Name: simple method for fluorescence dna in situ hybridization to squashed chromosomes
Uploaded: 2015-01-06T10:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
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We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.

1.組織解剖および固定（60分） <ol><li>ショウジョウバエの脳の場合は、1×PBS（リン酸緩衝生理食塩水）のドロップ第3齢幼虫を置く。積極的に過密でないバイアルまたはボトルからクロールされている大規模な第3齢幼虫を選択してください。 <ol><li>本体の長さ（ 図1A、B）の下2/3をつかむために、口のフックと、別のピンセットのペアのホールドをつかむために1超微細ピンセットのペアを使用してください。脳、腹側神経節、唾液腺と幼虫の消化管の一部が露出するように口のフックに慎重に引き抜いてください。プラスチックペトリプレート上1X PBT（Tweenでリン酸緩衝生理食塩水）の液滴中の他の組織および場所から脳と腹側神経節（ 図1A、B）を分離するためにピンセットを使用してください。 </li></ol></li><li> キョウ精巣解剖のために、男性の3日齢の蛹（赤い目と黄色の体）を選択します。雄キョウが ​​fに対する小翼パッドの長さを有する蛹（ 図1C）中にemales。 <ol><li> 1ピンセットペアと胸部領域の近くに腹部の上部に蛹を持ち、他のピンセットのペアを使用して、腹部の非常に遠位先端をつかむと、涙形の精巣を引き出し（彼らは脂肪に囲まれて静かに振とうすることができます体; 図1D）。プラスチックペトリプレート上1X PBTの液滴に適切な押しつぶし、と場所を防ぐことができます精巣、からの外装ボディパーツを取り外してください。 </li></ol></li><li>各スライドについて、4つ、又は5つの組織サンプル（ すなわち 、 ショウジョウバエ幼虫の脳またはキョウ精巣 ）の合計を分析。 注：複数の5つのサンプルは、超満員の核および染色体につながる。 </li><li>必要に応じて、低張液で組織を治療、有糸分裂染色体の真正染色質領域での姉妹染色分体のいくつかの分離を達成するために：5-10 0.5％クエン酸ナトリウムの低下に1X PBTからの脳を転送する（せいぜい10）分ない NOTE：コルヒチン（有糸分裂阻害剤）中期11で有糸分裂像の数を増加させるために有用であることができる。それが否定的な染色体の解像度に影響を与えることができるので、非常に大きな健康な幼虫が広がり、形態、使用、さらに望ましくている場合は、その使用は不要である。 </li><li>クリーンシグマコート処理したカバースリップの表面上に固定液の液滴（〜20μL）（45％酢酸中2.5％パラホルムアルデヒド）を配置します。 注：各使用日の固定剤溶液は新鮮なことを確認します。 45パーセント酢酸中1.8-3.7％のパラホルムアルデヒドに至るまで固定液ソリューションは、魚のために最良の結果をもたらす。脳や精巣以外の組織を使用して、または免疫FISHのためにこのプロトコルを適応すると、別の固定剤を使って実験が必要な場合があり（異なる固定剤のリストについては、12を参照のこと）。 </li><li>注意深く極細ピンセット、小指と固定液滴に解剖バッファー（1×PBT）から各組織サンプルを転送する固定液にバッファを解剖の転送をシュッ。彼らは一様に固定液滴内の互いに離間されるように、組織サンプルを置きます。室温で4分間固定液中で組織をインキュベートする。 </li><li>組織とカバースリップ上にダウンポリリジンコートスライド顔を慎重に配置します。この時点で下に押し、その代わりにカバースリップ、スライドの下にスティックように、2つを軽く接触させないでください。カバースリップが上になるようにスライドを反転。 </li><li>ろ紙の折返し片内側スライド/組織/カバースリップを挟む。安定した表面には、非常にしっかりとまっすぐ下に直接カバースリップ上の位置に親指、プレスを使用。 （これは組織の汚れが発生します）カバースリップの滑り横を避けるように注意してください。 </li><li>液体窒素中にスライド/組織/カバースリップ水没（ 図1E、Fで装置を参照）、および窒素が沸騰（長いをf停止するまで放置するINE）。スライドを削除し、すぐに（カミソリの刃で固定組織を傷つけない）上方向にカバースリップの角をフリックで新鮮なカミソリの刃でカバースリップをオフにスナップ。 <ol><li>ドライアイスのブロックのスライド/組織/カバースリップを予冷、カバーが前に割れからスライドを防ぐことができます液体窒素中に沈めることに1〜2分間、最大スリップ。 </li></ol></li><li>すぐに室温で100％エタノールを充填したコプリンジャーに組織にスライドを配置し、（必要に応じて、この時間を長くすることができる）は、少なくとも5分間放置する。 NOTE：冷100％エタノールを使用することもできる。 </li><li> 、組織とスライドを取り外します（固定組織に触れることなく）キムワイプと過剰のエタノールを逃がすし、1時間空気乾燥スライドを残す。 <ol><li>ステップ2またはハイブリダイゼーションを実行する前に、数ヶ月に低湿度空気中または数週間のための乾燥室で乾燥スライドを維持するために直接進む。 </li></ol></li></ol> 図1：脳を解剖するための幼虫ダウン方法の口のフックをつかむためにどこにするために示された位置との（A） 第3齢ショウジョウバエ幼虫（右）、（*で示される）と2/3。 第3齢ショウジョウバエ幼虫（右）と、このの概略から解剖（左）同じ発達段階A幼虫の概略、幼虫の頭の中の脳の相対的な位置を示した。（B）は 、脳と腹側神経節蛹をつかむために示す位置に3日齢のキョウオス蛹（右）から解剖組織（左）。黄色のボディ·赤目の段階で（C）3日齢キ ​​ョウ蛹 。（D）精巣組腹部の後部に（*で示される）と体の途中。 （左）は概略を描いた男性と女性だったp個の蛹。雄の蛹は、プロファイルを越えて延びる翼を有する雌とは対照的に、矢状プロファイル（黒矢印）を越えて延びない翼によって区別す​​ることができる。精巣ペアの相対位置は、雄蛹に示されている。液体窒素の容器中にスライドを浸漬するために使用されるペーパークリップ、及び（F）方法の（E）の装置列。複数のクリップ列が複数のスライドの同時浸漬のために使用することができる。 in situハイブリダイゼーション 2（1日目の30分、長いプローブ·オン2日のために1時間〜2.5時間） <ol><li> 1.1倍のハイブリダイゼーション緩衝液20μlに各プローブの1μL（100 NG）を追加します。固定組織の表面上にピペットプローブ/ハイブリダイゼーション緩衝液（組織には手を触れないでください）​​。 </li><li>慎重にカバースリップが組織の真上に中央に配置されていることを確認して、プローブ/ハイブリダイゼーション緩衝液に直接カバースリップを配置。バッファが目に移行する必要があります気泡を残さず、カバースリップの電子外縁。 注：組織と接触しない小さな気泡がプロシージャに何の問題も引き起こさない。慎重にカバースリップの角を持ち上げ、慎重にスライドの上にバックドロップすることで、大きな気泡を除去します。 </li><li> 95°C（カバースリップ上）に予備加熱ブロックの表面上にスライド/組織/カバースリップを置きます。露光を防止するためにアルミホイルの大きなピースでカバー。スライドを5分間95℃でインキュベートしましょう​​。 注：チューブ用の穴を持つ典型的なヒートブロックがスライド/組織/カバースリップを配置する平坦な表面を提供するために裏返しすることができます。 </li><li>それは触ると暖かくなるまで、それは少し冷却させる、スライドを削除します。慎重に、その下に液体を密封するために、カバースリップに張架パラフィルムの一部を包む。 </li><li>湿度チャンバ内の密封されたスライドを配置し、30℃に予熱インキュベーターにチャンバーを配置。 4時間一晩に30℃でインキュベートする。<ol><li>下部に配置湿らせたキムワイプまたはペーパータオルで空の先端ボックスから湿度室または蓋付きタッパーウェアコンテナを作成します。 注：一本鎖DNAオリゴプローブは45-47℃の理論上の融解温度（T m）を達成するために、28〜33塩基であるように設計されている。これらの長さおよびT mの範囲は、我々が研究してきた多くの反復配列がATリッチであるため、非常に低いGC含量を有するという事実を反映する。より長いプローブは、おそらく、より高いT m値を有することになる。これは、30℃の標準的なハイブリダイゼーション温度で、より高いバックグラウンドハイブリダイゼーションを生じ得る。したがって、ハイブリダイゼーション温度を有するいくつかのトラブルが最良の結果を達成するために必要とされてもよい。段階的に、5℃で最高のハイブリダイゼーション温度、増加（または減少）温度を検索するには。 </li></ol></li><li>慎重にスライドからパラフィルムを除去した後、丁寧にゆっくりと1コーナーを持ち上げてカバースリップを取り外します。ワ0.1×SSC緩衝液中でのshスライドを15分間3回洗浄。光の露出を最小限にするための洗浄中にアルミホイルでコプリンジャーをカバーしています。 </li><li>長いビオチン化プローブを使用していない場合は、2.8に進みます。 <ol><li>長いビオチン化プローブを使用している場合は、組織自体に触れないように注意しながら、キムワイプで組織周辺を乾燥させます。組織上のブロッキング溶液を100μlを置き、トラップ気泡を避けるように注意しながら、カバーガラスで優しくカバーしています。パラフィルムでカバースリップ上にスライドをラップし、30分間37℃で配置します。 </li><li>慎重にカバースリップを削除し、キムワイプで組織を中心にブロット。ピペットローダミン - アビジン希釈した1100μlの：組織上のSBTで千とトラップの泡を避けるように注意しながら、カバーガラスで優しくカバーすること。パラフィルムでカバースリップ上にスライドをラップし、30分間37℃で配置します。 </li><li>慎重その後カバースリップを削除して、4倍SSCTで5分間ずつスライドを3回洗浄し、0.1×SSC中で5分間3回ずつ。 注：スライドをより長い期間にわたって洗浄することができる。 </li></ol></li><li> （組織に触れないように）スライドを削除し、余分な緩衝液を除去するために乾燥したキムワイプを用いて組織を中心にブロット。 10〜15分間、または水分が完全に消散するまで、暗所でスライド組織側を上に置きます。 </li><li>のVectashieldマウンティング培地をピペットで11μlの（4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドールDAPI）組織へ。慎重に直接封入剤と組織の中心部のきれいなカバースリップ（シグマコートで処理されていない）を配置します。封入剤は、カバースリップの端に向かって外側へゆっくりと移行する必要があります。 注：封入剤は、すべての側面にカバースリップの縁に到達するのに失敗した場合は、封入剤の追加の1-2μlの必要な体積を埋めるためにカバースリップの縁の一つの位置に適用することができる。この場合は、前のスライド表面から余分なメディアを離れて拭いてくださいシーリング。 </li><li>マニキュアでカバースリップの端をシール。組織サンプルの上にマニキュアを塗ることは避けてください。 </li><li>暗い場所で直立スライドを置き、完全にハード（通常は30分以上）まで、ネイルポリッシュ乾燥させる。この時点で、画像後でイメージングのため最大1週間-20℃で組織またはストア。 </li></ol>バッファ/ソリューションのレシピ 10倍のPBS <ul><li> 80グラムのNaCl </li><li> 2.0グラムのKCl </li><li> 14.4グラムのNa 2 HPO 4 </li><li> 2.4グラムのKH 2 PO 4 </li><li> 7.4にpHを、H 2 Oに1 L </li></ul> 1X PBT <ul><li> 5ミリリットル10倍のPBS </li><li> 45ミリリットルのH 2 O </li><li> 0.1％のTween 20 </li></ul> 20X SSC <ul><li> 175.3グラムのNaCl </li><li> 88.2グラムクエン酸ナトリウム</li><li> 800ミリリットルのH 2 O中</li><li> 7のpHを、H 2 Oの1 L </li></ul> 4X SSCT <ul><li> 200ミリリットル20X SSC </li><li> 799ミリリットルのH 2 </サブ&gt; O </li><li> 0.1％のTween 20 </li></ul> 0.1×SSC <ul><li> 5ミリリットル20X SSC </li><li> 995ミリリットルのH 2 O </li></ul>ハイブリダイゼーション混合物（20μL; 11から変更） <ul><li> 10μlのホルムアミド</li><li> 4μlの50％のデキストラン硫酸</li><li> 2μlの20X SSC </li><li> 4μlのH 2 O </li></ul> SBT 8（10ml）中<ul><li> 2ミリリットル20X SSC </li><li> 0.01グラムのウシ血清アルブミン（BSA） </li><li> 10μlのトゥイーン20 </li><li> 7.9ミリリットルのH 2 O </li></ul>ブロッキング溶液8（10ml）中<ul><li> 0.3グラムのBSA </li><li> 10μlのトゥイーン20 </li><li> 2ミリリットル20X SSC </li><li> 8ミリリットルのH 2 O </li></ul>パラホルムアルデヒド固定液（1ml）を<ul><li> 393.75μlのH 2 O（最初の水を追加） </li><li> 450μlの氷酢酸</li><li> 156.25μlの16％のパラホルムアルデヒド</li></ul>

