Name: analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix
Uploaded: 2014-10-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
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This work was supported by the Fritz-Bender-Foundation, Munich, Germany

移行チェンバースの調製<ol><li>混合物が溶融するまでミックスと熱：パラフィンワックス/石油ゼリー（1 1）を準備します。ペイントブラシを用いて、パラフィンワックス/石油ゼリーの2-3層描く（1：1）を図1B〜1Dに従ったガラススライドの中央に混ぜる。 注：私たちは、共通のガラススライドを使用している（76×26×1.0〜1.5ミリメートル（W / D / H）） </li><li>描きながら凝固を避けるために、スライドガラス上に急速に融解したパラフィンワックス/石油ゼリーミックスを適用します。パラフィンワックス/石油ゼリー層は、長さが約2〜2.5センチメートル、幅0.3〜0.5センチメートルであることを確認してください。パラフィンワックス/石油ゼリー層の厚さは約0.1〜0.15センチメートルにする必要があります。 </li><li>固化したパラフィンワックス/石油ゼリーミックスにカバースリップを追加し、二から三層ワックス/石油ゼリーミックスパラフィン（ 図1E、1F）でそれを封印。一般的な細胞遊走実験に4-8マイグレーションチャンバーを使用してください。移行チャンバiを置きますラックに直立位置がn。 </li></ol>コラーゲン懸濁細胞ミックスの調製<ol><li>収穫（ 例えば 、0.25％トリプシン/ EDTAを含む）と目的の細胞を数える。ウシ胎児血清（FCS）を含む培地、抗生物質、推奨サプリメント完全に細胞を再懸濁。 4-8 1.5ミリリットルの反応管と4-6×10 4個の細胞を（細胞の総数を分析する細胞型に依存します）を含む20μlの細胞懸濁液を準備し、完全培地で50μlに埋める。 注：追加の化合物（ 例えば 、成長因子、ケモカイン、阻害剤等 ） を細胞懸濁液に添加する。細胞懸濁液の最終容量は50μLを超えないように、適切なストック溶液を使用する。 </li><li> 4つの細胞遊走実験のために452μlの最終的なコラーゲン懸濁液の総量を準備します。 50μlの10倍MEM（pHは5.1から5.5）および7.5％炭酸水素ナトリウム溶液の27μlの液（pH 9.0〜9.5を追加します。）1.5ミリリットルの反応チューブへと完全に混合する。強烈な紫色の液（pH 9.0〜9.5）に黄橙色から溶液の色ターンを観察します。 10倍MEM /重炭酸ナトリウム溶液に375μlの液体コラーゲン懸濁液を加え、完全に混合する。最終的なコラーゲン懸濁液のpHは約7.5であるべきである（光紫色で示​​されている）。 注：7.5％重炭酸ナトリウム溶液のpHをチェックしてください。 pHは、CO 2で飽和させ、（ - 9.5〜約9.0）のpHを増加させるインキュベーター内で開いた蓋（37°C、5％CO 2）で約7.5場所炭酸水素ナトリウム溶液である場合。コラーゲン懸濁液の細胞混合物のpHは、コラーゲン網の安定性のために重要である。それが低すぎると、コラーゲンラティスは、細胞遊走実験の間に崩壊する。 注：このプロトコルでは、ウシの後肢から液体コラーゲン液（pH 1.9から2.2）を使用します（2.9から3.3 mg / mlのコラーゲンを95％のコラーゲンI型、5％のIV型コラーゲン）。使用してさらにコラーゲン格子調製プロトコルの例そのようなブタやラットなどの他のソースからのコラーゲンタイプIは、32,33に記載されている。これは1.67ミリグラム/格子の中の究極のコラーゲン濃度を変化させるように使用される溶液のボリュームを変更しないでください。より高いまたはより低いコラーゲン濃度は、コラーゲン繊維の密度及び細胞遊走挙動34に付随し、それらの間の平均距離に影響を与える。 </li><li> 50μlの細胞懸濁液に最終コラーゲン懸濁液100μlを加え、thoroughly.The最終コラーゲン懸濁液（1.67 mg / mlのコラーゲンは）わずかに粘性で混ぜる。正確な量（100μl）を転送するには、細胞懸濁液にそれを転送する前に、一度上下に最終的なコラーゲン溶液をピペット。 NOTE：コラーゲン懸濁細胞ミックスをpH値が7.5に変更された10×MEM /重炭酸ナトリウム溶液と合わせられるとコラーゲン繊維を直ちに重合を開始する。 </li><li>目から最終的なコラーゲン懸濁液の細胞ミックスを転送する移行チャンバに電子反応チューブ。静かに均等に遊走チャンバー（ 図1H）の底部にコラーゲン懸濁液細胞ミックスを配布する遊走チャンバーをタップします。ラックに直立位置に移動室を置き、約30分間インキュベートする（37℃、5％CO 2）コラーゲン線維の重合を可能にする。 </li><li>重合されたコラーゲン格子がわずかに濁っまだ薄紫色であることに注意してください。関心のあるサプリメントで完全培地または完全培地での移行室を記入し、パラフィンワックス/石油ゼリーミックス（ 図1I、1J）と遊走チャンバーを密閉する ​​。 </li></ol> 3。細胞移動の記録と解析このセクションでは、手動の細胞追跡によるタイムラプスビデオ顕微鏡および細胞遊走の分析によって細胞移動の記録を記載している。 <ol><li>顕微鏡と顕微鏡ステージょんのスイッチを入れター。 37℃に温度を調整します。 10倍対物レンズを使用してください。顕微鏡下で遊走チャンバーを配置し、視野内の約50の細胞または複数の焦点を合わせる。 </li><li>マルチカメラビデオ監視ソフトウェアアプリケーションを使用して、タイムラプスモードのレコード細胞遊走。 たとえば 、適切な形式で細胞移動ムービーを保存して、 &quot;*。aviファイル」や「a *のMOV」。このような細胞の種類や実験条件などの情報をサポート含むデータベースへの細胞移動のムービーファイルをリンクします。 注：私たちはタイムラプス0.75秒、リアルタイムで1分に等しいことを意味1:80の経時係数を使用して、最大2時間、リンパ球およびHSPCsを記録している。腫瘍細胞は、動きの遅い細胞で​​あり、したがって、1の経時的ファクター使用して、少なくとも16時間が記録されています。1,800（タイムラプスにおいて0.5秒、リアルタイムで15分に等しい）。 </li><li> ImageJソフトウェアプラグインと同様に、適切な細胞追跡ソフトウェアアプリケーションを使用して、細胞移動の映画を分析する（概要は18に示されている）。公平な分析のために、細胞は、ランダムに細胞が遊走アクティブであるかどうか知らないうちに選択されることが決定的に重要である。 注：私たちは、手動で（核に位置している）マウスカーソルを正確に移動する細胞に従うことによって、実験あたり少なくとも30個の細胞の経路を追跡するために、自社開発のソフトウェアアプリケーションを使用しています。追跡しながら、追跡セルのxy座標が自動的に使用タイムラプスモードに応じて決定される。腫瘍細胞についてのxy座標を（15分リアルタイムに等しい）各0.5秒決定されるのに対し、リンパ球について/ HSPCsのxy座標は、（1分リアルタイムに等しい）各0.75秒で決定される。 </li><li>典型的な細胞遊走実験のため、細胞あたり60のxy座標の合計を決定します。これは、腫瘍細胞に対するリンパ球/ HSPCsおよび15時間、リアルタイムで1時間リアルタイムに等しい。 A &quot;、&quot;セルはtwの間で移動していないことを示しO時点、「数値」のに対し、「画素」セルが2の時点（ 図2A）との間で移動した距離を示している。 注：手動細胞追跡は経験が必要です。特に、高速移動する細胞を追跡するのが困難であり、各細胞型の展示を補充因子によって誘発され得る別個の遊走挙動。追跡しながら、細胞分裂の場合には、ランダムに追跡を継続するための1つの娘細胞を選択します。視界フィールドから移動またはトラッキングしながら、死ぬ細胞が無視されていませんが、分析のために考慮される。 </li></ol> 4。データ解析<ol><li>適切なソフトウェアアプリケーション、 例えば表計算プログラムを使用して、細胞追跡データを分析する。 <ol><li>自己設計されたスプレッドシートのテンプレートに、（ 図2A）、生データを追跡するセルをコピーすることによって、細胞トラッキングデータを分析します。代表、「数値を &quot;の合計を掛け総距離は、セルを「程度」に「ピクセル」を変換するための補正係数を移行しました。 </li><li>運動器官の活性（移動速度に相当する）と、アクティブな動き（ 図2C、2D）の時間：2細胞移動パラメータを決定します。 </li><li>非移動細胞など（偽陽性細胞の数を減らすために、閾値レベル）より小さい25μm以下に移動した細胞を識別します。 」「これらの細胞の「数値」に置き換えます。 注：パラメータ「運動器官の活性」（又は移動速度）は、二つの時点（ 図2D）との間で移動した追跡された細胞集団の細胞の割合を表す。 」、「非移動細胞として定義されるのに対し、「数値」は、移動する細胞として定義される。パラメータ「活発な動きの時間」（時間アクティブ）は、細胞が再に移行した合計時間の割合を示し観察期間（ 図2C）の時間枠に設置と。 「数値」は、「、」は、細胞が移動していないことを示し、一方、細胞は、移動したことを示している。このパラメータはさらに移動していない細胞の数を決定するために使用される。 </li></ol></li><li>統計的有意性を計算し、細胞移動データを表示する。 <ol><li>マン·ホイットニーU検定を用いて細胞（移動速度）の平均運動器官の活性の統計的有意性を計算する。有意とp値&lt;0.05を考えてみましょう。 </li><li>のxy図として細胞の平均運動器官の活動を表示し、箱ひげ図、またはバーチャート図など。棒グラフ図として、またはヒストグラムとして、そのような活発な動きや速度の時間のような単一の細胞ベースのデータを表示する。 注：選択された表計算ソフトウェアアプリケーションは箱ひげ図やヒストグラムチャートツールが含まれていない場合は、オンライン検索は、適切なTUを探しているために実行する必要がありますtorials。 </li></ol></li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

