この作品は、米国国立がん研究所、CA131967からの助成金によってサポートされていました。

1。 BrdUの取り込み（末端標識） <ol><li> BrdUの添加する前に、150mmの組織培養ディッシュ24時間で約70％コンフルエンスに細胞をプレート。 </li><li>収穫前に適切な時点で20μg/ mlののBrdU（Sigma）を含有する新鮮な完全培地でメディアを交換してください。時間セルの長さは、BrdUによる培地で培養する細胞の種類や種によって異なりますが、一般的にG2期は2〜5時間（ 図1）が続きます。 </li></ol> 2。単層細胞培養物の染色体の収穫<ol><li>プレートから培地を取り出して、15 mlコニカル遠心管に10ミリリットルを収集します。残りのメディアを捨ててください。 </li><li> 10ミリリットル正矢[またはHBSS（シグマ）]で一回細胞を洗浄します。 </li><li>板に正矢（またはHBSS）で5ミリリットル、0.25％トリプシンを追加します。細胞がプレートから分離されるまで室温でインキュベートする。 </li><li>ステップ2.1からのメディアの10ミリリットルを含むチューブにトリプシン処理した細胞懸濁液を追加します&lt;/ LI&gt; <li>細胞を沈殿させ、10分間、400×gで遠心分離します。メディアプラス細胞ペレットを0.5mlのを残して、上清を吸引します。 </li><li>パスツールピペットでピペッティングでよく細胞を再懸濁する。 </li><li>低張液を3滴追加（を0.075のKCl（Sigma社）を37℃に温め ）、パスツールピペットを用いて細胞懸濁液を混ぜる。 0.5ミリリットル低張液を追加し、パスツールピペットを用いて再び混ぜる。 5ミリリットルに低張液​​の量を持参し、再度混ぜる。細胞の種類に応じて20から45分、37℃でインキュベートする。 </li><li> 10分間、400×gで遠心分離します。メディアプラス細胞ペレットを0.5mlのを残して、上清を吸引します。 </li><li>優しくチューブをフリックすることによって、細胞ペレットを再懸濁します。浸透腫れ細胞はこの時点では壊れやすいとなりますので、注意が細胞膜を破壊しないように注意するべきです。 </li><li>カルノア固定液3滴（1:3氷酢酸：メタノール）を追加します;優しくパスツールpipettとペッティング電子。優しくパスツールピペットでピペッティングして0.5 mlの固定液と混ぜる。 5mlに固定液の量を持参し、穏やかにパスツールピペットでピペッティングにより再び混ぜる。固定された細胞は、数ヶ月のために-20℃で暗所に保存することができます。 </li><li>遠心分離し、ステップ2.8のように吸引します。 </li><li>新鮮な固定液で細胞ペレットを再懸濁し、ペレットとadd〜10xのカルノア固定液の容積を推定する。 </li><li>ぬれた、氷のように冷たい顕微鏡スライド上に細胞懸濁液を滴下して追加します。〜45°の角度でスライドを保持し、細胞懸濁液は、スライドの表面上を流れるようになります。ペーパータオルの上で平らなスライドや洪水固定でスライドを下にして置き、空気乾燥することができます。倒立顕微鏡を用いて細胞分裂スプレッドの存在のためのスライドを確認してください。 </li></ol> 3。 RNase処理とエタノール脱水<ol><li> 37＆ドでインキュベートし、10μgの/スライドごとに2×SSCでmlのRNase A（シグマ）の代わりに200μlのグラム、Cで1時間。 </li><li>洗浄は、3分間ずつ室温で2×SSC、pH7.0で3回スライドします。 </li><li> 3分間ずつ室温でエタノール（シグマ）シリーズ（70％、90％、100％）を使用してスライドを脱水する。 </li><li>空気は、室温でスライドを乾燥させてください。 </li></ol> 4。 in situハイブリダイゼーションのBACプラス染色体に特異的なセントロメア列挙プローブ（CEP）、または全染色体塗料用のプローブのカクテルの調製<ol><li> BAC / CEP同時ハイブリダイゼーションのために、プレハイブリダイゼーションのために2つの別々のプローブのカクテルを用意してください。我々は、より少ないバックグラウンドと高いシグナル強度の異なるジェンの結果で個別BACおよびCEPのプローブをプレハイブリダイズすることを見出した。我々はまた、個々のフォスミドもBACクローンの代わりに使用することができることを見出した。後述のカクテル処方は、単一のスライド用のボリュームを表します。同じプローブを用いて、複数のスライドを処理する場合は、単にボリュームを上げるappropr<html> iately。 * BAC DNAプローブのカクテル： 11.5μlのハイブリダイゼーション緩衝液（50％ホルムアミド（シグマ）/ 2×SSC /デキストラン硫酸（Sigma社製））を2μlのdH 2 O のdH 2 Oに2.5μlのBAC/Cot1 DNA（プロトコルのラベリングについては下記を参照）15μlの合計体積 * CEPプローブカクテル： 7μlのCEPのハイブリダイゼーション緩衝液（65％Formamide/2x SSC /デキストラン硫酸）を2μlのdH 2 O 1μlのCEP/Cot1のDNA（スペクトラムOrange/Cy3/Texas赤で標識し購入）を10μlの合計体積 * 3：02比率を25μl/スライドとミックスプローブカクテルでCEPのプローブを用いてミックスのBACプローブを変性し、プレハイブリダイゼーション（ステップ5.1）の後。 OR </li><li>チューブに全染色体ペイントプローブのアリコートを20μl/スライド（Cy3/Texas赤）。変性およびプレハイブリダイゼーションのステップに進みます。 </li></ol>&quot;&gt; 5。スライドおよびプローブ変性と in situハイブリダイゼーション <ol><li> 75℃で変性プローブカクテル（S）℃で10分間。 COT1 DNAが反復配列にハイブリダイズするようにして染色体を分裂中期後続のハイブリダイゼーションを防止するために可能にするために30分間37℃で事前にハイブリダイズする。 </li><li> 72少なくとも70％Formamide/2x SSC、pH7.0中コプリンジャーに変性スライド℃で 3分間インキュベートする。 </li><li>すぐに3分間ずつ4でコプリンジャーにエタノールシリーズ（70％、90％、100％）℃を通してスライドを脱水する。 </li><li>スライドは、室温で空気乾燥させてください。 </li><li> 45〜プリ暖かいスライド°Cプローブプリhybridzation（ステップ5.1）の最後の10分間ウォーマースライド上。必要に応じて事前にハイブリダイズしたプローブのカクテルをミックスし、各スライドに25 ulを加える;優しくゴムセメントを持つすべてのエッジに沿って、各スライド及びシールにカバースリップを置く。蒸発を防ぐために加湿チャンバー中で37℃で一晩インキュベートする。 </li></ol><ol><li> 3分ごとに38から40°Cで50パーセントformamide/2x SSC、pHは7.0でコプリンジャー3回でスライドを洗浄します。洗浄の温度はプローブ間で異なる場合があります。高いバックグラウンドハイブリダイゼーションがある場合は、洗浄の温度を上げることができます。信号が微弱でないと背景がない場合は逆に、あなたはこれらの洗浄の温度を下げることができます。 </li><li>洗浄は、室温でのPN緩衝液中の1時間をスライド 3分間、およびBrdUの検出のステップに進みます。 </li></ol> 7。 BrdUの検出<ol><li>暗闇の中で、室温で10分間（200μL/スライド）のPNMバッファを持つブロックをスライドする。 </li><li>ペーパータオルの上にエッジをオンにすることでスライドを排出します。 37℃で30分間、PNMバッファに抗BrdU-FITC（50μg/ mlのロシュ社またはミリポア）100μLを°C。 </li><li> 3分間ずつ室温でPNバッファにスライドを3回洗浄します。 </li><li>ドレインペーパータオルの上にエッジをオンにすることにより、一度に1スライド上の過剰のPNバッファ。 20μlのDAPI /退色マウンティング溶液（Invitrogen）を追加します。 ペーパータオルでスライドをカバーし、気泡や過剰マウントソリューションを強制的にカバースリップを下に押します。画像解析に進みます。 </li></ol> 8。画像をキャプチャし、BrdUの取り込みを定量化<ol><li>画像はオリンパスBX61蛍光顕微鏡オリンパスCCDカメラ、100xの目的は、自動フィルターホイールとCytovisionソフトウェア（アプライドイメージング）で撮影されています。 BrdUはFITCフィルターを用いて捕獲され、染色体塗料（テキサスレッド、メタシステムまたはCytocell）、BACの（Cy3）とCEP（Vysisスペクトラムオレンジ）プローブは、テキサスレッドまたはCy3フィルタを使用してキャプチャされ、DAPIはDAPIフィルター（参照して撮影した図2、図3）。 </li><li>興味のある個々の染色体は、BAC / CEPまたは染色体特異ペイントプローブ（ 図2Bおよび3B）で識別されます。活用Cytovisionソフトウェアは、関心のある各染色体が全体として中期スプレッドから&quot;カットアウト&quot;ですが、ラインが長いアーム（ 図2Cと3C）への短腕から染色体の長さ方向に沿って通って引き込まれる。 Cytovisionソフトウェアは、各染色体の長さ方向に沿ってピクセル強度プロファイルを定量化するために使用されます。 Cytovisionソフトウェアは、画素が占める面積を計算し、各単離染色体上でのBrdUまたはDAPI信号によって表されるピクセルの強度を定量化します。各染色体によって表される平均ピクセル強度は、その後の総画素数を（ 表1、図4）を得るためにこれらの画素が占める面積で乗算されます。また、このプロトコルは、染色体の最新の複製領域の可視化を可能にします。したがって、BrdUの取り込みの縞状パターンが積極的に複製する染色体領域、およびchromos間の複製タイミングの違いを検出することができるOMEのペアがこのバンドパターン（ 図2及び図3）の違いと見られている。最後に、結合パターンの違いは、相同染色体または染色体腕4間のレプリケーションのタイミング差の推定を可能にし、各染色体6,7、のために知られている複製タイミングのマップと比較することができます。例えば、二つの第6染色体の図3Aのは第6染色体4の正常な複製タイミングと比較した場合、&gt; 2時間の横縞模様の違いを表示します。 また、ここで説明したものと同様の手順が正常に非アクティブとアクティブX染色体8,9間の非同期複製タイミングの研究のために使用されてきました。アクティブおよび非アクティブなX染色体はX染色体塗料を用いて同定した。画像は皮肉mFISHソフトウェア（Vysis）とX染色体によって占め画素数と蛍光ラによって占有さのピクセル数を用いて得たbeled BrdUはその後、NIHイメージ（使用して計算された<a href="http://rsb.info.nih.gov/nihimage" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.htmlを</a> ）。 </li></ol> 9。蛍光標識したBAC DNAのニック翻訳（Vysis） <ol><li>冷やし微量遠心管に、以下のプローブミックスを追加します。 のdH 2 Oで70μlの（4μgのDNA） 10μlの0.2 mMのdUTPをオレンジまたはグリーン 20μlの0.1 mMのdTTPを 20μlの10xのニック変換バッファ 40μlのNTのdNTPの（マイナスのdTTP） 40μlのニックトランスレーション酵素 200μlの総量 インキュベート@ 16℃のCO / N 70℃で加熱することにより反応を停止℃で10分間。氷上で5分間冷やします。 </li><li>プローブミックスに以下を加えることで、エタノールでDNAを沈殿させる。 200μlのプローブ溶液 48μlの3 M NaOAc 160μlのCot1DNA（0.25μgの/ UL） 1200μlの100％EtOHを</li><li> O / N〜10分間-80℃で保存</li><li> iをスピン20分間12,000 xgで冷n。 EtOHをオフデカント。 70％EtOHで1回洗浄します。前と同じようにスピン。 EtOHをオフデカント。空気だけでエタノールが蒸発するまで乾燥させます。 BAC DNAの100 ng /μlにの最終濃度を40μlのdH 2 Oに再懸濁する。 </li></ol>

