセイでユニバーサル抗体を用いたウイルスHemagglutininsとノイラミニダーゼ

Hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA) are two surface proteins of influenza viruses which are known to play important roles in the viral life cycle ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many of these viruses have intensified in their endemic ranges and expanded to new territories, necessitating effective surveillance and control programs to respond to these threats. One strategy to monitor virus activity involves collecting large numbers of mosquitoes from endemic sites and testing them for viral infection. In this article, we describe how to handle, process, and screen field-collected mosquitoes for infectious virus by Vero cell culture assay. Mosquitoes are sorted by trap location and species, and grouped into pools containing &le;50 individuals. Pooled specimens are homogenized in buffered saline using a mixer-mill and the aqueous phase is inoculated onto confluent Vero cell cultures (Clone E6). Cell cultures are monitored for cytopathic effect from days 3-7 post-inoculation and any viruses grown in cell culture are identified by the appropriate diagnostic assays. By utilizing this approach, we have isolated 9 different viruses from mosquitoes collected in Connecticut, USA, and among these, 5 are known to cause human disease. Three of these viruses (West Nile virus, Potosi virus, and La Crosse virus) represent new records for North America or the New England region since 1999. The ability to detect a wide diversity of viruses is critical to monitoring both established and newly emerging viruses in the mosquito population.

We describe a method to process and screen field-collected mosquitoes for a diversity of viruses by Vero cell culture assay. By employing this technique, we have detected 9 different viruses from 4 taxonomic families in mosquitoes collected in Connecticut.

Vero細胞培養アッセイによるフィールドコレクト蚊から感染性ウイルスの検出

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

T細胞の定量的なハイスループットシングルセル細胞毒性アッセイ

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Continuous advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) have greatly improved our ability to study physiological or pathological processes in living organisms. MRI is also proving to be a valuable tool for capturing transplanted cells in vivo. Initial cell labeling strategies for MRI made use of contrast agents that influence the MR relaxation times (T1, T2, T2*) and lead to an enhancement (T1) or depletion (T2*) of signal where labeled cells are present. T2* enhancement agents such as ultrasmall iron oxide agents (USPIO) have been employed to study cell migration and some have also been approved by the FDA for clinical application. A drawback of T2* agents is the difficulty to distinguish the signal extinction created by the labeled cells from other artifacts such as blood clots, micro bleeds or air bubbles. In this article, we describe an emerging technique for tracking cells in vivo that is based on labeling the cells with fluorine (19F)-rich particles. These particles are prepared by emulsifying perfluorocarbon (PFC) compounds and then used to label cells, which subsequently can be imaged by 19F MRI. Important advantages of PFCs for cell tracking in vivo include (i) the absence of carbon-bound 19F in vivo, which then yields background-free images and complete cell selectivityand(ii) the possibility to quantify the cell signal by 19F MR spectroscopy.

Monitoring Dendritic Cell Migration using 19F / 1H Magnetic Resonance Imaging

Tracking of cells using MRI has gained remarkable attention in the past years. This protocol describes the labeling of dendritic cells with fluorine (19F)-rich particles, the in vivo application of these cells, and monitoring the extent of their migration to the draining lymph node with 19F/1H MRI and 19F MRS.

使用して樹状細胞の移行の監視<sup&gt; 19</sup&gt; F /<sup&gt; 1</sup&gt; H磁気共鳴イメージング

Continuous  advancements in noninvasive imaging modalities such as magnetic resonance  imaging (MRI) have greatly improved our ability to study ...

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to the infiltration of tissues with migrating inflammatory cells, primarily neutrophils.&#160;This process has the potential to be destructive to tissues if excessive or held in an unresolved state.&#160; Cocultured in vitro models can be utilized to study the unique molecular mechanisms involved in pathogen induced neutrophil trans-epithelial migration.&#160;This type of model provides versatility in experimental design with opportunity for controlled manipulation of the pathogen, epithelial barrier, or neutrophil.&#160;Pathogenic infection of the apical surface of polarized epithelial monolayers grown on permeable transwell filters instigates physiologically relevant basolateral to apical trans-epithelial migration of neutrophils applied to the basolateral surface.&#160;The in vitro model described herein demonstrates the multiple steps necessary for demonstrating neutrophil migration across a polarized lung epithelial monolayer that has been infected with pathogenic P. aeruginosa (PAO1).&#160;Seeding and culturing of permeable transwells with human derived lung epithelial cells is described, along with isolation of neutrophils from whole human blood and culturing of PAO1 and nonpathogenic K12 E. coli (MC1000).&#160; The emigrational process and quantitative analysis of successfully migrated neutrophils that have been mobilized in response to pathogenic infection is shown with representative data, including positive and negative controls.&#160;This in vitro model system can be manipulated and applied to other mucosal surfaces.&#160;Inflammatory responses that involve excessive neutrophil infiltration can be destructive to host tissues and can occur in the absence of pathogenic infections.&#160;A better understanding of the molecular mechanisms that promote neutrophil trans-epithelial migration through experimental manipulation of the in vitro coculture assay system described herein has significant potential to identify novel therapeutic targets for a range of mucosal infectious as well as inflammatory diseases.