移行する能力は、腫瘍細胞4の特徴である。原発腫瘍から剥離すると、周囲の結合組織の腫瘍細胞を通って移動する能力がなければ、ほぼすべての癌患者の死亡の主要な原因である二次病変を、シードすることはできません。このため、関係のため、多くの研究は、癌細胞の移動に焦点を当てている。これらの研究の目的は、効率良く転移形成を損なうまたは減速、腫瘍細胞の移動を?...

細胞融合（概要については1,2を参照）細胞移動は、胚発生、創傷治癒および免疫応答（レビューのために3を参照）などの生理学的プロセスの過多に関与している他の生物学的な現象であるように。しかし、移行する機能は、腫瘍細胞が（レビューのために3,4を参照）転移するための前提条件でもある。 細胞遊走は、さまざまなリガンド（ 例えば 、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ホルモン、細胞外マトリックス成 ​​分）受容体（ 例えば 、受容体チロシンキナーゼによって開始され、いくつかのシグナル伝達経路の相互作用によって導かれる複雑な、まだ完全に理解されていないプロセスであり、ケモカイン受容体、インテグリン）、最終的に脱6シグナリング焦点接着複合体及びインテグリン媒介の再組み立てとアクチン細胞骨格に付随の再編成を引き起こす相互作用5。 インビトロおよびインビボの細胞遊走アッセイにおけるいくつかの細胞遊走を分析するときはs = &quot;jove_contentは&quot;&gt;ボイデンチャンバー/トランスウェルアッセイ7、アッセイ8-10治癒スクラッチアッセイ/創傷、三次元（含む、過去数十年の間に開発されている3D）コラーゲンマトリックス遊走アッセイ11だけでなく、生体内イメージング/顕微鏡法（レビューのために12を参照）。これらの細胞遊走アッセイは、それぞれ長所と短所など 、関連コスト及び設備の必要性や操作、得られたデータの信頼性を有する。 Boydenチャンバー/トランスウェルアッセイおよびスクラッチアッセイ/創傷治癒アッセイ双方は、 インビトロ 7-10 で細胞遊走を測定するための簡単、低コスト、よく発達したアッセイである。いわゆる上部コンパートメント7 -ボイデンチャンバー/トランスウェルアッセイでは、細胞を、細孔（直径約8μm）を含むインサートの上に播種する。任意に、インサートは、細胞外メートルで被覆することができATRIXの成分、 例えば 、フィブロネクチン、コラーゲンなどが 、より生理的環境を模倣する。同様に、内皮細胞は、それによって内皮細胞障壁13を模倣し、インサートの上に成長させることができた。そのような成長因子及びケモカインなどのメディアやサプリメントを保有下部コンパートメントに定義された時間間隔の間に細孔を通過した細胞は、細胞移動（または溢出）を定量化するために読み出しとして使用される。 スクラッチアッセイに/創傷治癒アッセイ細胞をプレートに播種し、集密度10まで増殖させる。実験設定プレートに依存してフィブロネクチンのような細胞外マトリックス成分で予め被覆することができる。スクラッチの各側面から細胞単層単一細胞を掻き取ることにより巻き取らキズ/作成した後/傷は、それによって10ヒーリング/充填、隙間に移行することができます。スクラッチ/傷の両側の間の距離が決定される時間に依存して、細胞10の移動活性のための読み出しとして使用される。