NSF（0854551）から研究助成を受けた。

1。予備実験の準備<ol><li> 100ミリリットルNZR（通常ゼブラリンゲル）の（a）、（b）50ミリリットルNZR + Tricaine（MS222）、（c）は10ミリリットルNZR + BSAと、（d）100ミリリットルのLoCaS：6溶液（組成は表1を参照）を準備（低Ca 2 +の溶液）、（e）の10ミリリットルLoCaS +パパイン、（f）は、100ミリリットルK +内部 ​​溶液。ソリューションの（a）、（b）、（d）及び（f）4℃で最長1ヶ月まで保存することができるソリューション（c）及び（e）実験の日を準備する必要があります。すべてのソリューションは、実験を開始する前に、室温でなければなりません。 </li><li>ラベルとのほぼ中間ソリューション（）、（C）、（D）と、および（e）4 35ミリメートルペトリ皿を埋める。 </li><li>シルガード（ダウコーニング、ミッドランド、ミシガン州）で60ミリメートルペトリ皿を充填してから、魚が転倒することなく、背筋を伸ばして座るようになり、その中に空洞を切断することによって、解剖皿を作る。 </li><li>ガラスの端に犬の毛の接着卵胞年末までに少なくとも二つの細胞の分離ツールを準備瞬間接着剤とパスツールピペットは、髪は約0.5cmでピペットの末尾を超えて拡張することができます。ラブラドール·レトリバーとWeimaraners風ソフト毛皮の犬の毛はうまくいく。 </li></ol> 2。聴覚と前庭迷路の分離<ol><li> NZR + Tricaineを入れたビーカー中に浸漬することにより1成体ゼブラフィッシュを生け贄に捧げる。すべての鰓蓋の動きが止まるまで、視覚的に鰓を監視します。魚を除去し、新鮮なNZRでリンスする前に追加の10分待ちます。これらの手順は、インスティテューショナルアニマルケアによって承認されていると利用ペパーダイン大学の委員会（動物実験委員会）が、承認があなた自身の機関から入手する必要があります。 </li><li> 1それぞれの目のソケットを介して標準縫製ストレートピン（約2.5センチ）とヘッドからの距離の半分に約3分の1背腹軸を介して第3のピンを挿入することにより、最大解剖皿の背側に魚をピンに示すように尾へ図1A。 </li><li>ズーム（0.62-5x）を10倍接眼レンズを装着ステレオ解剖顕微鏡下では、約点から頭蓋骨の屋根を削除することで、脳や脊髄の短い部分を露出させるために、春のはさみ（ファイン科学ツールカタログ番号15000から02）を使用前方の魚の鼻に鰓のレベルまで尾0.5センチメートル。脊髄を切断し、脊髄神経やその他の添付ファイルをカットしながら微鉗子（ファイン科学ツールカタログ番号11251から30）で脳を持ち上げ脳を削除した（ 図1B）捨てる。 </li><li>残っている頭蓋骨カプセルの腹側半分が内耳器官を含む &quot;ボウル&quot;を形成する。もっと吻方各内耳の尾側に対称に配置lagenasと球形嚢の著名な、白、不透明な耳と横方向に配置卵形嚢の耳石を観察する（ 図1Cおよび図4A）。 </li><li>すべての腹と横attachmenを切断することによって、骨のボウルを取り外しtsは優しく微鉗子で頭からそれを持ち上げながら。 LoCaS（ 図1Dおよび図4B）を含むペトリ皿に入れます。 </li><li>細かい鉗子の2ペアを使用して、中央に鉗子のポイントを挿入し、半分をこじ開け右半分と左半分を分離し、どちらかの骨の側縁をつかんで離しあるいは、それらを引っ張って、正中線でボウルをバラバラに割れる離れて。細かい鉗子（ 図2）を用いて骨から2迷路を削除します。 </li><li>三半規管、utricles、球形嚢とlagenas（ 図4C）：聴覚と前庭エンドの臓器を特定するために迷路を点検します。各耳の下のピンクがかった領域が有毛細胞を含む斑です。同様に、半規管の膨大部内側にピンクのストリップは、有毛細胞が配置されている頂を識別します。 </li><li>慎重に細かい鉗子を使用つぼや卵形嚢から耳石を取り外します（ <stronグラム&gt;図2と図4C）。それはそうすることが嚢状有毛細胞に損傷を与える可能性がある球形嚢から耳石を取り外す必要はありません。 </li></ol> 3。有毛細胞の単離<ol><li>プラスチックホールピペット（Fisher Scientific社のカタログ番号13-711-9AM）を使用して、LoCaS +パパインは、転送される流体の体積を最小限に含まれている皿に終わり器官を動かす。 </li><li>室温で30分間この溶液中に、これらの構造体を培養する。 </li><li>潜伏期間の終了時に、NZR + BSAを含む皿に構造体を動かすと、少なくとも30分間この溶液中でインキュベートする。有毛細胞は最大4時間、この溶液中に健康を維持しますが、（次の手順を参照してください）​​分離後1-2時間後に劣化します。 </li><li>細胞単離のための準備として、NZRを含む皿にエンド器官の一つを移動します。 </li><li> lagenasとutriclesは、優しくピンク色がかった上皮tiの斑-シートをリフトオフする犬の毛を使用有毛細胞（図3A）が含まれてssue。斑はえぐらでき球形嚢の耳石の下から（犬の毛を使用）、半規管の膨大部内側にその場所から頂。 </li><li>ステップ1.4で調製した2細胞単離·ツールを使用して、有毛細胞（図3B）が含まれている残骸フィールドを生成するために黄斑または頂をひいて粉にする。細胞は、少なくとも5分はそれを移動する前に、皿の底に沈ませます。 </li><li>位相コントラスト光学系を備えた倒立顕微鏡のステージに皿を再配置します。 40X倍率で細胞を観察し、形態の多様性に注意してください。他は長く、薄いながら、多くの細胞はアボカドの形をしている。根尖毛束の存在は有毛細胞としてそれらを識別し、位相の明るさは、自分の健康を保証します。隔離された有毛細胞の顕微鏡写真を図5に示します。 </li></ol> 4。ゼブラフィッシュの有毛細胞をパッチクランプ<ol><li> perfoの準備のために場所5mgのアムホテリシンB（シグマA4888）を1.5 mlマイクロチューブに100μlのDMSOで埋める：定格パッチ録音5,6は 、次のようにアンホテリシン含有の内部溶液を調製します。アムホテリシンのすべてが溶解するまで10〜20秒のために直ちにボルテックスこのソリューション。次に、ピペット625第二マイクロ遠心チューブに液K +内部 ​​溶液。上記のようにK +内部 ​​溶液と渦にアムホテリシン溶液10μlを追加します。在庫アムホテリシンソリューションは、数時間が、1時間後の最終的な解決策を破棄します。 </li><li>多段階プラー（サターP-1000）を使用して、BF 150-86-10ホウケイ酸ガラス（サターインスツルメンツ）からパッチピペットを作製。