עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומי למדע במסגרת מענק # IOS-1025627 ועל ידי המכון הלאומי לבריאות במסגרת המענק # 1R21NS078582-01 ללסת

<ol>
	<li>Majde, J. A., Krueger, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Links+between+the+innate+immune+system+and+sleep.">Links between the innate immune system and sleep.</a> J. Allergy Clin. Immunol. 116, 1188-1198 (2005).</li><li>Kuo, T. H., Pike, D. H., Beizaeipour, Z., Williams, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+triggered+by+an+immune+response+in+Drosophila+is+regulated+by+the+circadian+clock+and+requires+the+NFkappaB+Relish.">Sleep triggered by an immune response in Drosophila is regulated by the circadian clock and requires the NFkappaB Relish.</a> BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).</li><li>Preston, B. T., Capellini, I., McNamara, P., Barton, R. A., Nunn, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parasite+resistance+and+the+adaptive+significance+of+sleep.">Parasite resistance and the adaptive significance of sleep.</a> BMC Evol Biol. 9, 7 (2009).</li><li>Imeri, L., Opp, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+(and+why)+the+immune+system+makes+us+sleep.">How (and why) the immune system makes us sleep.</a> Nat. Rev. Neurosci. 10, 199-210 (2009).</li><li>Ayres, J. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Signaling+Protease+Required+for+Melanization+in+Drosophila+Affects+Resistance+and+Tolerance+of+Infections.">A Signaling Protease Required for Melanization in Drosophila Affects Resistance and Tolerance of Infections.</a> PLoS Biol. 6, e305 (2008).</li><li>Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assaying+Locomotor+Activity+to+Study+Circadian+Rhythms+and+Sleep+Parameters+in+Drosophila.">Assaying Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. (43), e2157 (2010).</li><li>Lee, J. E., Edery, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+Regulation+in+the+Ability+of+Drosophila+to+Combat+Pathogenic+Infections.">Circadian Regulation in the Ability of Drosophila to Combat Pathogenic Infections.</a> Curr. Biol. 18, 195-199 (2008).</li><li>Stone, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+circadian+clock+protein+timeless+regulates+phagocytosis+of+bacteria+in+Drosophila.">The circadian clock protein timeless regulates phagocytosis of bacteria in Drosophila.</a> PLoS Pathog. 8, e1002445 (2012).</li><li>Hill-Burns, E. M., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-linked+variation+in+immune+response+in+Drosophila+melanogaster.">X-linked variation in immune response in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 183, 1477-1491 (2009).</li><li>Short, S. M., Lazzaro, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female+and+male+genetic+contributions+to+post-mating+immune+defence+in+female+Drosophila+melanogaster.">Female and male genetic contributions to post-mating immune defence in female Drosophila melanogaster.</a> Proc. Biol. Sci. 277, 3649-3657 (2010).</li><li>Williams, J. A., Sathyanarayanan, S., Hendricks, J. C., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+sleep+and+the+immune+response+in+Drosophila:+a+role+for+the+NFkappaB+relish.">Interaction between sleep and the immune response in Drosophila: a role for the NFkappaB relish.</a> Sleep. 30, 389-400 (2007).</li><li>Ramsden, S., Cheung, Y. Y., Seroude, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+the+Drosophila+immune+response+during+aging.">Functional analysis of the Drosophila immune response during aging.</a> Aging Cell. 7, 225-236 (2008).</li><li>Williams, J. A., Su, H. S., Bernards, A., Field, J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+circadian+output+in+Drosophila+mediated+by+neurofibromatosis-1+and+Ras/MAPK.">A circadian output in Drosophila mediated by neurofibromatosis-1 and Ras/MAPK.</a> Science. 293, 2251-2256 (2001).</li><li>Hedengren, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relish,+a+central+factor+in+the+control+of+humoral+but+not+cellular+immunity+in+Drosophila.">Relish, a central factor in the control of humoral but not cellular immunity in Drosophila.</a> Mol. Cell. 4, 827-837 (1999).