<ol>
	<li>Blattes, R., Kas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+(FISH)+on+diploid+nuclei+and+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+melanogaster+larval+tissues.">Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li><li>Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+with+transposable+element+probes+to+mitotic+chromosomal+heterochromatin+of+Drosophila.">Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).</li><li>Pardue, M. 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The authors declare that they have no competing financial or any other conflict of interest.

DNA ISHは、しばしば、染色体に特異的な配列をマッピングするために使用される。我々は、高コピー数、ヘテロクロマチンの配列のために最適化DNA ISHのための簡単​​な方法を記載している。むしろ、他の既存のDNA ISHプロトコールにおいて必要条件で、ホルムアミド溶液中での洗浄を使用するのではなく、我々は、DNAを変性させるために予め加熱されたブロックに直接組織に取り付けられた...

in situハイブリダイゼーション （DNA ISH） における DNAは、特定の染色体領域にシーケンスをマッピングするために一般的に使用される方法である。長いDNA生成物1,2及びdeoxygeninの取り込みのニックトランスレーションまたは末端標識（DIG）を含む、ユークロマチン内の単一コピー領域へのプローブのアプローチの一握りを介して生成することができますが、多種多様を通じてヌクレオチドおよびそれらの認識を-attachedグループ標識抗体1-3。少数または単一のコピー数の真正染色質系列の可視化は、高い特異的活性または集合シグナルを増強複数の、より小さなプローブのカクテルを持つ単一の、大規模なプローブのいずれかを使用する必要があります。 彼らは通常、数万のブロックとして知られている単一の染色体領域に密集反復の千として存在しているのでこれとは対照的に、そのようなサテライトDNAとしてヘテロクロマチンに見られる高度反復配列は、DNA ISHのために簡単にターゲットである。転移因子はまた、であることができる明確な染色体遺伝子座2で高コピー数で発見。これらのケースでは、低い比活性を持つ単一のプローブは、効果的に複数のサイトで彼らのハイブリダイゼーションのためにヘテロクロマチン系列ラベルを付けることができます。反復配列に対するプローブは、市販の短いオリゴヌクレオチド（30-50 bp）を合成し、化学的に異なる複数の蛍光性基のいずれかと結合体化され得る。ゲノム配列決定技術を用いて、ヘテロクロマチン内の反復配列をマッピングすることにより、高度に反復的な衛星のブロック4-6,7内の建物の足場で遭遇する課題には困難である。現在、ISHは、サブ染色体レベルでのこれらの配列をマッピングする最も効果的な方法として表す。この戦略は、進行中のゲノム及びトランスクリプトーム配列決定研究によって明らかにされている反復配列の多数をマッピングするために重要である。 スライドマウント染色体上の反復配列のマッピングの効率および容易さがGREであろうatly DNA ISHのために単純化されたプロトコルによって強化。例えば、DNA ISHのための既存のプロトコルは、このようにマッピングシーケンスの所要時間と実質的に添加しても高価な試薬のための化学廃棄物を大量に産生する、ホルムアミド溶液中でハイブリダイズ2,8組織の複数回の洗浄を含む。ここでは、ホルムアミドの洗浄の必要性を回避し、基本的な実験装置および試薬を利用して修正されたDNA ISH方法について説明します。この方法は、本来の蛍光色素とコンジュゲートしている、商業的に合成されたオリゴを用いて、 ショウジョウバエ幼虫の神経芽細胞の異質領域において高度に反復DNA配列の迅速なマッピングのために設計された。しかし、この方法はまた、他の手段9,10を介して、複数の異なる組織及び染色体タイプにわたって合成された大きいプローブを使用して反復配列をマッピングするために働く。さらに、この方法は、より長いまたはmultip使用してユークロマチンシーケンスをマッピングするために使用することができるル、関心の真正染色質配列内に短いプローブ。

<table><tbody><tr><td>Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrafine tweezers (5 gauge)</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm cover slips</td><td>Fisher</td><td></td><td>Sigmacote-treated by immersion for 15 sec, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td></td><td></td><td>75 - 150 mm</td></tr><tr><td>Paraffin wax paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat block with thermometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidity chamber</td><td></td><td></td><td>empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes</td></tr><tr><td>Coplin jars</td><td></td><td></td><td>with slide grooves</td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microfuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td></td><td></td><td>clear or colored</td></tr><tr><td>P20 micropipette and plastic tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paperclips</td><td></td><td></td><td>20 - 25 standard metal paperclips linked to form a chain</td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>16% EM grade paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Reagents</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol, chemical grade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos</td></tr><tr><td>Long biotinylated probe</td><td>Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.,&lt;/em&gt; nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen</td></tr><tr><td>Rhodamine-Avidin</td><td>Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>for detection of long biotinylated probe</td></tr><tr><td>Hybridization buffer</td><td>Recipe above</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x SSCT</td><td>Recipe above</td><td></td><td>saline-sodium citrate + Tween</td></tr><tr><td>0.1x SSC</td><td>Recipe above</td><td></td><td>saline-sodium citrate</td></tr><tr><td>Blocking solution</td><td>Recipe above</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBT</td><td>Recipe above</td><td></td><td>SSC, bovine serum albumin, Tween</td></tr><tr><td>1x PBT</td><td>Recipe above</td><td></td><td>phosphate-buffered saline + Tween</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td>phosphate-buffered saline</td></tr><tr><td>Hypotonic solution</td><td></td><td></td><td>0.5% sodium citrate in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium with DAPI</td><td>Vector laboratories</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