ピペットは、約2μmの先端径を有するべきであり、表1のソリューションとMΩ1-3の抵抗値を持つことになります。次のように仕事がうまくあることをプラーの設定：熱=ランプminus10は、= 0の場合、速度を引き出し= 18、遅延= 1、圧力= 600。の形状良いピペットの先端は、図5の挿入図cの写真からも明らかである。彼らは電気生理学的記録の間に、少なくともアクセス抵抗を提供するように鈍い &quot;砲弾型&quot;ピペットが好ましい。 </li><li>アンホテリシン含有のK +内部 ​​液で中途半端に記録電極を埋めるために、28ゲージMicrofilの注射針（世界の精密機器MF28G-5）を使用してください。 </li><li>パッチクランプアンプのヘッドステージに貼って電極を形成する。 -10 mVの、10Hzで10msの電圧ステップを適用し、それが上下のセルの近くに録音皿の底に空気/溶液界面を介して操作されるように電極に正圧を維持します。 </li><li>健康的な細胞に直角に電極を配置します。電極はそれが出て流動ソリューションから脱却始まるように細胞に十分近いとき、迅速にその上にセルの &quot;ジャンプ&quot;まで、電極にわずかな真空を適用し、圧力を逆にしてください。すぐに目の上の吸引をやめるeは、電極と電極の内側に70mVの保持電位を適用します。数秒以内にgigaohmシールが形成されます。 </li><li>シール形成直後に表示される電圧ステップの開始と終了時の過渡電流容量を守ってください。トランジェントが（約10分）、その最大サイズまでの大きさに成長するように見てアムホテリシンによって電極下膜の穿孔を継続的に監視します。 </li><li>健康な細胞で細胞全体（穴あき）の構成の確立を確認するには、過分極と電圧のステップを脱分極を適用することによって、外向きK +電流を誘発する。ほとんどの有毛細胞は顕著な外向き電流（ 図6を参照）。 </li></ol> 5。代表的な結果 図4は、細胞単離のステップの間に撮影した画像を示しています。パネルで、lagenas、saccluliとutriclesに関連付けられている耳石がthrouを見ることができますGHそれらの上に横たわることを骨の薄い層。これらの不透明な構造は解剖の後続のステップの間に動物から終わり臓器の安全な取り外しを助けるために便利な観光スポットを提供します。パネルBは、無傷の迷路とutricles、lagenasと球形嚢の著名な耳石が含まれている骨の &quot;ボウル&quot;を示しています。パネルCは、骨から削除された迷路を示しています。つぼでスカラップ縁で大きな耳、卵形嚢で球形嚢と豆の形をした耳石でつらら状の耳石に注意してください。つぼから単離された細胞で見られる大きさと形態の多様性の一部は、 図5に示されている。健康な細胞は容易に鋭い境界を持つ明るい相として識別される。セル形状は、大きく2つのクラスに分割することができます：アボカド状（AVO）と長くて細い（THN）各グループ内のセルのサイズが著しく異なることがありますが（例：AVO 1とAVO 3の比較）。はめ込みのクラスタを示しています互いに完全に分離されなかった3セル。挿入図bのセルの黒い色と粒状の外観は容易に死んだとして、このセルを識別します。挿入図cは 、これらの細胞から記録するための適切な形状と寸法を示すパッチピペットの先端を示しています。 図6に示すように、現在のトレースは、 図5に示すAVO 2に類似つぼセルに課せられた可能性の段階を過分極と脱分極に応答して得られた。異なるサイズと形状の細胞内での電流応答は、広く電位依存性チャネルの補数の多様性を示唆して変えることができます。 図1-3：有毛細胞の単離の工程を示す漫画。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig1.jpg" /> 図1頭蓋骨capsuの除去ゼブラから内耳迷路を含むル。皿を解剖するゼブラフィッシュの背側を犠牲にピン。Bは 。オープン頭蓋骨、脳を取り外して廃棄します。Cは 。 utricles、lagenasと球形嚢。Dの耳石を観察します。迷路を含む頭蓋骨カプセルの腹の部分を削除します。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig2.jpg" /> 図2：頭蓋骨カプセルから迷路の除去。その正中線で頭蓋骨カプセルを離れて取り締まる。B。骨から迷路を削除します。Cは 。ピンセットを用いてlagenasとutriclesから耳石を取り出します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig3.jpg" /> 図3：迷路から有毛細胞の単離。優しくミリアンペアを持ち上げ犬の毛とculaeますb。 2犬の毛に斑をひいて粉にする。 C.は、パッチクランプ用の分離有毛細胞を使用してください。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig4.jpg" /> 図4：個々の細胞の単離のステップの間に撮影した画像は、脳を除去した後にAを 、2 lagenasと球形嚢（矢印）に関連付けられている耳石とutriclesが（矢頭）可視化することができる。腹を除去した後、Bの動物から内耳器官が含まれている頭蓋骨のカプセルの一部。 Bの右半分の漫画は左卵形嚢、つぼと球形嚢の位置を識別します。破線は左の迷路のおおよその位置を示します。C。右の迷宮（中央図）、D：C言語で迷路の主要部分を説明する漫画を描いてきた。 ：前半円形運河、B：水平の運河は、c：後部運河は、d：小嚢の耳石、E：嚢状耳石、F：lagenal耳石。 Dの中のスケールバーは1 mmでAとB、CとDは0.5mmを表し<img alt="図5" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig5.jpg" /> 図5の形態の多様性を説明するためのつぼから隔離された、健康な細胞; AVO：アボカド状細胞; THN：長い、薄いセル。挿入図：3不完全に単離された細胞のクラスター;はめ込みB：死んだ細胞、はめ込みがc：ゼブラフィッシュの有毛細胞から電気生理学的記録に使用されるパッチ電極の先端。スケールバー=20μmでは、メインの人物と、そのすべてのインセットに適用されます。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig6.jpg" /> パッチに記録図6電流は、有毛細胞をクランプされます。セル内の平均化された応答（類似トン図5のO AVO 2）70mVの保持電位から-140 mVから70 mVから10 mV刻みで印加された電圧ステップの3つのプレゼンテーションへ。より脱分極電位で表示され、現在の不活化に注意してください。電圧ステップの大きさは、一部のトレースの隣に表示されます。