<ol>
	<li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X+chromosome+dosage+compensation:+how+mammals+keep+the+balance.">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionizing+radiation+induces+frequent+translocations+with+delayed+replication+and+condensation.">Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation.</a> Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).</li><li>Smith, L., Plug, A., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+Replication+Timing+Leads+to+Delayed+Mitotic+Chromosome+Condensation+and+Chromosomal+Instability+of+Chromosome+Translocations.">Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).</li><li>Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosomal+locus+that+controls+chromosome-wide+replication+timing+and+mono-allelicexpression.">An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).</li><li>Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+translocations+with+delayed+replication:+evidence+for+cis+control+of+chromosome+replication+timing.">Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).</li><li>Camargo, M., Cervenka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+DNA+replication+of+human+chromosomes.+II.+Replication+map+and+replication+model.">Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model.</a> Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).</li><li>Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+chromosomal+bands+replicating+early+in+the+S+phase+of+normal+human+fibroblasts.">Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts.</a> Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).</li><li>Diaz-Perez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+element(s)+at+the+nontranscribed+Xist+locus+of+the+active+X+chromosome+controls+chromosomal+replication+timing+in+the+mouse.">The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse.</a> Genetics. 171, 663-672 (2005).</li><li>Diaz-Perez, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+deletion+at+the+mouse+Xist+gene+exposes+trans-effects+that+alter+the+heterochromatin+of+the+inactive+X+chromosome+and+the+replication+time+and+DNA+stability+of+both+X+chromosomes.">A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes.</a> Genetics. 174, 1115-1133 (2006).</li><li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo.">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li><li>Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allelic+inactivation+of+rDNA+loci.">Allelic inactivation of rDNA loci.</a> Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).</li><li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+checkpoint+response+to+replication+stress.">The checkpoint response to replication stress.</a> DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