しかし、タイムラプスビデオ顕微鏡、単一細胞が10を追跡してアッセイを組み合わせることをお勧めしますし、細胞移動（スクラッチ/創傷の充填/治癒につながる可能性がある）、細胞増殖を区別します。 しかし、Boydenチャンバー/トランスウェルアッセイおよびアッセイ治癒スクラッチアッセイ/創傷の両方が、生理的に似た細胞環境に関するむしろ不完全である。スクラッチアッセイ/創傷治癒アッセイで細胞を二次元の予備被覆プラスチックプレートに播種されているのに対し、ボイデンチャンバー/トランスウェルアッセイでは細胞は、プラスチック製の細孔を通って移動しなければならない。同様に、ウェル遊走挙動が二次元と三次元環境3との間で顕著に異なることが認識されている。例えば、線維芽細胞の三次元マトリックス接着は、2つに焦点を特徴と線維性癒着異なるα5β1およびαVβ3インテグリン、パキシリン、他の細胞骨格成分、および焦点接着キナーゼ14のチロシンリン酸化の含量での次元の基板。同様に、3D環境内に埋め込 ​​まれた細胞は、改変された回遊行動15を示した。このように、より正確に細胞遊走を分析する遊走アッセイは、3D生理学的または生理的に似た環境の中で、単一の細胞の移動を測定することができますお勧めします。 生体内イメージング/顕微鏡は、3D生理学的文脈の中で細胞移動を測定するためのゴールドスタンダードです。これは、現在までに、起因して可能なだけでなく、そのようなリンパ節17、内管外遊16またはリンパ球輸送中の腫瘍細胞および内皮細胞などの異なる細胞型間の相互作用、細胞外マトリックス-細胞相互作用に属していないこのような2光子などの改善された蛍光顕微鏡技術、共焦点レーザー走査顕微鏡検査、バイタル蛍光染料及び蛍光タンパク質誘導体の12,16,17を発現するトランスジェニックマウス株の使用。また、/顕微鏡生体内イメージングは、手動および自動細胞追跡18と組み合わせることができる。しかし、2光子共焦点レーザー走査顕微鏡を必要とするだけでなく、動物（および適切なトランスジェニック動物モデル）の生体内イメージング/顕微鏡検査は、かなりコストのかかる技術である。 Boydenチャンバー/トランスウェルアッセイおよびスクラッチアッセイ/創傷治癒アッセイの限界を克服するために、3次元コラーゲンマトリックス遊走アッセイは11,19を開発した3D環境内の異なる細胞型の遊走を分析する。これにより、移動している細胞は、3Dコラーゲン線維ネットワーク、in vivoの状況により似ている内に埋め込 ​​まれている。相まって、タイムラプスビデオ顕微鏡実際の細胞移動に起因するがdetermiが可能測定され、いくつかの移行パラメータだけでなく、プロの渡り鳥因子または阻害剤に応答したその変化の国家。さまざまな細胞型は、リンパ球および白血球11,20、造血幹/前駆細胞が21〜24、および腫瘍細胞5,25-29含め、この技術を用いて分析することができる。単一細胞に加えて、細胞クラスターまたはスフェロイドは、コラーゲン格子30,31への細胞のクラスター/スフェロイドからの単一細胞の移住の分析とコラーゲンマトリックス付随内に埋め込 ​​むことができた。 in vivoの状況に近い結果にもたらすインビトロの方法-このプロトコルは、3D環境内の異なる細胞型の回遊行動を分析するための簡単な、しかし強力な技術についての概要を説明します。