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	<li>Lewis, R. S., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+solitary+vertebrate+hair+cells.">Voltage- and ion-dependent conductances in solitary vertebrate hair cells.</a> Nature. 304, 538-5341 (1983).</li><li>Art, J. J., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+membrane+properties+in+hair+cells+isolated+from+the+turtle+cochlea.">Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea.</a> J. 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Physiol. 583, 909-922 (2007).</li><li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method.">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J. Gen. Physiol. 92, 145-159 (1988).</li><li>Rae, J. R., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+access+perforated+patch+recordings+using+amphotericin+B.">Low access perforated patch recordings using amphotericin B.</a> J. Neurosci. Meth. 37, 15-26 (1991).</li><li>Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog,+Rana+catesbeiana.">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li><li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+electrical+resonance+and+frequency+tuning+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog,+Rana+catesbeiana.">A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 275-297 (1988).</li><li>Parsons, T. D., Lenzi, D., Almer, W., Roberts, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-triggered+exocytosis+in+an+isolated+presynaptic+cell:+capacitance+measurements+in+saccular+hair+cells.">Calcium-triggered exocytosis in an isolated presynaptic cell: capacitance measurements in saccular hair cells.</a> Neuron. 13, 875-883 (1994).</li><li>Kim, M. -. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+capacitance+measurements+and+Ca2++imaging+at+single+nerve+terminals+in+retinal+slices.">Patch-clamp capacitance measurements and Ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices.</a> J. Vis Exp. 59, e3345 (2012).</li><li>Housley, G. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+the+action+of+acetylcholine+on+isolated+outer+hair+cells+of+the+guinea+pig+cochlea.">Direct measurement of the action of acetylcholine on isolated outer hair cells of the guinea pig cochlea.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 244, 161-167 (1991).</li><li>Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+hearing+and+balance+in+zebrafish.">The genetics of hearing and balance in zebrafish.</a> Ann. Rev. Genetics. 39, 9-22 (2005).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

