この作品は、顎に助成＃1R21NS078582-01の下に交付金＃IOS-1025627の下で国立科学財団によってと米国立衛生研究所によってサポートされていました

このプロトコルは、細菌感染にさらさハエから収集された四つの異なる読み出しを取得する2つの設定（ 図1）を使用しています。 2）生存転帰;、3）その場で細菌負荷、4）in vivoにおける NFκBのレポーター活性のリアルタイム測定、これらの出力）はスリープ/スリープ解除の動作を1が含まれています。 ショウジョウバエで利用可能な遺伝学的ツールとの組み合わせでは、これらの測定は、免疫機能と動作の間の分子リンクに機械論的な洞察を提供します。 1。ハエの自発運動と睡眠を測定<ol><li> ショウジョウバエの活動モニタリングシステム（DAM2、Trikinetics）、インキュベーター、暗い部屋、実験動物および活動チューブの調製を含むハエの自発運動と睡眠を測定するために使用する設定は、6以前に記載されている。同じアプローチはいくつかのマイナーな修正を加えて、ここで使用されます。 <ol class="lalpha"><li&gt;インキュベーターの照明はインキュベーター自体によって制御されます。したがって、コンピュータとインキュベータの間で時間設定を同期させることが重要です。 </li><li>活動チューブを脱イオン水でホットプレート上で沸騰することで再利用するために掃除されています。少量の洗剤第一沸騰のために追加され、試験管をよくすすぎ、さらに2回煮沸する。糸がチューブを接続するときに使用している場合、使用される活性チューブ（食品、ワックス、ハエや糸を含む）は、糸の前に除去することなく洗浄することができます。 </li></ol></li><li>事前の実験を開始し、後半蛹を含む場所培養は実験的な照明などの環境条件に適応するために3〜4日間インキュベーターでハエを上演した。ライト：暗い場所や、一定の条件は、一般的に睡眠行動を測定するために使用されてきた。この例では、ハエは免疫応答や行動2,7,8で体内時計の影響を排除するために一定の光に順応する。 図1Aに記載されているように</strongは&gt;、Trikinetics DAM2活動へのロード1から4日齢のハエは感染の前に6を用いて説明し、3日間以上のレコード監視します。 </li></ol> 2。細菌の病原性株とハエに感染<ol><li>ここで説明されたプロトコルは、S.に対して特異的である成長し、維持するのは簡単ですマルセッセンス 、。他の細菌種に対する長期保管および培養条件のためのプロトコルが異なります。S.マルセッセンスを -80℃で15から50パーセントのグリセリンに格納されています1.5 mlのマイクロチューブにオートクレーブし、50％グリセロールの1ボリュームに-長期保存のために準備するために、一晩細菌培養の2倍量（1.0 OD 600 = 0.5）を混ぜます。これは17％の最終グリセロール濃度になります。 -80℃でチューブ℃で保存細菌のソース用に短期を準備するために、無菌200μlのピペットチップで凍結ストックをこすりとLB寒天プレート上で三方連勝を行う。 37＆dで一晩静置し例えば、C分離したコロニーを取得する。 4℃でプレートを保存する スケジュールされた感染前のある日、5 mlのLB培地を含む培養チューブに無菌200μlのピペットチップと水没先端を含むLB寒天プレートからシングルコロニーを拾う。それが指数増殖期に達するまで細菌の一晩、または37℃、250rpmでインキュベーターシェーカー内部まで16時間を栽培しています。 OD 600における分光光度計を用いて濃度を測定する。この段階での濃度は0.5〜1の範囲である。濃度が高すぎると、菌を継代培養し、最適な濃度を得るために別のいくつかの時間のために成長します。炎源の近くに手順を実行します。いくつかの細菌株は抗生物質耐性用に設計され、成長し、適切な抗生物質のために選択されている培地に添加する。S.はマルセッセンス （ATCC＃8100）は、抗生物質耐性ではないので、抗生物質なしで無菌培地で栽培されています。滅菌技術を検証するために、モックcultuを行うコントロールとして細菌ずに再。 ハエに感染するソリューションは、細菌（= 0.1 OD 600に希釈したもの）と、PBS中の1％の食品着色料（ブリリアントブルーFCF）が含まれています。感染溶液及びPBS中1％青い食品着色料で使用されてLB培地と同等の量を追加することで、噴射制御のためのソリューションを用意してください。氷の上でソリューションを格納します。 </li><li>ハエを注入するためのガラス針を準備します。マイクロピペットプラー（ナリシゲ）を使用して細かい先端にガラスキャピラリーを（OD = 1ミリメートルは、id = 0.58ミリメートル、WPI）引き出します。解剖顕微鏡下では、開口部が注射器で吸引して適用することによって、注射液で埋めるのに十分な大きさであるように、針の先端を断つために細かい鉗子を使用していますが、注入プロセスの間にフライへのダメージを最小限に抑えるのに十分に小さい。先端を破った後に、チップサイズは40〜50μm程度である必要があります。ガラス針は、チューブの長さと3ccのプラスチックシリンジに接続されています。注射媒体の流れを正圧またはs適用手動で制御されるシリンジではじめ。注射器装置は感染および制御注射の両方に使用されているように、注射液とゴム管を汚染しないようにします。 </li><li> CO 2のパッドの上にそれらを置くことによって、ハエを麻酔。 