染色体スプレッドの調製は、ここで説明する正常な複製タイミングのアッセイのための重要なステップです。低張処理に先立っコルセミド前処理工程を含めることは、周波数と有糸分裂細胞の広がりを助けることができる。我々は通常、収穫前に1から3時間colcemdiに細胞を公開し、10μg/ mlの最終濃度でコルセミド使用します。しかし、コルセミド前処理工程を含めることは、G2の長さを変更す?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>抗BrdU-FITC </td><td>ロシュミリポア</td><td> 11202593001 MAB326F </td><td> 50μg/μLの</td></tr><tr><td>ニックトランスレーションキット</td><td>アボット分子（Vysis） </td><td> 07J00-0001 </td><td></td></tr><tr><td>スペクトラムオレンジdUTPを</td><td>アボット分子（Vysis） </td><td> 02N33-050 </td><td></td></tr><tr><td> CEP </td><td>アボット分子（Vysis） </td><td>変化する</td><td></td></tr><tr><td> LSI / WCPハイブリダイゼーションバッファー</td><td>アボット分子（Vysis） </td><td> 06J67-011 </td><td></td></tr><tr><td> CEPのハイブリダイゼーションバッファー</td><td>アボット分子（Vysis） </td><td> 07J36-001 </td><td></td></tr><tr><td>染色体パイNTS </td><td>メタシステムグループ</td><td> D-14NN-050-TR </td><td></td></tr><tr><td>オリンパスBX61蛍光顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td> BX61TRF-1-5 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡イメージングソフトウェアシステム</td><td>アプライドイメージング</td><td> Cytovision 3.93.1 </td><td></td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>オリンポス</td><td> UCMAD3 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> in situハイブリダイゼーションのレシピで ホルムアミドソリューション 70パーセントFormamide/2x SSC 35ミリリットルホルムアミド*（シグマ） 10ミリリットル10倍のSSC 5ミリリットルD 2 H 2 O HClでpH7.0に（シグマ） *これは、-20℃で保管されていることホルムアミドを使用することが重要です。長時間の室温貯蔵ではギ酸とpHワットを生成します病気低すぎるかも。 50パーセントFormamide/2x SSC 25mlのホルムアミド（シグマ） 10ミリリットル10倍のSSC 15ミリリットルのdH 2 O HClでpH7.0に（シグマ） 20×SSC、4 L 702グラムのNaCl（シグマ） 358グラムのNaクエン酸（シグマ） ボリュームへのdH 2 O PNバッファ[0.1MのNaP0 4 0.1％NP_40（シグマ）] 0.1M溶液リン酸ナトリウムのそれぞれを（フィルター滅菌し、500mlアリコートで保存）してください。 、0.1MのNaH 2 PO 4、1L 13.8グラムのNaH 2 PO 4（シグマ）： ボリュームへのdH 2 O 、0.1MのNaH 2 PO 4、1L </strオング&gt; 14.2グラムのNaH 2 PO 4（シグマ） ボリュームへのdH 2 O。 PN：0.1 MのNaH 2 PO 4と0.1Mの2 HP0 NA 4 pHは8.0のpHを調整する。殺菌フィルタリングおよびNP-40の1 mlを加える。 PNMは50ミリリットル 1.25グラム無脂肪ドライミルク（シグマ） 25ミリリットルのPN緩衝液（上記レシピ） 絶えず撹拌しながら15〜20分間混ぜる。 10分間、400×gで2回スピン。上清を使用し、析出した乳蛋白質を乱さないように注意してください。 </td></tr></tbody></table>

chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization

哺乳類のDNA複製は、時間的なレプリケーション·プログラムに続いて、S期に異なる時点で染色体に沿って、複数のサイトで開始されます。複製タイミングの仕様は、エピジェネティックな修飾に敏感な組織特異的、発達的な手がかりによって規制ダイナミックなプロセスであると考えられている。しかし、どこで、DNA複製が染色体に沿って開始したときに調節メカニズムはよくわかっていないままです。相同染色体は通常、同期複製は、しかし、この規則には注目すべき例外があります。例えば、女性の哺乳動物細胞内で2本のX染色体の一つがX不活性1として知られるプロセスを通じて後期複製になります。 2〜3時間であると推定複製タイミングでこの遅延に伴い、遺伝子の大部分は、転写一つのX染色体上に沈黙なる。また、X不活性化の中心地として知られ、離散シス作用性遺伝子座は、目を含めて、このX不活化工程を調節全体の不活性X染色体上の遅延複製タイミングの電子誘導。また、癌細胞では、細胞内に存在する特定の染色体再配列は、電離放射線にさらされる染色体全体に影響を及ぼす2,3&gt; 3時間の複製タイミングで大幅な遅延が表示されます。我々の研究室から最近の研究では、離散と混乱シス作用性染色体全体の4に影響を与える非常に遅く複製表現型常染色体の遺伝子座の結果を示します。追加された&#39;染色体工学&quot;の研究では、すべての哺乳類の染色体は、個々の染色体の適切な複製タイミング5を制御離散シス作用性遺伝子座が含まれていることを示唆し、この異常な複製タイミングの表現型には多くの異なる染色結果に影響を与え、特定の染色体再配列を示す。 ここでは、蛍光in situハイブリダイゼーションと組み合わせた染色体複製タイミングの定量分析のための方法を提示する。このメソッドは、同じセル内の相同染色体間で複製タイミングの直接比較を可能にし、6から適応されました。さらに、このメソッドは、染色体全体に影響を与える複製タイミングの変化と相関染色体再編成の明確な識別を可能にします。この方法では、最近開発されたハイスループットマイクロアレイまたは相同対立遺伝子が再編成と非再配列染色体上に存在を区別することはできませんシーケンスプロトコルの上で利点があります。ここで説明する方法は、単一細胞を評価するためだけでなく、それは、集団中の細胞の一部のみに存在する染色体再配列で染色体複製タイミングの変化を検出することができます。

ヒトの6番染色体の複製タイミング解析の例を図2に示します。 6q16.1に位置ASAR6遺伝子4の欠失を含む細胞は、5時間のBrdUにさらされる有糸分裂細胞のために収穫し、6番染色体ペイントプローブ（Vysis）で魚やBrdUの取り込みのために処理した。 2 6の、第6染色体の一つのために&gt; 2時間の複製タイミングの遅延と一致している間にBrdUのバンドパターンに有意差があることに注...

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Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

染色体の複製タイミングの解析のための定量的な方法が記載されている。この方法は、蛍光との組み合わせでBrdUの取り込みを利用<em&gt;その場で</em&gt;哺乳類の染色体の複製タイミングを評価するためのハイブリダイゼーション（FISH）。この技術は、同じセル内に再配置および再配置非染色体の直接比較することができます。

蛍光灯と組み合わせることで染色体の複製タイミング<em&gt;その場</em&gt;ハイブリダイゼーション

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

chromosome-replicating-timing-combined-with-fluorescent-situ

Research

JoVE Journal

Biology

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

13.9K ビュー.  Oregon Health & Science University. 染色体の複製タイミングの解析のための定量的な方法が記載されている。この方法は、蛍光との組み合わせでBrdUの取り込みを利用その場で哺乳類の染色体の複製タイミングを評価するためのハイブリダイゼーション（FISH）。この技術は、同じセル内に再配置および再配置非染色体の直接比較することができます。