エンド臓器や細胞の穏やかな治療法を慎重に切開は、健康、無傷と生理活性有毛細胞の単離に成功するために重要です。次のヒントに従うことにより、成功を保証します： <ol><li>それはより小さい魚（長さ2〜2.5センチメートル）から健康な細胞を得ることが容易である。大きい魚は解剖プロセス中にその曖昧な視覚化、より多くの脂肪滴を持つ。 </li><li>有毛細胞を覆っている耳石を、削除する場合は、注意が必要。鉗子で耳石を掴ん時にセルには触れないでください。 </li><li>斑と頂がシートや上皮から粉砕細胞としてリフトオフされるときに最良の結果が得られる。 </li><li>我々は、人間のまつげのようにテーパーが少なく柔軟ではありません7を使用することを含め、他の方法より優れていることが細胞をひいて粉にするために犬の毛の使用を見つける。 </li><li>パッチクランプ法、tに正圧印加時それは先端を清潔に保つことが重要である空気/溶液界面を通過する際に、彼は電極。電極上に &quot;ジャンプ&quot;するには、セルを有効にするには、正圧のリリースも重要である。この方法は、このようにセルとgigaohmシールを形成する可能性を高める、アウェイチップからアンホテリシン含有の少量の溶液をクリアします。私たちの実験では、代わりに、より伝統的な細胞全体の構成のために、細胞の脆弱性の穿孔パッチ記録法を使用しています。 gigaohmシールの損失でしばしば結果 &quot;全細胞を行く&quot;しようとしています。 </li></ol>ここで説明する方法は、動物ごとに健康な髪の細胞の何百ものをもたらすでしょう。技術は室温で行い、解剖顕微鏡を超えて、特別な機器を必要とすることはできません。 JOVEにおける前回の報告書では、腹側アプローチ8を使用したゼブラフィッシュ内耳の解剖について説明します。これらの著者はdisseを実証全体的には、パラホルムアルデヒド固定内耳器官のction。私達は私達の方法との比較のためにこの動画を視聴するには、読者を奨励しています。ここで紹介する方法の利点の一つは、生理的な調査のための有用な生細胞の取得です。これらの細胞の使用は容量測定を11,12にすることによって、細胞共鳴9,10、モニターの神経伝達物質の放出を検討するように拡張することができます（ここに示されているように）電位依存性チャネルを研究するためのパッチクランプ実験に使うだけでなく、によって誘導される神経調節を調べるリガンド依存性チャネル13の活性化だけでなく、聴覚やバランス14の両方に影響を及ぼす変異体を用いたから収集することができ、豊富な情報を活用する。