CO 2はパッドを加湿するとパッドの上にハエの操作が複雑になる可能性があり、静電気を低減するために、水の密閉容器を介して渡されます。背側胸部の胚盤の上の領域にガラス針をつつくことでハエを注入します。フライへの注射媒体の受け渡しは食品着色料によって検証されます - ハエは、システムを介して食品着色料の普及に青に変わります。第3節で説明したようにハエが受け取る細菌の投与量は、下記に定量することができる。いくつかの実験的なデザインは、PBSおよび食品着色料ではなく細菌なしでハエを注入することにより無菌傷害を受け取るコントロールの基が挙げられる。 </li></ol> 3。細菌負荷を決定する evaluatinする一つのアプローチグラム細菌感染に対する免疫応答は、細菌負荷の感染後を決定することである。D.ショウジョウバエは、全体のフライは、個々の内総細菌数を推定するために均質化することができるので、このパラメータを決定するのに最適なモデルです。このプロトコルの背後にある理論的根拠は、ルリア培地（LB）をシャーレに寒天培地（LBプレート）などの固体培地上で増殖させたときに、単一の細菌が目に見える区別コロニーを形成しているということです。したがって、ホモジネートの連続希釈液を生成し、LBプレート上に希釈したホモジネートを広め、LB液体培地で感染したハエを均質化することにより、その場に感染する細菌細胞の数を決定することができる。 PBSおよび食品着色料ではなく細菌なし注入ハエの対照群は、感染が他の細菌種で汚染されていないことを確認するために使用されるべきである。この状態でLB寒天プレート上にコロニーがあってはならない。 <ol><li>このために使用されるすべての材料をオートクレーブ実際の均質化ステップを実行する前に手順。これは、均質化のために使用はさみ、LB培地、および乳棒で切断200μlのピペットチップが含まれています。ハエを均質化する前に、少なくとも1日10センチメートル滅菌シャーレにオートクレーブしたLB /寒天培地を注ぐことによってプレートを準備します。 </li><li>麻酔して、氷上に1.5 mlのマイクロチューブや店舗チューブにハエを集める。 </li><li>汚染を防ぐために、火気の近くで均質化を行う。例えばS.として菌株を使用する場合は特に感染せずにハエを含む制御均質化することをお勧めします抗生物質耐性はありませんマルセッセンス 、。 10ハエ当たり各実験条件の2つのグループの最小値をホモジナイズする。ホモジネートごとに使用されるハエの数は実験によって決定されます。他はホモジネート当たり3月10日ハエから使用している間、いくつかのグループは、個々のハエ8の間の細菌負荷の変動を評価するために有用である、ホモジネートごとに1つのフライを使用していた9月12日遺伝子型又は実験条件間で比較します。 <ol class="lalpha"><li>ハエを含む各マイクロチューブに400μlのLB培地を追加し、小型モーターおよび乳棒（Kontes）を使用して均一化する。 </li><li>滅菌カットピペットチップを使用して、シリアルは180μlのLB培地を含む1.5μlの微量遠心チューブに20μlの均質化されたLB /細菌の培地を加えてホモジネート1:10に希釈します。カッティングピペットチップは、フライ破片から閉塞を防止し、適切なボリュームが転送されていることを保証します。 </li><li>希釈倍率は、経験的に決定し、ハエの遺伝子型は、使用した細菌株、実験条件に依存しています。 Sで感染した野生型ハエ用マルセッセンスは 、感染後直ちにホモジナイズハエのために1時10分2または1:10 3の希釈液を使用し、ハエのために1時10分4または1:10 5の希釈は、24時間後の感染を均質化した。 </li><li>マイクからの100μlのLB /細菌の培地を追加最終希釈を含むチューブをrocentrifugeと均等な分配を確保するためのガラス玉（VWR）を使用してLBプレートに培地を広げた。 </li><li> 100％EtOHを溶液中にガラス球を捨ててください。一晩37℃のインキュベーター中でLBプレートを置きます。 </li><li>オプションの手順として、LBプレート（;アルファイノテックFluorChem 8900）の画像を得るために可視光での撮像システムを使用しています。プレート自体に、またはPhotoshopソフトウェア（Adobe PhotoshopのCS3）でカウントツールを使用してプレートの画像のいずれかからのコロニー数をカウントします。 </li><li>式を使ってフライあたりのコロニー形成単位数を計算します[N /（N * D * V）] * V、どこLBプレート上に生育したコロニーの数N = N = 1にプールハエの数微量遠心チューブ、D =希釈係数であり、v各プレート上に広げソリューションの=体積、Vホモジネート=初期体積。 </li></ol></li></ol> 4。感染後スリープと生存期間を評価<ol><li>のために細菌負荷を測定するために収穫されていないハエは、別の7から10日間の行動を監視し続ける。生存期間は、ハエの遺伝子型は、環境条件、および感染に使用細菌種によって影響される。 </li><li> 〜10日後に、実験を終了し、以前にダウンロードし6に記載されているように行動データを処理します。 Matlabで基づいているInsomniac2カスタムソフトウェアは、睡眠パラメータを分析するために使用されています。