</li><li>Leulier, F., Rodriguez, A., Khush, R. S., Abrams, J. M., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+caspase+Dredd+is+required+to+resist+gram-negative+bacterial+infection.">The Drosophila caspase Dredd is required to resist gram-negative bacterial infection.</a> EMBO Rep. 1, 353-358 (2000).</li><li>Wu, L. P., Choe, K. -. M., Lu, Y., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+Immunity:+Genes+on+the+Third+Chromosome+Required+for+the+Response+to+Bacterial+Infection.">Drosophila Immunity: Genes on the Third Chromosome Required for the Response to Bacterial Infection.</a> Genetics. 159, 189-199 (2001).</li><li>Dionne, M. S., Ghori, N., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+is+a+genetically+tractable+model+host+for+Mycobacterium+marinum.">Drosophila melanogaster is a genetically tractable model host for Mycobacterium marinum.</a> Infect. Immun. 71, 3540-3550 (2003).</li><li>Romeo, Y., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+immunity:+methods+for+monitoring+the+activity+of+Toll+and+Imd+signaling+pathways.">Drosophila immunity: methods for monitoring the activity of Toll and Imd signaling pathways.</a> Methods Mol. Biol. 415, 379-394 (2008).</li><li>Lu, Y., Wu, L. P., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antibacterial+arm+of+the+Drosophila+innate+immune+response+requires+an+I{kappa}B+kinase.">The antibacterial arm of the Drosophila innate immune response requires an I{kappa}B kinase.</a> Genes Dev. 15, 104-110 (2001).</li><li>Koh, K., Evans, J. M., Hendricks, J. C., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+model+for+age-associated+changes+in+sleep:wake+cycles.">A Drosophila model for age-associated changes in sleep:wake cycles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 13843-13847 (2006).</li><li>Bushey, D., Hughes, K. A., Tononi, G., Cirelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep,+aging,+and+lifespan+in+Drosophila.">Sleep, aging, and lifespan in Drosophila.</a> BMC Neurosci. 11, 1471-2202 (2010).</li><li>Allee, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The social life of animals. , (1938).</li><li>Stanewsky, R., Jamison, C. F., Plautz, J. D., Kay, S. A., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+circadian-regulated+elements+contribute+to+cycling+period+gene+expression+in+Drosophila.">Multiple circadian-regulated elements contribute to cycling period gene expression in Drosophila.</a> Embo. J. 16, 5006-5018 (1997).</li><li>Levine, J. D., Funes, P., Dowse, H. B., Hall, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+analysis+of+behavioral+and+molecular+cycles.">Signal analysis of behavioral and molecular cycles.</a> BMC Neurosci. 3, 1 (2002).</li><li>Ayres, J. S., Schneider, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+anorexia+in+resistance+and+tolerance+to+infections+in+Drosophila.">The role of anorexia in resistance and tolerance to infections in Drosophila.</a> PLoS Biol. 7, e1000150 (2009).</li><li>Plautz, J. D., Kaneko, M., Hall, J. C., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+photoreceptive+circadian+clocks+throughout+Drosophila.">Independent photoreceptive circadian clocks throughout Drosophila.</a> Science. 278, 1632-1635 (1997).</li><li>Huber, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleep+homeostasis+in+Drosophila+melanogaster.">Sleep homeostasis in Drosophila melanogaster.</a> Sleep. 27, 628-639 (2004).</li><li>Zimmerman, J. E., Raizen, D. M., Maycock, M. H., Maislin, G., Pack, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+video+method+to+study+Drosophila+sleep.">A video method to study Drosophila sleep.</a> Sleep. 31, 1587-1598 (2008).</li><li>Toth, L. A., Rehg, J. E., Webster, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+differences+in+sleep+and+other+pathophysiological+sequelae+of+influenza+virus+infection+in+naive+and+immunized+mice.">Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice.</a> J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).</li><li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state.">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li><li>Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+sleep+and+circadian+mutants+reveals+mechanisms+underlying+regulation+of+sleep+in+Drosophila.">A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila.</a> Sleep. 31, 465-472 (2008).</li></ol>