<table><tbody><tr><td>Leica DM IL inverted microscope</td><td>Leica, Wetzlar, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope stage heater</td><td>Distelkamp Electronic, Kaiserslautern, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JVC C1431 video camera</td><td>JVC, Bad Vilbel, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axis 241Q video server</td><td>Axis communication GmbH, Ismaning, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mac G5 Computer</td><td>Apple Macintosh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iMac</td><td>Apple Macintosh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FileMaker Pro</td><td>FileMaker GmbH, Unterschlei&amp;szlig;heim, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multi-camera video surveillance software(Security Spy)</td><td>Bensoftware, London, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Runtime Revolution Media 2.9.0</td><td>RunRev Ltd., Edinburgh, UK</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Applichem GmbH, Darmstadt, Germany</td><td>A4264</td><td></td></tr><tr><td>Petroleum jelly</td><td>local drug store</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Purecol (liquid collagen)</td><td>Nutacon BV, Leimuiden, The Netherlands</td><td></td><td>contains 2.9 - 3.3 mg/ml bovine collagen (95% collagen type I, 5% collagen type IV)</td></tr><tr><td>10x MEM</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>M0275</td><td></td></tr><tr><td>7.5% sodium bicarbonate solution</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany</td><td>E9644</td><td></td></tr><tr><td>U73122</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Germany</td><td>662035</td><td>dissolve first in CHCl&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;; reconstitute in DMSO just prior to use</td></tr></tbody></table>

analysis of cell migration within a three-dimensional collagen matrix

移行する機能は、さまざまな細胞型の特徴であり、胚発生、創傷治癒、および免疫応答を含むいくつかの生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。しかし、細胞遊走はまた、拡散、転移を開始するために、原発腫瘍から離脱するために、これらの癌細胞を有効癌における重要なメカニズムである。過去数年以内に、さまざまな細胞遊走アッセイは、異なる細胞型の移動挙動を分析するために開発されてきた。細胞の運動器官の挙動が顕著に2次元（2D）の間で異なり、3次元（3D）環境には、3D環境内に埋め込まれた細胞の遊走の分析は、より有意な細胞遊走をもたらすであろうと仮定することができるので、データ。記載された3Dコラーゲンマトリックス遊走アッセイの利点は、細胞が細胞外マトリックスの主要成分を表すコラーゲン繊維の生理3Dネットワーク内に埋め込まれていることである。のためにタイムラプスビデオ顕微鏡リアル細胞移動は、プロ遊走因子または阻害剤に応答して、複数の移行パラメータならびにそれらの変化の決定を可能に測定される。さまざまな細胞型、細胞、および腫瘍幹細胞、リンパ球/白血球を含む、この技術を用いて分析することができる。同様に、また、細胞クラスターまたはスフェロイドは、コラーゲン格子内細胞塊/スフェロイドからの単一細胞の移住の分析とコラーゲンマトリックス付随内に埋め込むことができた。私たちは、3次元コラーゲンマトリックス遊走アッセイは、生理状の3D環境内で細胞の移動を分析するための多様な方法であると結論する。

タイムラプスビデオ顕微鏡およびコンピュータ支援細胞トラッキングと組み合わせた使用の3D-コラーゲンマトリックス遊走アッセイは、集団ベースのパラメータ（ 例えば 、運動器官の活動を意味する）と、単一のセルベースのパラメータの両方を含むさまざまな細胞移動のパラメータの決定を可能にする（ 例えば 、活性運動の時間、速度、距離、移行）。得られた細胞追跡デ...