行動分析から死んだハエを排除することが重要です。通常、これは感染症やハエ遺伝子型の種類に応じて、感染後最初の日内に分析を制限します。アッセイにおける死はすべての活動カウントがゼロに達した時点で示されます。生存率の分析を容易にするために、Drosonexは、Microsoft Visual Basicで記述されたカスタムソフトウェアはC + + 6.0、TrikineticsのDAMシステムからの生データファイルを処理するために使用されます。 Excelファイル、各ハエの生存期間（時間単位）などのソフトウェアレポートは、アクティビティのdatをコンパイルすべてのモニタから単一のスプレッドシートに変換し、％はユーザによって設定され、時間の経過存続飛んで報告します。 Excelファイルは、さらなる分析のために他の統計ソフトウェアパッケージに統合できるように設計されています。 </li></ol> 5。ルシフェラーゼレポーターアッセイを用いて感染中NFκBの活性を測定するクオらで説明したように、このアッセイで用いられるトランスジェニックκB-Lucのハエは、以前に生成されていました。、2010 2。簡単に言えば、κB-LUCレポーターは、ルシフェラーゼオープンリーディングフレームの上流プロモーターを挿入したNFκB結合配列の8反復を含む。 <ol><li>セクション1.2に記載されている実験の照明条件にハエを調整します。この例では、1から4日齢κB-lucのハエは感染時に他のハエと同じ年齢に到達するために2日間、5％スクロースを含むバイアル内に収容された2％寒天食品媒体と定常光（LL）に配置されます。 </li><li>ハエ用の96ウェルマイクロプレートを準備します。各ウェルは、食品中の2つの層（ 図2）が含まれている 、トップ層は、ルシフェリン、ルシフェラーゼの基質を含んでいます。 5％スクロース、各ウェルに2％寒天溶液300μlを加え、凝固させる。次に、各ウェルを含む5％スクロース、1％寒天、および2 mMルシフェリン（ゴールドバイオテクノロジー、株式会社）に50μlのトップ層を追加します。 ショウジョウバエにおけるレポーター活性を測定するために使用されるルシフェリン濃度は文献に変化している、及び100μM13限り低くなっている。必要な濃度は、経験的に決定することができます。食品層を分配する間、無菌性を維持しながら、乾燥を促進するために細かいメッシュの布でカバープレート。プレートは凝縮液滴中に立ち往生からハエを防ぐために、最長1時間、徹底的に乾燥させなければならない。ルシフェリンは、光に敏感であるため、必要以上に光にプレートをさらすことは避けてください。 </li><li>明確な接着フィルム（トップを適用96ウェルマイクロプレートにパーキンエルマー）とウェルあたり2つの穴の量で細い針を使用して穿孔し、シール - 。これらの穴は、各ウェルに空気の交換を許可していませんが、また個別にハエを麻酔する方法を提供します。鋭い刃とストレートエッジを使用して、各列の間のカットを紹介します。これは、一度に8つのグループでハエをロード/アンロードするための簡単​​な方法を提供します。 マイクロウェルプレートにハエをロードするには、CO 2のパッドの上にインキュベーターと麻酔ハエからバイアルを取り外します。負荷が列ごとに各ウェルに一つずつ飛ぶ。彼らは頻繁に介入することなく、自分自身を解放することができるように接着シールにはまりうっかり飛ぶべきで、単独でフライにしておきます。 8から24時間、新しい環境に適応するとルシフェリン基質を消費するためにLLのインキュベーターにマイクロウェルプレートを返します。 </li><li>培養菌、S.マルセッセンス 、前述のように感染の溶液を調製します。 </li><li> Anaesthetizeトン彼は低気圧のCO 2回線に接続されているマイクロピペットチップを使用することによって飛ぶ。直接各ウェルのために作られた通気孔の上にマイクロピペットチップを置きます。 CO 2の圧力がフライをanaesthetizeに十分高いが、フライへの損傷を防ぐのに十分な低さであることを保証するために十分に注意ください。 8つのグループで、個別にCO 2のパッドにそれぞれのフライを転送し、上記のように感染します。感染後、その元々のウェルに各フライ返し、マイクロプレートを封印してください。 </li><li>メジャー発光（トップカウント-NXTの発光とシンチレーションカウンター、パーキンエルマー社）。トップカウントルミネッセンスカウンターは時間の任意の長さ（通常は最大5日間）のための所望の刻みで連続してプログラムされ、自動化された測定値を可能にするプレートの積み重ねカセットを含む。この機能は、すべての楽器に使用できず、他の楽器を用いて行った実験のデータ収集は、したがって、それほど頻繁かもしれません。ルミネッセンスカウンターがRO内に収容されている制御された温度と照明のスケジュールとオム。スタッキングカセットにプレートをロードするときに、ハエが光を受けることを確保するための明確なブランクプレート間のハエを含むプレートを積み重ねる。測定値を24 hrの最小毎時間を収集するために、製造業者の仕様に従ってプログラムルミノ。この例では、検出器が10秒間、各ウェルを読み取り、秒当たりのカウント数（任意の単位）として結果を表現するためにプログラムされています。この値は、ウェル当たり3の測定値を平均しています。スプレッドシートへのデータファイルをエクスポートし、標準的な分析を行い、発光の結果をグラフ化する。 </li></ol>