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

פרוטוקול זה מתאר את גישתו לחקור כיצד התנהגות, במיוחד לישון, קשורה לפרמטרי תגובה חיסוניות. פרמטרים אלה כוללים עומס חיידקים, תוצאות הישרדות, ופעילות NFκB כפי שנמדד על ידי עיתונאי לוציפראז in vivo. יחד פרמטרים אלה מספקים מידע על אופן שגם זבוב יכול להילחם בזיהום. עומס חיידקים ותוצאה הם הישרדות פרמטרי תגובה חיסוניים הכרוכים במדידה פשוטה בדרוזופילה. REL E20 מוטציות, אשר חסרה פקטור NFκB שעתוק שהוא מרכזי בתגובה החיסונית, נכנע במהירות לזיהום חיידקים. מניפולציות גנטיות או אחרות של התנהגות יכולות להשפיע גם על פרמטרי תגובה חיסוניים אלה, ככל הנראה על ידי המשפיע על פעילות NFκB עצמו. לדוגמה, מניעת שינה לפני עליית זיהום הביטוי של mRNA ממרח, ומפחית CFU / לטוס ביחס לבקרות שאינן מקופחות-11. MutanTS של הגנים של השעון, תקופת 7 ונצחי 8, דווח גם כדי להפחית הישרדות במהלך זיהום כמו גם פינוי חיידקים 8. מחקרים נוספים המשתמשים בגישה זו צפויים לספק תובנה מכניסטית לתוך כיצד התנהגות יכולה להשפיע על תפקוד מערכת חיסוני. הליך ההזרקה / זיהום שאנו מתארים כאן הוא שונים משיטה שתוארה בעבר על ידי הוו ואח&#39; 16. הליך זה הוא פשוט וזול. עם זאת, חסרון הוא שהשליטה הידנית של נפח הזרקה עם השימוש בצבע כמדד גס ויכול לתרום לשונות. קבוצות אחרות לא השתמשו microinjector לאפשר נפח הזרקה מתמדת 17, או שדקרו זבובים עם מחט טבולה בתרבות חיידקים 18. עם זאת, השיטה שהוצגה כאן הייתה מוצלחת באיתור שינויים בסילוק חיידקים על פני תנאי ניסוי 11,19 &lt;/ Sup&gt;. הישרדות של זבובים במהלך ההדבקה היא לכמת בדרך כלל על ידי לספור את הזבובים שנותרו במרווחי זמן קבוע. כאן אנו משתמשים במערכת DAM Trikinetics לפקח על זמן המוות בזבובים בודדים, אשר צוינו על ידי הפסקת הפעילות. אנחנו וידאנו שתוצאת ההישרדות כפי שנקבע ע&quot;י פעילות של תנועה היא זהה לזה שנקבע על ידי בדיקה ויזואלית של זבובים בצינורות הפעילות במהלך הדבקה (לא פורסם). שיטה זו שמשה גם בעבר למדידה אורך חיים 20,21. עם זאת, חשוב לציין כי ההערכה של הישרדות במערכת DAM מוגבל לזה בזבובים מבודדים, ושתוצאות הנגזרות ממצב זה צפויים להיות שונה מאלה בתנאים מקובצים. מחקרים מוקדמים הראו הבדלים בהישרדות, כאשר המארח הוא להציב בקבוצות לעומת תנאים מבודדים 22. העבודה האחרונה גם אשרה כי תוחלת חיים בקבוצות של זבובים ארוכהמזה שבזבובים בודדים 20. פעילות הכתב לוציפראז כבר שמש בעבר לניתוח של ביטוי גני שעון בחי זבובים (לדוגמה, 23 ref). במקרים אלה, שיקולים טכניים אחרים הם הכרחיים, במיוחד הדלדול של מצע luciferin אשר מתרחש על פני כמה ימים של ריצת assay. לעומת זאת, הבדיקה שתוארה כאן מוגבלת להישרדות של זבובים נגועים ומעורבת מדידה פשוטה מעל 24 שעות לאחר הדבקה. ANOVA צעדים חזר היה מספיק כדי להעריך את שינויים מנקודת ההתחלה בתוך כל קבוצה. גישות סטטיסטיות לניתוח תנודת יממה של כתבי וציפראז, יחד עם צעדי נורמליזציה לתקן לדלדול מצע הם דנו באופן מלא במקום אחר 24. בכל מקרה, מדידת פעילות עיתונאית בזמן אמת בזבובים בודדים היא שיטה יעילה יותר לחילוץ מידע על הדינמיקה הזמנית מאשר staמבחנים ביוכימיים וimmunohistochemical ndard. עם זאת, חסרון פוטנציאלי לניטור פעילות כתב לוציפראז in vivo הוא שזה תלוי באכילת זבובי מצע luciferin. אנורקסיה כבר קשורה לזיהום בזבובים, והאכלה עשויה גם להשתנות עם הסוג של זיהום או בין גנוטיפים 25. כדי לעקוף את החשש מפני בליעה של המצע, זבובים יכולים להיות גזורים לחלקי גוף שונים או ברקמות בעקבות זיהום, ופעילות כתבת ניתן למדוד בתרבות כפי שתואר לעיל 26. לחלופין, תוצאות מבדיקת לוציפראז ניתן גם אומתה באמצעות בדיקה סטנדרטית שאינו מסתמך על האכלה. לדוגמה, כמותית PCR כבר גישה נפוצה למדידת רמות ביטוי של mRNA מיקרוביאלית פפטיד (AMP). מגברים הם מטרות ידועות של NFκB, ולכן מצביעים על רמת פעילות שלה. הנציג datמתואר כאן לסכם עבודה קודמת שהראתה כי NFκB עולה עם אתגר חיסוני ועלייה שלאחר מכן בשינה 2. עם זאת, קוראים מוזהרים שהשינה במערכת DAM Trikinetics מסומנת על ידי חוסר פעילות למשך התקופה מינימאלית של חמש דקות רצופות 27. מדידה של שינה באוויר על ידי צילום וידאו גם מסתמכת על חוסר פעילות 28. הגדרת השינה בזבובים פוטנציאלי עלולה להיות בעייתית בזיהום, כי הוא ידוע גם שבעלי החיים אתגרו חיסוניים יהיו פעילים במשך תקופות ארוכות ללא שינה 29. כדי להתגבר על בעיה זו, מבחנים שההיענות חושית מידה דרושה כדי לוודא שזבובים הם אכן ישן. חוקרים קבעו את ההיענות של זבובים לגירויים חושיים, כמו עיפרון רז 30, שמברישים את צינורות פעילות עם מקל עץ 31, או חימום קצה אחד של צינור 27. בכל המקרים, זבובי שינה מגיבים פחות (נמדדאו על ידי או על ידי השהית תגובת אחוזי זבובים מגיבים כקבוצה) מזבובים ערים. אנחנו גילינו שזבובים נגועים ששינה הם אכן מגיבים פחות לגירויים חושיים עד 6-8 שעות לאחר פגיעה (TH. קואו וJA וויליאמס, תצפית לא פורסם). למרות המגבלות הטכניות, מערכת DAM Trikinetics מספקת יתרון תפוקה גבוהה שיהיה שימושי למחקרים עתידיים בזבובים הבוחנים קשר גנטי ומולקולרי בין שינה לתפקוד מערכת חיסון.