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Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

細胞移動は、癌のような創傷治癒および免疫応答、および病態生理学的過程として、生理の茄多に関与している生物学的な現象である。 3次元コラーゲンマトリックス遊走アッセイは、3D生理的環境における内の異なる細胞型の遊走特性を分析するための多目的なツールである。

三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

23.6K ビュー.  Witten/Herdecke University. 細胞移動は、癌のような創傷治癒および免疫応答、および病態生理学的過程として、生理の茄多に関与している生物学的な現象である。 3次元コラーゲンマトリックス遊走アッセイは、3D生理的環境における内の異なる細胞型の遊走特性を分析するための多目的なツールである。 

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Organotypic Collagen I Assay: A Malleable Platform to Assess Cell Behaviour in a 3-Dimensional Context

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and metastasis of tumor cells. Migration has been studied on glass coverslips in order to make cellular dynamics amenable to investigation by light microscopy. However, it has become clear that many aspects of cell migration depend on features of the local environment including its elasticity, protein composition, and pore size, which are not faithfully represented by rigid two dimensional substrates such as glass and plastic 1. Furthermore, interaction with other cell types, including stromal fibroblasts 2 and immune cells 3, has been shown to play a critical role in promoting the invasion of cancer cells. Investigation at the molecular level has increasingly shown that molecular dynamics, including response to drug treatment, of identical cells are significantly different when compared in vitro and in vivo 4. 
Ideally, it would be best to study cell migration in its naturally occurring context in living organisms, however this is not always possible. Intermediate tissue culture systems, such as cell derived matrix, matrigel, organotypic culture (described here) tissue explants, organoids, and xenografts, are therefore important experimental intermediates. These systems approximate certain aspects of an in vivo environment but are more amenable to experimental manipulation such as use of stably transfected cell lines, drug treatment regimes, long term and high-resolution imaging. Such intermediate systems are especially useful as proving grounds to validate probes and establish parameters required to image the dynamic response of cells and fluorescent reporters prior to undertaking imaging in vivo 5. As such, they can serve an important role in reducing the need for experiments on living animals.

A method is described for the preparation of a 3-dimensional matrix consisting of collagen type I and primary human fibroblasts. This organotypic gel serves as a useful substrate to assess invasive cell migration because it mimics basic features of tissue stroma and is amenable to many forms of microscopy.

器官型コラーゲンIアッセイ：3次元コンテキストでのセルの挙動を評価するための可鍛性プラットフォーム

Cell migration is fundamental to many aspects of biology, including development, wound healing, the cellular responses of the immune system, and ...

生物工学

Live-cell Imaging of Migrating Cells Expressing Fluorescently-tagged Proteins in a Three-dimensional Matrix

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound healing, tissue regeneration, and cancer metastasis, cells must navigate through complex, three-dimensional extracellular tissue. To better understand the mechanisms behind these biological processes, it is important to examine the roles of the proteins responsible for driving cell migration. Here, we outline a protocol to study the mechanisms of cell migration using the epithelial cell line (MDCK), and a three-dimensional, fibrous, self-polymerizing matrix as a model system. This optically clear extracellular matrix is easily amenable to live-cell imaging studies and better mimics the physiological, soft tissue environment. This report demonstrates a technique for directly visualizing protein localization and dynamics, and deformation of the surrounding three-dimensional matrix. 
Examination of protein localization and dynamics during cellular processes provides key insight into protein functions. Genetically encoded fluorescent tags provide a unique method for observing protein localization and dynamics. Using this technique, we can analyze the subcellular accumulation of key, force-generating cytoskeletal components in real-time as the cell maneuvers through the matrix. In addition, using multiple fluorescent tags with different wavelengths, we can examine the localization of multiple proteins simultaneously, thus allowing us to test, for example, whether different proteins have similar or divergent roles. Furthermore, the dynamics of fluorescently tagged proteins can be quantified using Fluorescent Recovery After Photobleaching (FRAP) analysis. This measurement assays the protein mobility and how stably bound the proteins are to the cytoskeletal network.
By combining live-cell imaging with the treatment of protein function inhibitors, we can examine in real-time the changes in the distribution of proteins and morphology of migrating cells. Furthermore, we also combine live-cell imaging with the use of fluorescent tracer particles embedded within the matrix to visualize the matrix deformation during cell migration. Thus, we can visualize how a migrating cell distributes force-generating proteins, and where the traction forces are exerted to the surrounding matrix. Through these techniques, we can gain valuable insight into the roles of specific proteins and their contributions to the mechanisms of cell migration.