In vitro Coculture Assay to Assess Pathogen Induced Neutrophil Trans-epithelial Migration

Neutrophil trans-epithelial migration in response to mucosal bacterial infection contributes to epithelial injury and clinical disease.&#160;An in vitro model has been developed that combines pathogen, human neutrophils, and polarized human epithelial cell layers grown on transwell filters to facilitate investigations towards unraveling the molecular mechanisms orchestrating this phenomenon.

インビトロ 病原体誘導性好中球トランス上皮移動を評価するコーカルチャーアッセイ

Mucosal surfaces serve as protective barriers against pathogenic organisms.&#160;Innate immune responses are activated upon sensing pathogen leading to ...

Quantitative Assessment of Human Neutrophil Migration Across a Cultured Bladder Epithelium

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. During infection of the urinary bladder, polymorphonuclear leukocytes (PMN; neutrophils) migrate from the bloodstream and traverse the bladder epithelium. Failure to resolve infection in the absence of a neutrophilic response demonstrates the importance of PMN in bladder defense. To facilitate colonization of the bladder epithelium, uropathogenic Escherichia coli (UPEC), the causative agent of the majority of urinary tract infections (UTIs), dampen the acute inflammatory response using a variety of partially defined mechanisms. To further investigate the interplay between host and bacterial pathogen, we developed an in vitro model of this aspect of the innate immune response to UPEC. In the transuroepithelial neutrophil migration assay, a variation on the Boyden chamber, cultured bladder epithelial cells are grown to confluence on the underside of a permeable support. PMN are isolated from human venous blood and are applied to the basolateral side of the bladder epithelial cell layers. PMN migration representing the physiologically relevant basolateral-to-apical direction in response to bacterial infection or chemoattractant molecules is enumerated using a hemocytometer. This model can be used to investigate interactions between UPEC and eukaryotic cells as well as to interrogate the molecular requirements for the traversal of bladder epithelia by PMN. The transuroepithelial neutrophil migration model will further our understanding of the initial inflammatory response to UPEC in the bladder.

We developed an in vitro model that mimics an important component of the acute inflammatory response during infection of the bladder with uropathogenic Escherichia coli. The transuroepithelial neutrophil migration assay enables quantitative assessment of human neutrophil migration across bladder epithelia, cultured on permeable supports, in response to bacterial infection or chemoattractant substances.

培養された膀胱上皮を越えるヒト好中球の移行の定量的評価

The recruitment of immune cells from the periphery to the site of inflammation is an essential step in the innate immune response at any mucosal surface. ...

Conformational Evaluation of HIV-1 Trimeric Envelope Glycoproteins Using a Cell-based ELISA Assay

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins are able to fuel the fusion process through their conformational changes could lead to the design of better, more effective immunogens for vaccine strategies. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows studying the recognition of trimeric HIV-1 Env by monoclonal antibodies. Following expression of HIV-1 trimeric Env at the surface of transfected cells, conformation specific anti-Env antibodies are incubated with the cells. A horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody and a simple chemiluminescence reaction are then used to detect bound antibodies. This system is highly flexible and can detect Env conformational changes induced by soluble CD4 or cellular proteins. It requires minimal amount of material and no highly-specialized equipment or know-how. Thus, this technique can be established for medium to high throughput screening of antigens and antibodies, such as newly-isolated antibodies.

Understanding viral surface antigens conformations is required to evaluate antibody neutralization and guide the design of effective vaccine immunogens. Here we describe a cell-based ELISA assay that allows the study of the recognition of trimeric HIV-1 Env expressed at the surface of transfected cells by specific anti-Env antibodies.

細胞ベースのELISAアッセイを使用して、HIV-1エンベロープ糖タンパク質三量体の構造評価

HIV-1 envelope glycoproteins (Env) mediate viral entry into target cells and are essential to the infectious cycle. Understanding how those glycoproteins ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific locked nucleic acid (LNA) and molecular beacon (MB) probes, transcript standards, automated multichannel pipetting, and plate drying. Determining expression among the type I interferons (IFN), especially the twelve IFN-&#945; subtypes, is limited by their shared sequence identity; likewise, the sequences of the type III IFN, especially IFN-&#955;2 and -&#955;3, are highly similar. This assay provides a reliable, reproducible, and relatively inexpensive means to analyze the expression of the seventeen interferon subtype transcripts.

This protocol describes a high-throughput qRT-PCR assay for the analysis of type I and III IFN expression signatures. The assay discriminates single base pair differences between the highly similar transcripts of these genes. Through batch assembly and robotic pipetting, the assays are consistent and reproducible.

ハイスループット定量的リアルタイムRT-PCRアッセイのタイプIおよびIIIインターフェロンサブタイプの発現プロファイルを決定するための

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

定性的および定量的検出のためのアッセイおよびタンパク質の抗菌薬のキャラクタリゼーション

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...