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J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+sleep+and+circadian+mutants+reveals+mechanisms+underlying+regulation+of+sleep+in+Drosophila.">A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila.</a> Sleep. 31, 465-472 (2008).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

このプロトコルは、どのような動作を調査するためのアプローチを概説し、特に睡眠、免疫応答パラメータにリンクされています。これらのパラメータは、in vivoでのルシフェラーゼレポーターによって測定された細菌負荷、生存転帰、およびNFκB活性が挙げられる。一緒に、これらのパラメータは、ハエは感染と闘うことができるどれだけの情報を提供します。細菌負荷と生存転帰は?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 材料名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>パーシバルサイエンティフィック株式会社</td><td> I30BLLC8 I36VLC8 </td><td>プログラムされた光/温度スケジュールを実行することが可能な任意のインキュベーターが適切である。 </td></tr><tr><td> ショウジョウバエ Activitiyモニター</td><td> Trikinetics社、マサチューセッツ州ウォルサム</td><td> DAM2 </td><td>他の場所で6説明したように、このシステムは、コンピュータインターフェース、ソフトウェア、および他の付属品を必要とします。 </td></tr><tr><td>パイレックスガラス管</td><td> Trikinetics社、マサチューセッツ州ウォルサム</td><td> PGT-5x65 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートシンチレーションおよび発光カウンター</td><td>パーキンエルマー</td><td>トップカウントNXT 12検出器</td><td>発光を検出することが可能な任意のマイクロプレートリーダーは、レポーターアッセイのこのタイプのために使用することができます。トップカウントは、複数の検出器と自動スタッカーが入っていますが、複数のプレートから連続的に読み取るようにプログラムされることが可能である。 </td></tr><tr><td> FluorChem 8900 </td><td>アルファイノテック</td><td></td><td>細菌培養のイメージングは​​オプションです。可視光機能を備えた任意のデジタルイメージングシステムで十分です。 </td></tr><tr><td>マイクロピペットプラー</td><td> Tritechリサーチ社</td><td>ナリシゲPC-10 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 用品 </td></tr><tr><td>ホウケイ酸塩のガラス管</td><td>世界の精密計測器株式会社</td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> 3 mlのシリンジ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BD 305482 </td><td></td></tr><tr><td>注射針</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> BD 305196 </td><td> 18 G - 配管の損傷を防ぐために、針の先端を切り落とした。 </td></tr><tr><td>シリコーンチューブは、id（0.030 &quot;）外径（0.065&quot;）の壁厚さ（0.018 &quot;） </td><td> VWR </td><td> 60985-706 </td><td>シリンジにガラスキャピラリー針を取り付けるために使用される</td></tr><tr><td> 3方活栓</td><td>アメリカンPharmaseal会社</td><td> K75 </td><td></td></tr><tr><td> Kontesペレット杵コードレスモーター</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> K749540-0000 </td><td></td></tr><tr><td> Kontesペレット杵</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> 3ミリメートルガラス球</td><td> VWR </td><td> 26396-630 </td><td></td></tr><tr><td>マイクロマイクロライト1 + </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 7571 </td><td>セレクトン発光に適した96ウェルプレートには、 - 彼らは不透明でなければなりません。 </td></tr><tr><td> TopSeal-:96ウェルマイクロプレート</td><td>パーキンエルマー</td><td> 6005185 </td><td>マイクロプレス上の接着封止膜</td></tr><tr><td> D-ルシフェリン、カリウム塩</td><td>ゴールドバイオテクノロジー、（株） </td><td> LUCNA </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ソフトウェア </td></tr><tr><td> Insomniac2 </td><td>作者に要望に応じて利用できる</td><td>カスタム;レスリーアッシュモア博士によって書かれた（ウェストミンスター大学） </td><td>睡眠2,6,11の分析のために日常的に使用されているMATLABベースのソフトウェア</td></tr><tr><td> Drosonex </td><td>作者に要望に応じて利用できる</td><td>カスタム;トーマスCoradetti（歩道ソフトウェア）によって書かれた</td><td>で収集された生データファイルから生存分析に使用するPC MSVC6プログラムTrikineticsシステム</td></tr><tr><td> Photoshop CS3の</td><td>アドベ</td><td></td><td>デジタル画像（オプション）からのcfu /プレートの番号を得るために有用</td></tr></tbody></table>