Cellular processes such as cell migration have traditionally been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. This report describes a technique for directly visualizing protein localization and analyzing protein dynamics in cells migrating in a more physiologically relevant, three-dimensional matrix.

三次元マトリックスの蛍光タグ付きタンパク質を発現する遊走細胞の生細胞イメージング

Traditionally, cell migration has been studied on two-dimensional, stiff plastic surfaces. However, during important biological processes such as wound ...

Study of Cell Migration in Microfabricated Channels

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which impose a polarized phenotype to cells by physical constraints. Once inside channels, cells have only two possibilities: move forward or backward. This simplified migration in which directionality is restricted facilitates the automatic tracking of cells and the extraction of quantitative parameters to describe cell movement. These parameters include cell velocity, changes in direction, and pauses during motion. Microchannels are also compatible with the use of fluorescent markers and are therefore suitable to study localization of intracellular organelles and structures during cell migration at high resolution. Finally, the surface of the channels can be functionalized with different substrates, allowing the control of the adhesive properties of the channels or the study of haptotaxis. In summary, the system here described is intended to analyze the migration of large cell numbers in conditions in which both the geometry and the biochemical nature of the environment are controlled, facilitating the normalization and reproducibility of independent experiments.

A quantitative method to study spontaneous migration of cells in a one-dimensional confined microenvironment is described. This method takes advantage of microfabricated channels and can be used to study migration of large number of cells under different conditions in single experiments.

微細加工チャネルにおける細胞移動の研究

The method described here allows the study of cell migration under confinement in one dimension. It is based on the use of microfabricated channels, which ...

Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration in more appropriate 3D environments, which better resemble the dimensionality of the physiological processes in question. Migratory cells can substantially differ in their morphology and mode of migration depending on whether they are moving on 2D or 3D substrates. Due to technical difficulties and incompatibilities with most standard protocols, structural and functional analysis of cells embedded within 3D matrices still remains uncommon. This article describes methods for preparation and imaging of 3D cancer cell cultures, either as single cells or spheroids. As an appropriate ECM substrate for cancer cell migration, we use nonpepsinized rat tail collagen I polymerized at room-temperature and fluorescently labeled to facilitate visualization using standard confocal microscopes. This work also includes a protocol for 3D immunofluorescent labeling of endogenous cell cytoskeleton. Using these protocols we hope to contribute to a better description of the molecular composition, localization, and functions of cellular structures in 3D.

This article presents a method to fluorescently label collagen that can be further used for both fix and live imaging of 3D cell cultures. We also provide an optimized protocol to visualize endogenous cytoskeletal proteins of cells cultured in 3D environments.

3Dで浸潤癌細胞の細胞骨格組織を明らかにする

Cell migration has traditionally been studied in 2D substrates. However, it has become increasingly evident that there is a need to study cell migration ...

医学

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to tumor and cancer metastasis. Despite intense research efforts, the basic biochemical and biophysical principles of cell migration are still not fully understood, especially in the physiologically relevant three-dimensional (3D) microenvironments. Here, we describe an in vitro assay designed to allow quantitative examination of 3D cell migration behaviors. The method exploits the cell&#8217;s mechanosensing ability and propensity to migrate into previously unoccupied extracellular matrix (ECM). We use the invasion of highly invasive breast cancer cells, MDA-MB-231, in collagen gels as a model system. The spread of cell population and the migration dynamics of individual cells over weeks of culture can be monitored using live-cell imaging and analyzed to extract spatiotemporally-resolved data. Furthermore, the method is easily adaptable for diverse extracellular matrices, thus offering a simple yet powerful way to investigate the role of biophysical factors in the microenvironment on cell migration.

The mechanical properties and microstructure of the extracellular matrix strongly affect 3D migration of cells. An in vitro method to study the spatiotemporal cell migration behavior in biophysically variable environments, at both population and individual cell levels, is described.