<table border="1"><tbody><tr><td> ソリューション名 </td><td> レシピ </td></tr><tr><td> （a）はNZR（ノーマルゼブラリンゲル）（mMで） </td><td> 116のNaCl、2のKCl、CaCl 2の 2、3グルコース、5のNa + - HEPES、pHは7.35。 </td></tr><tr><td> （b）はNZR + Tricaine </td><td> NZR +0.02％3 - アミノ安息香酸エチルエステルメタンスルホン酸（シグマA5040）。 </td></tr><tr><td> （c）はNZR + BSA </td><td> NZR + 0.4％ウシ血清アルブミン（シグマA2153）。 </td></tr><tr><td> （d）はLoCaS（低Ca 2 +溶液）（mMで） </td><td> 100のNaCl、2のKCl、0.05のCaCl 2、0.05のMgCl 2、3、グルコース、30 Na +非 HEPES、pHは7.35。 </td></tr><tr><td> （e）のLoCaS +パパイン</td><td> LoCaS +0.05％L-システイン（シグマC1276）+ 0.2％パパイン（シグマP3375）。 </td></tr><tr><td> （f）はK +内部 ​​液（mMで） </td><td> 52 K 2 SO 4、38のKCl、1 K +-EGTA、5 K +-HEPES、pHは7.3。 </td></tr></tbody></table> 表1。ソリューション。