quantitative measurement of the immune response and sleep in drosophila

免疫応答とホストの動作の間の複雑な相互作用は、種の広い範囲に記載されている。過剰睡眠は、特に、哺乳類1感染に対する反応として起こることが知られており、また、最近、 キイロショウジョウバエ 2に記載されている。これは、一般的に睡眠が感染時に宿主に有益であり、それは強力な免疫システム3,4の維持に重要であることが受け入れられている。しかし、この仮説を支持する実験的証拠は、4限られており、免疫応答時の過剰睡眠の機能は不明なままである。我々は、この複雑な問題に対処するための学際的なアプローチを使用していて、単純な遺伝モデル系、ショウジョウバエキイロショウジョウバエの研究を行ってきた。我々はハエの運動行動と睡眠を測定するための標準的なアッセイを使用し、このアッセイはハエinfecteにおける挙動を測定するために使用される方法を示してい細菌の病原性株でd。このアッセイはまた、感染時に個々のハエの生存期間を監視するのに役立ちます。免疫機能の追加措置は、感染症およびNFκB、 ショウジョウバエの自然免疫応答の中心となる重要な転写因子の活性化をクリアするハエの能力を含んでいます。感染時の生存転帰と細菌クリアランスの両方が一緒に感染に対する抵抗性と寛容の指標である。許容範囲は、感染による被害を制限し、それによりシステム5内病原体の高レベルにもかかわらず、生き残るためには、ホストの能力と定義されていて抵抗が、感染をクリアするには、ハエの能力を指します。感染中のNFκB活性のリアルタイム監視は、感染時に生存の分子機構への洞察を提供します。これらの簡単なアッセイにおけるショウジョウバエの使用は睡眠の遺伝学的および分子生物学的解析を容易にと免疫応答とどのようにこれらの2複雑なシステムが相互に影響を受けています。