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם חומר </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגים </td><td> תגובות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ציוד </td></tr><tr><td> חממות </td><td> פרסיבל מדעי, Inc </td><td> I30BLLC8 I36VLC8 </td><td> החממה מסוגל כל אחד פועל אור מתוכן / לוחות זמנים בטמפרטורה מתאימה. </td></tr><tr><td> תסיסנית Activitiy מוניטורים </td><td> Trikinetics Inc, Waltham, MA </td><td> DAM2 </td><td> כפי שתואר במקום אחר 6, מערכת זו דורשת ממשק מחשב, תוכנות ואבזרים אחרים. </td></tr><tr><td> פיירקס זכוכית צינורות </td><td> Trikinetics Inc, Waltham, MA </td><td> PGT-5x65 </td><td></td></tr><tr><td> נצנץ microplate ודלפק הארה </td><td>פרקין אלמר </td><td> TopCount NXT 12 גלאים </td><td> כל קורא מסוגל לאתר הארת microplate ניתן להשתמש עבור סוג זה של בדיקת כתב. TopCount מכיל גלאים מרובים ומערה אוטומטי; הוא מסוגל להיות מתוכן לקריאה רציפה מצלחות מרובות. </td></tr><tr><td> FluorChem 8900 </td><td> אלפא Innotech </td><td></td><td> ההדמיה של תרבויות חיידקים היא אופציונלית; כל מערכת הדמיה דיגיטלית עם אור יכולת החזותית היא מספיק. </td></tr><tr><td> Micropipette פולר </td><td> Tritech Research, Inc </td><td> Narishige PC-10 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ספקים </td></tr><tr><td> ורוסיליקט זכוכית נימים </td><td> Precision Instrument בע&quot;מ העולם </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> 3 מזרק מ&quot;ל </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BD 305482 </td><td></td></tr><tr><td> מחטי מזרקים </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> BD 305196 </td><td> 18 G - לחתוך את הקצה של המחט כדי למנוע ניזק לצינור. </td></tr><tr><td> אבובי סיליקון, איד (0.030 &quot;) (0.065 OD&quot;) עובי דופן (0.018 &quot;) </td><td> VWR </td><td> 60985-706 </td><td> משמש לחיבור מחטי זכוכית נימים למזרק </td></tr><tr><td> ברזלי 3 דרך </td><td> חברת Pharmaseal אמריקנית </td><td> K75 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes גלולת עלי מוטור אלחוטי </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> K749540-0000 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes גלולת עלי </td><td> הפישר סיינטיפיק </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> כדורי זכוכית 3mm </td><td> VWR </td><td> 26396-630 </td><td></td></tr><tr><td> Microplate 1 מטוס קטנטן + </td><td> Thermo Scientific </td><td> 7571 </td><td> Select 96-גם צלחות המתאימים להארה - הם חייבים להיות אטומים. </td></tr><tr><td> TopSeal-A microplates :96-כן </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005185 </td><td> Microplate עיתונות-על סרט איטום דבק </td></tr><tr><td> D-luciferin, מלח אשלגן </td><td> זהב ביוטכנולוגיה, Inc </td><td> LUCNA </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> תוכנה </td></tr><tr><td> Insomniac2 </td><td> זמין לפי בקשה לכותבים </td><td> מנהג; נכתב על ידי לסלי תשמור, דוקטורט (ווסטמינסטר מכללה) </td><td> תוכנה מבוססת Matlab שנעשה שימוש שגרתי בניתוח של שינה 2,6,11 </td></tr><tr><td> Drosonex </td><td> זמין לפי בקשה לכותבים </td><td> מנהג; נכתב על ידי תומאס Coradetti (תוכנת מדרכה) </td><td> MSVC6 תכנית מחשב המשמשת לניתוח הישרדות מקבצי נתוני גלם שנאספה עםTrikinetics מערכת </td></tr><tr><td> Photoshop CS3 </td><td> לבנת טיט </td><td></td><td> שימושי לקבלת מספרים / צלחת CFU מתמונות דיגיטליות (אופציונלי) </td></tr></tbody></table>