patch clamp recordings in inner ear hair cells isolated from zebrafish

種々の種から単離された感覚有毛細胞の電位依存性チャネルのパッチクランプ解析は、1月4日以前に説明したが、この動画はゼブラフィッシュから有毛細胞へのそれらの技術の最初のアプリケーションを表してきた。球形嚢、つぼ、卵形嚢と三半規管：ここでは、内耳のエンド臓器すべてから健康な無傷の有毛細胞を単離するための方法を示しています。さらに、私たちは、有毛細胞のサイズと形態の多様性を発揮し得ることができるパッチクランプ記録の種類の例を与える。他のものに比べて、このゼブラフィッシュモデルシステムを使用することの利点は、聴覚とバランスの両方に影響を及ぼすゼブラフィッシュ突然変異体の利用に起因しています。トランスジェニック系統と遺伝的解析と操作、細胞単離および電気生理学的手法を利用する他の技術の使用との組み合わせでロール有毛細胞pに大きな洞察を促進しなければならないここで紹介これらの感覚モダリティを媒介することに横たわっていた。

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Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

このビデオの目的は、成人のゼブラフィッシュの内耳器官から健康な無傷の有毛細胞を取得した後、それらの電位依存性チャネルの生物物理学的特性を特徴付けることを目的としたパッチクランプ研究のためにそれらを使用するための手順を示すことである。

内耳有毛細胞におけるパッチクランプ記録は、単離されたゼブラフィッシュから

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

patch-clamp-recordings-in-inner-ear-hair-cells-isolated-from-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K ビュー.  Pepperdine University. このビデオの目的は、成人のゼブラフィッシュの内耳器官から健康な無傷の有毛細胞を取得した後、それらの電位依存性チャネルの生物物理学的特性を特徴付けることを目的としたパッチクランプ研究のためにそれらを使用するための手順を示すことである。

ビデオ: Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

暗順応スライス標本におけるマウス網膜神経細胞からパッチクランプ記録

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

神経科学

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

モーターニューロンとターゲットゼブラフィッシュの骨格筋からの対のパッチクランプ記録

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the postsynaptic activity of a single ribbon synapse 1-4. Ribbon synapses of sensory cells release neurotransmitter continuously, the rate of which is modulated in response to graded changes in IHC membrane potential 5. Ribbon synapses have been shown to operate by multivesicular release, where multiple vesicles can be released simultaneously to evoke excitatory postsynaptic currents (EPSCs) of varying amplitudes 1, 4, 6-11. Neither the role of the presynaptic ribbon, nor the mechanism underlying multivesicular release is currently well understood.
The IHC is innervated by 10-20 auditory nerve fibers, and every fiber contacts the IHC with a unmyelinated single ending to form a single ribbon synapse. The small size of the afferent boutons contacting IHCs (approximately 1 &mu;m in diameter) enables recordings with exceptional temporal resolution to be made. Furthermore, the technique can be adapted to record from both pre- and postsynaptic cells simultaneously, allowing the transfer function at the synapse to be studied directly 2. This method therefore provides a means by which fundamental aspects of neurotransmission can be studied, from multivesicular release to the elusive function of the ribbon in sensory cells.

Whole-cell patch-clamp recordings from auditory nerve fiber dendrites at the inner hair cell ribbon synapse in the mammalian cochlea.

蝸牛内有毛細胞に接触求心性樹状突起でのシナプス後録音：リボンシナプスでのモニタリングの多胞体のリリース

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

フローサイトメトリーを用いてマウスの内耳の組織からのLacZの発現細胞を単離する

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

開発マウス内耳への遺伝子導入による<emインビボで&gt;</em&gt;エレクトロポレーション

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

胚ゼブラフィッシュマウスナー細胞からパッチクランプ記録

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Morphologically-と神経化学的に特定し海馬介在ニューロンからホールセルパッチクランプ記録

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

急性脳スライスにおけるニューロンマイクロ回路の電気生理学的および形態学的特徴は、ペアパッチクランプ記録を使用して、

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

脳スライスにおける全細胞パッチクランプ記録

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

黒質ドーパミンニューロンの細胞体樹状突起のドメインからの亜細胞パッチクランプ記録

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...