<ol><li>感染症は、睡眠を促進する。前述したように、この例では、NFκBの遺伝子、 レリッシュ（REL E20）14を欠くカントン-S（CS）は、野生型ハエや変異ハエは2 DAM2アクティビティモニター（各遺伝子型についてn = 32）にロードされ、感染していた。ハエが動作し、感染2,7,8で概日時計の影響を排除するために一定の光の中で維持した。 DDBJリリースE20の変異体は、以前...

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Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

免疫応答と行動の間のリンクを理解するために、我々は中に運動行動を測定する方法を説明します<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;細菌感染だけでなく、モニタリングの生存、細菌負荷、及び先天性免疫、NFκBの重要な調節因子でのリアルタイムのアクティビティによって免疫応答をマウントするには、ハエの能力の中に。

免疫応答やスリープ中の定量的測定<em&gt;ショウジョウバエ</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

quantitative-measurement-immune-response-sleep

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

15.3K ビュー.  University of Pennsylvania Perelman School of Medicine. 免疫応答と行動の間のリンクを理解するために、我々は中に運動行動を測定する方法を説明しますショウジョウバエ細菌感染だけでなく、モニタリングの生存、細菌負荷、及び先天性免疫、NFκBの重要な調節因子でのリアルタイムのアクティビティによって免疫応答をマウントするには、ハエの能力の中に。

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Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development of vaccines and therapeutics1,2,3. Here, we describe a method for the detailed phenotypic and functional analyses of cellular immune responses, specifically intracellular cytokine production by CD4+ and CD8+ T cells as well as the individual memory subsets. We obtained precise quantitative and qualitative measures for the production of interferon gamma (INF-) and interleukin (IL) -2 in both CD4+ and CD8+ T cells from the rhesus macaque PBMC stimulated with PMA plus ionomycin (PMA+I). The cytokine profiles were different in the different subsets of memory cells. Furthermore, this protocol provided us the sensitivity to demonstrate even minor fractions of antigen specific CD4+ and CD8+ T cell subsets within the PBMC samples from rhesus macaques immunized with an HIV envelope peptide cocktail vaccine developed in our laboratory. The multicolor flow cytometry technique is a powerful tool to precisely identify different populations of T cells 4,5 with cytokine-producing capability6 following non-specific or antigen-specific stimulation 5,7.

We demonstrate the utility of multicolor flow cytometry for detailed phenotypic and functional characterization of total as well as memory subsets of CD4+ and CD8+ T cells in rhesus macaques, the ideal model for HIV/AIDS vaccine studies.

アカゲザルの細胞性免疫応答のマルチカラーフローサイトメトリー解析

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

免疫・感染学

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

の寄生蜂の紹介<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;と抗寄生虫免疫応答

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

ゼブラフィッシュにおける自然免疫の健康の指標として呼吸バースト応答の定量化

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

マウスマクロファージにおける先天性免疫応答を調査するために、RNA干渉を使用

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

マウスにおける宿主の免疫応答を評価する口腔咽頭気管内PAMP管理および気管支肺胞の活用

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

西ナイルウイルス変異株の感染に対するMyD88非介在細胞性免疫応答のインビトロ分析

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

のゼブラフィッシュ幼生モデルにおける先天性免疫応答の非侵襲的イメージング<em&gt;ストレプトコッカスイニエ</em&gt;感染

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

フローサイトメトリーをイメージングを用いた人間システムの免疫シナプスの定性・定量分析

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

リポ多糖投与マウス肝臓における免疫応答時に白血球の二光子励起生体イメージング

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...