quantitative measurement of the immune response and sleep in drosophila

יחסי גומלין מורכבים בין התגובה החיסונית והתנהגות מארח כבר תאר במגוון רחב של מינים. עודף שינה, בפרט, ידועה להתרחש כתגובה לזיהום ביונקים 1 ויש גם לאחרונה תוארה בדרוזופילה melanogaster 2. הדעה מקובלת היא, שהשינה מועילה למארח במהלך זיהום ושזה חשוב לשמירה על מערכת חיסונית חזקה 3,4. עם זאת, ראיות ניסיוניות שתומכות בהשערה זו הן מוגבלת 4, ותפקיד השינה עודפת במהלך תגובה חיסונית עדיין לא ברור. יש לנו להשתמש בגישה רבה תחומית לטיפול בבעיה מורכבת זו, ובצעו מחקרים במערכת הפשוטה הגנטית המודל, פריזבוב דרוזופילה melanogaster. אנו משתמשים בבדיקה סטנדרטית למדידת התנהגות ושינה של תנועה בזבובים, ולהדגים כיצד בדיקה זו משמשת למדידת התנהגות בזבובים infecteד עם זן הפתוגני של חיידקים. בדיקה זו היא גם שימושית עבור ניטור משך ההישרדות בזבובים בודדים במהלך זיהום. צעדים נוספים של תפקוד מערכת חיסון כוללים את היכולת של זבובים כדי לנקות דלקת וההפעלה של NFκB, גורם שעתוק מפתח שהוא מרכזי בתגובה החיסונית המולדת בדרוזופילה. שניהם תוצאת הישרדות ופינוי במהלך זיהום חיידקים ביחד הם אינדיקטורים של התנגדות וסובלנות לזיהום. התנגדות מתייחסת ליכולת של זבובים כדי לנקות זיהום, תוך סובלנות מוגדרת כיכולתו של המארח כדי להגביל את הניזק מזיהום ובכך לשרוד למרות רמות גבוהות של הפתוגן בתוך המערכת 5. ניטור בזמן אמת של פעילות NFκB במהלך הזיהום מספק תובנה מנגנון מולקולרי של הישרדות במהלך זיהום. השימוש בדרוזופילה במבחנים הפשוטים הללו מאפשר הניתוח הגנטי ומולקולרי של שינהואת התגובה החיסונית ואיך שתי מערכות מורכבות אלה מושפעים הדדיים.