同心円状のゲルシステムは、3D細胞移動に対するマトリックスの微小環境の生物物理役割を研究する

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to their surrounding area, leading to cell movement and migration. In order to understand the mechanisms that can alter and/or affect cell migration, one can study these forces. In theory, understanding the fundamental mechanisms and forces underlying cell migration holds the promise of effective approaches for treating diseases and promoting cellular transplantation. Unfortunately, modern chemotaxis chambers that have been developed are usually restricted to two dimensions (2D) and have complex diffusion gradients that make the experiment difficult to interpret. To this end, we have developed, and describe in this paper, a direct-viewing chamber for chemotaxis studies, which allows one to overcome modern chemotaxis chamber obstacles able to measure cell forces and specific concentration within the chamber in a 3D environment to study cell 3D migration. More compelling, this approach allows one to successfully model diffusion through 3D collagen matrices and calculate the coefficient of diffusion of a chemoattractant through multiple different concentrations of collagen, while keeping the system simple and user friendly for traction force microscopy (TFM) and digital volume correlation (DVC) analysis.

Cell migration is an important part of human development and life. In order to understand the mechanisms that can alter cell migration, we present a planar gradient diffusion system to investigate chemotaxis in a 3D collagen matrix, which allows one to overcome modern diffusion chamber limitations of existing assays.

3Dコラーゲンマトリックス中の走化性を調査するために、平面グラデーション拡散システム

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

2D and 3D Matrices to Study Linear Invadosome Formation and Activity

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor cells have to cross anatomical barriers to invade and migrate through the surrounding tissue in order to reach blood or lymphatic vessels. This requires the interaction between cells and the extracellular matrix (ECM). At the cellular level, many cells, including the majority of cancer cells, are able to form invadosomes, which are F-actin-based structures capable of degrading ECM. Invadosomes are protrusive actin structures that recruit and activate matrix metalloproteinases (MMPs). The molecular composition, density, organization, and stiffness of the ECM are crucial in regulating invadosome formation and activation. In vitro, a gelatin assay is the standard assay used to observe and quantify invadosome degradation activity. However, gelatin, which is denatured collagen I, is not a physiological matrix element. A novel assay using type I collagen fibrils was developed and used to demonstrate that this physiological matrix is a potent inducer of invadosomes. Invadosomes that form along the collagen fibrils are known as linear invadosomes due to their linear organization on the fibers. Moreover, molecular analysis of linear invadosomes showed that the discoidin domain receptor 1 (DDR1) is the receptor involved in their formation. These data clearly demonstrate the importance of using a physiologically relevant matrix in order to understand the complex interactions between cells and the ECM.

This protocol describes how to prepare a 2D mixed matrix, consisting of gelatin and collagen I, and a 3D collagen I plug to study linear invadosomes. These protocols allow for the study of linear invadosome formation, matrix degradation activity, and the invasion capabilities of primary cells and cancer cell lines.

線状インベーゾームの形成および活性を研究するための2Dおよび3Dマトリックス

Cell adhesion, migration, and invasion are involved in many physiological and pathological processes. For example, during metastasis formation, tumor ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

三次元培養細胞遊走を特徴付ける傷の環境

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Quantifying Three-Dimensional Cell Migration Within and Into Granular Hydrogel Biomaterials

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for tissue integration. This article introduces two novel approaches for quantifying cell migration within and into granular hydrogels, highlighting the distinct applications of these scaffolds. First, a cell monolayer interface assay that simulates tissue growth into granular hydrogels for integration purposes is presented. Second, a spheroid-based assay is described, designed to track cell movement within the hydrogel matrix, specifically suited for applications involving cell delivery. Both methods enable precise and controlled measurements of cell migration, providing a comprehensive toolkit for researchers utilizing granular hydrogel scaffolds. The motivation for these methods stems from the need for tailored control over cell migration within the scaffold to align with specific applications. By optimizing and standardizing these quantification techniques, researchers can iteratively refine granular hydrogel properties, ensuring their effectiveness in diverse regenerative medicine contexts. This robust set of quantitative tools offers new opportunities to enhance granular hydrogel scaffolds, advancing their use in both cell delivery and tissue integration applications.

A protocol for the quantitative evaluation of 3D cell migration within and into the interface of granular hydrogels is presented here.

粒状ハイドロゲル生体材料内および粒状ハイドロゲル生体材料内への三次元細胞移動の定量化

Granular hydrogel scaffolds hold significant potential in regenerative medicine, functioning either as carriers for cell delivery or as interfaces for ...