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Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ideal tool for studying  gene expression in brain, neural tube, somite and heart primordia formation. This video demonstrates the different steps in 2-color whole mount in situ hybridization; First, the embryo is dissected from the egg and fixed in paraformaldehyde. Second, the embryo is processed for prehybridization. The embryo is then hybridized with two different probes, one coupled to DIG, and one coupled to FITC.  Following overnight hybridization, the embryo is incubated with DIG coupled antibody. Color reaction for DIG substrate is performed, and the region of interest appears blue. The embryo is then incubated with FITC coupled antibody. The embryo is processed for color reaction with FITC, and the region of interest appears red. Finally, the embryo is fixed and processed for phtograph and sectioning. A troubleshooting guide is also presented.

This video demonstrates 2-color whole mount in situ hybridization, a method by which the spatial and temporal expression pattern of 2 different genes can be visualized in young chick embryos. This method was originally introduced by David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham and David Ish -Horowicz.

初期のニワトリ胚のin situハイブリダイゼーションダブルホールマウント

The chick embryo is a valuable tool in the study of early embryonic development. Its transparency, accessibility and ease of manipulation, make it an ...

生物学

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. The protocol is a modified version of the standard in situ hybridization using alkaline phosphatase and substrates such as NBT/BCIP and Fast Red 1,2. This protocol utilizes standard digoxygenin and fluorescein labeled probes along with tyramide signal amplification (TSA) 3. The commercially available TSA kits allow flexible experimental design as fluorescence emission from green to far-red can be used in combination with various nuclear stains, such as propidium iodide, or fluorescence immunohistochemistry for proteins. TSA produces a reactive fluorescent substrate that quickly covalently binds to moieties, typically tyrosine residues, in the immediate vicinity of the labeled antisense riboprobe. The resulting staining patterns are high resolution in that subcellular localization of the mRNA can be observed using laser scanning confocal microscopy 3,4. One can observe nascent transcripts at the chromosomal loci, distinguish nuclear and cytoplasmic staining and visualize other patterns such as cortical localization of mRNA. Studies in Drosophila indicate that roughly 70% of mRNAs exhibit specific patterns of subcellular localization that frequently correlate with the function of the encoded protein 5. When combined with computer-aided reconstruction of 3D confocal datasets, our protocol allows the detailed analysis of mRNA distribution with sub-cellular resolution in whole vertebrate embryos.

Zebrafish Whole Mount High-Resolution Double Fluorescent In Situ Hybridization

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology. Here, we present a high-resolution double fluorescent in situ hybridization protocol for analyzing the precise expression pattern of a single gene and for determining the overlap of the expression domains of two genes. We include a propidium iodide nuclear counter-stain to highlight tissue organization.

ゼブラフィッシュの全マウント高分解能二重蛍光上皮内ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is one of the most widely used techniques in developmental biology.  Here, we present a high-resolution double ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

蛍光その場で</emヒト精子の>ハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures are lengthy and technically demanding with multiple important steps that collectively contribute to the quality of the final result. This protocol describes in detail several key quality control steps for optimizing probe labeling and performance. Overall, our protocol provides a detailed description of the critical steps necessary to reproducibly obtain high quality results. First, we describe the generation of digoxygenin (DIG) labeled RNA probes via in vitro transcription of DNA templates generated by PCR. We describe three critical quality control assays to determine the amount, integrity and specific activity of the DIG-labeled probes. These steps are important for generating a probe of sufficient sensitivity to detect endogenous mRNAs in a whole mouse embryo. In addition, we describe methods for the fixation and storage of E8.5-E11.5 day old mouse embryos for in situ hybridization. Then, we describe detailed methods for limited proteinase K digestion of the rehydrated embryos followed by the details of the hybridization conditions, post-hybridization washes and RNase treatment to remove non-specific probe hybridization. An AP-conjugated antibody is used to visualize the labeled probe and reveal the expression pattern of the endogenous transcript. Representative results are shown from successful experiments and typical suboptimal experiments.

Whole Mount in Situ Hybridization of E8.5 to E11.5 Mouse Embryos

This whole mount in situ hybridization protocol discusses critical steps that ensure reproducible high quality results for gene expression studies in E8.5-E11.5 day old mouse embryos.