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זיהום מקדם שינה. בדוגמה זו, קנטון-S (CS) זבובי בר וזבובי סוג מוטציה חסרת גן NFκB, ממרח (REL E20) 14, הוטענו לשני צגי DAM2 פעילות (n = 32 לכל גנוטיפ) ונדבק כמתוארים לעיל. זבובים הוחזקו באור קבוע כדי למנוע ההשפעה של השעון הביולוגי על התנהגות וזיהום 2,7,8. מוטציות E20 REL היו isogenized לCS כפי שתוארו לעיל 11. שתי הקבוצות של זבובים היו נגועות בס marcescens ותוצאותיו מתוארים באיור 3. במקרים מסוימים, קבוצת ביקורת טופלה שימושית נוספת להפרדת השפעות של טיפול מהשפעות של זיהום 2. קבוצות ביקורת שטופלו נחשפות לאותם שינויים סביבתיים כקבוצות הנגועות, הכולל הסרה מחממות והרדמה לאותו משך הזמן אבל הם לא יקבלו זריקה. עם זאת, בדוגמה זו, ברור שREL E20 מוטנטים חווים פחות שינה מאשר CS השליטה עפה לאחר הדבקה (איור 3 א). כפי שתואר לעיל 6, יש פרמטרי התנהגות אחרים שניתן למדוד מassay הסכרים. אלה עשויים לכלול סעיפי פעילות הכוללים לכל יחידה זמן (איור 3 ב &#39;). בדוגמה זו, השינוי בפעילות, לאחר מראות זיהום ששינה. כמו כן, אנו מדווחים על קצב פעילות, או פעילות ספירות לדקת עירות (האיור 3C). פרמטר זה הוא אינדיקטור אחד מהיכולת של תנועה בזבובים. במקרה זה, שיעורי פעילות מתעוררים לא משתנים באחת גנוטיפ במהלך זיהום, אשר טוען כי הירידה בפעילות או עלייה בשינה היא לא תוצאה של היכולת של תנועה מופחתת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האיור 4 א מתאר את שיעור ההישרדות לאחר הדבקה. עולה בקנה אחד עם ממצאים קודמים 14,15, Rel E20 מוטציות במהירות נכנע לfection בהשוואה לזבובים מסוג ברים. רוב הזבובים שרד הזרקת שליטת aseptic (איור 4 ב), המציין כי זבובים נכנע לזיהום ולא לפגיעה בגוף עקב ההזרקה. בגלל המוטציות להתענג מתו כל כך מהר, רק זבובי CS שמשו להפגין עומס חיידקים לאחר הדבקה (איור 5). איור 5 מראה שS. marcescens ממשיך להתרבות ב24 שעות לטוס לאחר הדבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פעילות הכתב לוציפראז מתוארת לאורך הזמן בבדיקה בארבעה זבובים בודדים (איור 6). וריאציה גדולה בין נקודתי נתונים וזבובים בודדים ניתן לייחס את הזבובים מסתובבים בפנים הבארות. למרות האות נגזרת מכל הרקמות בתוך הזבוב, הוא לא ציפה שכל רקמה הייתה פולטת אותה הכמות של אות, ואת הנראות של הרקמות לגלאי תשתנינה כמהלכי הזבוב. בדוגמה זו, זבובים נדבקו והשוואה<html> עם קבוצת ביקורת טופלה. זבובים שמתו הוצאו מניתוח על פני קבוצה של זבובים המוצגים באיור 7 א. זבובים מתים נקבעים על ידי בדיקה חזותית. בזבובים אלה, יש ירידה חדה באות לוציפראז, כמו גם ירידה בוריאצית אות, המציין כי הזבוב לא זז. פעילות כתב κB לוק בהתמדה עולה לאחר הדבקה (איור 7 א) ופציעת aseptic (איור 7 ב ). פסגות פעילות הכתב סביב 12 לאחר פציעה ושעות לאחר פגיעה. מניפולציות גנטיות והן / או בהתנהגות של זבובים צפויים לשנות פעילות כתב κB לוק במהלך זיהום. לדוגמה, תארנו בעבר 2 כי האינדוקציה של פעילות העיתונאית κB לוק הייתה בעיקר נחלשה במהלך הזיהום בREL E20 מוטנטים, המציין הכתב הזה κB לוק הוא ספציפי לNFκB. </li></ol>gether.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4355/4355fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4355/4355fig1.jpg" /> איור 1. תרשים זרימה המתאר את השלבים העיקריים של מדידת התגובות החיסוניות בדרוזופילה () הרצף של צעדים מתוארים לשנת מדידה, להישרדות, ולעומס חיידקים בזיהום;. (ב) הרצף של צעדים מתואר למדידת NFκB תלוי פעילות הכתב לוציפראז במהלך זיהום. ניסויים יכולים להמשיך בכל מקום בין 1-5 ימים, תלויים בקטלניות ממיני חיידקים בשימוש. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/4355/4355fig2.jpg" /> איור 2. סכמטי של microplate פרט היטב. זבובים ממוקמים באטום, 96 גם צלחות המכילות בינוני וכיסה כפי שמוצג. בגלל יטופלו בנפרד זבובים שיהיו נגועים, זה לא חשובo להגביל את מספר הזבובים לצלחת לסכום שניתן לניהול סביר בתוך פרק זמן נתון, בהתאם לנסיבות הניסיוניות. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4355/4355fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4355/4355fig3.jpg" /> איור 3. תגובת התנהגות של זבובים נגועות בס marcescens. () ממוצע ± SEM אחוזי זמן שטס שינה בילתה ו( B) Mean ± SEM ספירות פעילות כלל הם זממו במרווחים של 4 hr ליום 1 לפני ולאחר ההדבקה עם ס marcescens. (ג) Mean ± SEM ספירות פעילות לדקת עירות לפני (BL = בסיסי) ולאחר ההדבקה עם ס marcescens זמם במרווחים של 8 שעות. התנהגות היא דיווח לזבובי CS פראי מסוג ששרדו לזיהום של לפחות 24 שעתי הודעה, ועבור Rel E20 החיסוני לקוי זבובי thaלא שרד לזיהום שלאחר שעות לפחות 8. n = 13 עבור CS ועבור Rel E20. ** = P &lt;0.01 ו* = p &lt;0.05, t של הסטודנט - מבחן. <img alt="איור 4" fo:content-width="2.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4355/4355fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4355/4355fig4.jpg" /> איור 4. תוצאות הישרדות של זבובים נגועים ולא נדבקו. () עקומות מייצגות קפלן, מאייר הישרדות הם זממו לשניהם CS פראי מהסוג E20 וזבובי REL חיסון לקויים שהיו נגועים בס marcescens. p = 8.13x 10 -13, היכנס מבחן דרגה. n = 31 עבור CS וn = 32 לזבובי E20 rel. (ב) עקומות מייצגות קפלן, מאייר הישרדות מדווחות כב(), למעט זבובים קבלו פציעה האספטי באמצעות הזרקת תקשורת הנוזלית ללא חיידקים. כמעט כל הזבובים שרדו פציעה האספטי עד תום הניסויים (60 שעות לאחר פציעה). p&gt; 0.97, היומן rank מבחן, n = 32 עבור CS וREL E20 זבובים. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/4355/4355fig5.jpg" /> איור 5. כימות של עומס חיידקים בזבובים שנדבקו בס marcescens. () תרבות חיידקי נציגה CS זבובים נגועים בס marcescens שנקטפו מייד לאחר הדבקה (פנל שמאלי), או 24 שעות לאחר הדבקה (פנל מימין). גורמי דילול מצוינים מתחת לכל דמות. בדוגמה זו, 10 זבובים homogenized בפתרון μl 400 עבור כל קבוצה. 100 μl של הדילול הסופי להתפשט על כל צלחת. הצלחת השמאלית מכילה 29 יחידות להרכיב מושבה (CFU). כדי לחשב CFU / לעוף, תחלק 29 CFU ידי זבובים [10 * 0.001 (גורם דילול) * 100 μl (התפשטות נפח לצלחת)], אשר שווה 29, ותכפיל את הנפח הראשוני של 400 μl = 11600. לצלחת המסוימת הזה, יש לנו ממוצע של 1.16 x 10 4CFU / זבוב. הצלחת הימנית מכילה 257 מושבות. שימוש באותה הנוסחא, אנו מוצאים ממוצעים של 1.03 x 10 6 CFU / זבוב. (ב) לאחר חישוב CFU / לטוס מכל צלחת בכל תנאי ניסוי, ליצור חלקות וקופסות שפם כפי שמוצג. בדוגמה זו, אחוזון 25, 50 (חציון) ו75 מוצגים כתחתון, האמצעי והעליון של התיבה. ברי שגיאה מייצגים סטיית התקן על פני שלושה ניסויים עצמאיים. ** P &lt;0.01 תלמיד מבחן t של. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/4355/4355fig6.jpg" /> איור 6. פעילות NFκB תלויה לוציפראז כתב בזבובים בודדים שנדבקו בס Marcescens. דוגמאות מייצגות של נתונים גולמיים מוצגות לזבובים בודדים נגועים (שליטת מטופלות; לוחות שמאל) וזבובים נגועים (פנלים נכונים). קריאה בסיסית (זמן &#39;0 &#39;) נאספה מייד לפני זיהום או טיפול; כל שארנקודתי זמן נאספו לאחר זבובים טופלו. שים לב להבדלים בהיקף בצירי y בין זבובים בתנאי הביקורת הנגועה וטפלו. וריאציה גדולה של האות בתוך כל זבוב ניתן לייחס לתנועה של הזבוב בתוך microwell. <img alt="איור 7" fo:content-width="2.75in" fo:src="/files/ftp_upload/4355/4355fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4355/4355fig7.jpg" /> איור 7. זיהום בס marcescens או פגיעה עם הזרקה האספטי מגביר את הפעילות עיתונאית κB לוק בחי זבובים. Mean ± פעילות לוציפראז SEM (יחידות שרירותיות) זממה כל 4 שעות בכל הזבובים שנדבקו () או נפגעה על ידי הזרקת חומרים אספטיים (ב &#39;) ושרדה עד עד 24 בבדיקה. ANOVA חד כיווני עם צעדים חוזרים ונשנים מצביע על כך שהפעילות גדלה באופן משמעותי בכתב נגוע (p &lt;0.05), נפגעה (inj, p &lt;0.01), ונגדם טפלוטרולופ (HC; p &lt;0.01) בהשוואה לקבוצות הבסיסיות שלהם (זמן &#39;0 &#39;; Tukey של הפוסט הוק). (הוספה, פנל): נתונים מקבוצת HC משורטטים בקנה מידה שונה. העלייה הקטנה אך משמעותית בפעילות עיתונאית בג&quot;ץ הקבוצה עולה כי זבובים אולי חוו לחץ קל או גדלו ערות מהטיפול (העברה מצלחת microwell ושווה הערך להרדמת זבובים נגועים). שתי הקבוצות נגועות ופצועות הראו זירוזים חזקים של פעילות העיתונאית κB לוק שהיו גבוהים באופן משמעותי מזה בקבוצת הבג&quot;צ בנקודתי זמן מצוין * = p &lt;0 0.05; ** = p &lt;0 0.01;. לא של התלמיד - בדיקה; ל() n = 20 HC ו n = 13 זיהום; ל( B) n = 15 HC ו n = 14 פציעה.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila at JoVE.com