全体のマウント<em&gt;上皮内</emE11.5マウス胚へのE8.5&gt;ハイブリダイゼーション

Whole mount in situ hybridization is a very informative approach for defining gene expression patterns in embryos. The in situ hybridization procedures ...

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene expression. Microarray and next generation sequencing approaches are being used to investigate developmental, physiological and stress response processes, dissect epigenetic and small RNA pathways, and build large gene regulatory networks1-3. While these techniques facilitate the simultaneous analysis of large gene sets, they typically provide a very limited spatiotemporal resolution of gene expression changes. This limitation can be partially overcome by using either profiling method in conjunction with lasermicrodissection or fluorescence-activated cell sorting4-7. However, to fully understand the biological role of a gene, knowledge of its spatiotemporal pattern of expression at a cellular resolution is essential. Particularly, when studying development or the effects of environmental stimuli and mutants can the detailed analysis of a gene's expression pattern become essential. For instance, subtle quantitative differences in the expression levels of key regulatory genes can lead to dramatic phenotypes when associated with the loss or gain of expression in specific cell types. 
Several methods are routinely used for the detailed examination of gene expression patterns. One is through analysis of transgenic reporter lines. Such analysis can, however, become time-consuming when analyzing multiple genes or working in plants recalcitrant to transformation. Moreover, an independent validation to ensure that the transgene expression pattern mimics that of the endogenous gene is typically required. Immunohistochemical protein localization or mRNA in situ hybridization present relatively fast alternatives for the direct visualization of gene expression within cells and tissues. The latter has the distinct advantage that it can be readily used on any gene of interest. In situ hybridization allows detection of target mRNAs in cells by hybridization with a labeled anti-sense RNA probe obtained by in vitro transcription of the gene of interest. 
Here we outline a protocol for the in situ localization of gene expression in plants that is highly sensitivity and specific. It is optimized for use with paraformaldehyde fixed, paraffin-embedded sections, which give excellent preservation of histology, and DIG-labeled probes that are visualized by immuno-detection and alkaline-phosphatase colorimetric reaction. This protocol has been successfully applied to a number of tissues from a wide range of plant species, and can be used to analyze expression of mRNAs as well as small RNAs8-14.

In Situ Hybridization for the Precise Localization of Transcripts in Plants

The in situ hybridization protocol described here allows a direct localization of mRNA and small RNA expression at the cellular level with high sensitivity and specificity. The procedure is optimized for paraffin-embedded plant tissue sections, is applicable to a wide range of plants and tissues, and can be completed within ten days.

植物の転写産物の正確な位置のためのin situハイブリダイゼーション

With the advances in genomics research of the past decade, plant biology has seen numerous studies presenting large-scale quantitative analyses of gene ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

蛍光によるウイルスRNAの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

自動化を使用して染色体のハイスループット物理マッピング<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析<em&gt; in situで</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Assessing the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization properties of its transcribed RNA, are key features for understanding its biological function during development. RNA in situ hybridization (RNA-ISH) is a powerful method used for visualizing RNA distribution properties, be it at the organismal, cellular or subcellular levels 1. RNA-ISH is based on the hybridization of a labeled nucleic acid probe (e.g. antisense RNA, oligonucleotides) complementary to the sequence of an mRNA or a non-coding RNA target of interest 2. As the procedure requires primary sequence information alone to generate sequence-specific probes, it can be universally applied to a broad range of organisms and tissue specimens 3. Indeed, a number of large-scale ISH studies have been implemented to document gene expression and RNA localization dynamics in various model organisms, which has led to the establishment of important community resources 4-11. While a variety of probe labeling and detection strategies have been developed over the years, the combined usage of fluorescently-labeled detection reagents and enzymatic signal amplification steps offer significant enhancements in the sensitivity and resolution of the procedure 12. Here, we describe an optimized fluorescent in situ hybridization method (FISH) employing tyramide signal amplification (TSA) to visualize RNA expression and localization dynamics in staged Drosophila embryos. The procedure is carried out in 96-well PCR plate format, which greatly facilitates the simultaneous processing of large numbers of samples.

Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos

Here we describe a whole-mount fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol for determining the expression and localization properties of RNAs expressed during embryogenesis in the fruit fly, Drosophila melanogaster.

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

Assessing  the expression pattern of a gene, as well as the subcellular localization  properties of its transcribed RNA, are key features for ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...