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

כדי להבין את קשר בין התגובה החיסונית ובהתנהגות, שאנו מתארים שיטה למדידת התנהגות רצוניים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; במהלך זיהום חיידקים, כמו גם את היכולת של זבובים לעלות תגובה חיסונית על ידי ניטור הישרדות, עומס בקטריאלי, ופעילות בזמן אמת של רגולטור מפתח של חסינות מולדת, NFκB.

מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה<em&gt; דרוזופילה</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

quantitative-measurement-immune-response-sleep

Google

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

15.3K Views.  University of Pennsylvania Perelman School of Medicine. כדי להבין את קשר בין התגובה החיסונית ובהתנהגות, שאנו מתארים שיטה למדידת התנהגות רצוניים ב דרוזופילה במהלך זיהום חיידקים, כמו גם את היכולת של זבובים לעלות תגובה חיסונית על ידי ניטור הישרדות, עומס בקטריאלי, ופעילות בזמן אמת של רגולטור מפתח של חסינות מולדת,...

Video: Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development of vaccines and therapeutics1,2,3. Here, we describe a method for the detailed phenotypic and functional analyses of cellular immune responses, specifically intracellular cytokine production by CD4+ and CD8+ T cells as well as the individual memory subsets. We obtained precise quantitative and qualitative measures for the production of interferon gamma (INF-) and interleukin (IL) -2 in both CD4+ and CD8+ T cells from the rhesus macaque PBMC stimulated with PMA plus ionomycin (PMA+I). The cytokine profiles were different in the different subsets of memory cells. Furthermore, this protocol provided us the sensitivity to demonstrate even minor fractions of antigen specific CD4+ and CD8+ T cell subsets within the PBMC samples from rhesus macaques immunized with an HIV envelope peptide cocktail vaccine developed in our laboratory. The multicolor flow cytometry technique is a powerful tool to precisely identify different populations of T cells 4,5 with cytokine-producing capability6 following non-specific or antigen-specific stimulation 5,7.

We demonstrate the utility of multicolor flow cytometry for detailed phenotypic and functional characterization of total as well as memory subsets of CD4+ and CD8+ T cells in rhesus macaques, the ideal model for HIV/AIDS vaccine studies.

Cytometry ססגוניות אנליזות זרימה של תגובה חיסונית תאית של קופי רזוס

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

מבוא של צרעות טפיליות<em&gt; תסיסנית</em&gt; ואת התגובה החיסונית Antiparasite

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

כימות תגובת Burst נשימה כאינדיקטור של החיסון מולדת בריאות בדג הזברה

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

הניצול של לוע התחתון Intratracheal PAMP מנהל ושטיפה ברונכואלוואולרית כדי להעריך את תגובת מארח חיסון של עכברים

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

בניתוח חוץ גופייה של תיווך Myd88 הסלולרי תגובה החיסונית לוירוס הנילוס המערבי זיהום הזנים Mutant

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

הדמיה לא פולשנית של התגובה החיסונית המולדת בדגם דג הזברה הזחל של<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; זיהום

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

ניתוחים כמותיים של הסינפסה המערכת החיסונית בגוף האדם באמצעות הדמיה Cytometry זרימה

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

שני הפוטונים הדמיה Intravital של לויקוציטים במהלך התגובה החיסונית בכבד עכבר שטופלו ליפופוליסכריד

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...