simple method for fluorescence dna in situ hybridization to squashed chromosomes

in situハイブリダイゼーション （DNA ISH） における DNAは、特定の染色体領域にシーケンスをマッピングするために一般的に使用される方法である。このアプローチは、計算上のアプローチが法外な課題に直面してヘテロクロマチン領域にマッピング高度反復配列に特に有効である。ここでは、他のDNA ISHプロトコルにおける標準手順ですホルムアミドの洗浄を回避するDNA ISHのための合理化されたプロトコルを記述します。我々のプロトコルは、効果的に異なる昆虫の組織タイプの数にわたって異質染色体領域内の反復DNA配列をマークする蛍光色素を担持する短い一本鎖DNAプローブとのハイブリダイゼーションのために最適化されている。しかし、アプリケーションは、単一コピーの大きいプローブおよび可視化（非反復）のDNA配列で使用するように拡張することができる。私たちは、 キイロショウジョウバエの神経細胞とキョウから押しつぶされた染色体に複数の異なる反復配列をマッピングすることにより、この方法を実証するvitripennis精母。我々は両方の小、商業的に合成されたプローブの比較のために、より大きなプローブのハイブリダイゼーションパターンを示している。この手順は、単純な実験室用品および試薬を使用し、DNA ISHを実施するとの経験がほとんどない研究者に最適です。

いくつかの異なる組織からの染色体に、;この方法を実証するために、我々は、化学的に蛍光複合体（ 図2）と（ 図2B PCR産物のニックトランスレーションを通じて行わ）長いビオチン化プローブで修飾した小型の商業的に合成されたオリゴのセットをハイブリダイズタイプ（ 表1参照）。標的配列は、D.から有糸分裂染色体の動原体周囲（ヘテロク?...

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Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

蛍光DNAための簡単​​な方法<em&gt;その場で</em&gt;ぺしゃんこ染色体へのハイブリダイゼーション

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

18.0K ビュー.  University of Rochester. Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

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Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

遺伝学

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene expression, cell identity and differentiation. Many approaches developed to study the 3D architecture of the genome can be divided into two complementary categories: chromosome conformation capture based technologies (C-technologies) and imaging. While the former is based on capturing the chromosome conformation and proximal DNA interactions in a population of fixed cells, the latter, based on DNA fluorescence in situ hybridization (FISH) on 3D-preserved nuclei, allows contemporary visualization of multiple loci at a single cell level (multicolor), examining their interactions and distribution within the nucleus (3D multicolor DNA FISH). The technique of 3D multicolor DNA FISH has a limitation of visualizing only a few predetermined loci, not permitting a comprehensive analysis of the nuclear architecture. However, given the robustness of its results, 3D multicolor DNA FISH in combination with 3D-microscopy and image reconstruction is a possible method to validate C-technology based results and to unambiguously study the position and organization of specific loci at a single cell level. Here, we propose a step by step method of 3D multicolor DNA FISH suitable for a wide range of human primary cells and discuss all the practical actions, crucial steps, notions of 3D imaging and data analysis needed to obtained a successful and informative 3D multicolor DNA FISH within different biological contexts.

3D multicolor DNA FISH represents a tool to visualize multiple genomic loci within 3D preserved nuclei, unambiguously defining their reciprocal interactions and localization within the nuclear space at a single cell level. Here, a step by step protocol is described for a wide spectrum of human primary cells.

ヒト初等細胞の核アーキテクチャを研究する3D多色DNA FISHツール

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

蛍光その場で</emヒト精子の>ハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

生物学

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

抗体標識用ショウジョウバエ多糸染色体のカボチャの準備

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

自動化を使用して染色体のハイスループット物理マッピング<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

蛍光灯と組み合わせることで染色体の複製タイミング<em&gt;その場</em&gt;ハイブリダイゼーション

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

3D原子力組織の変化を研究するために3D保存状態間期核に組み合わさ免疫やDNA FISH

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

直接標識プローブを用いた堅牢な3DのDNA FISH

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These structures are collectively known as the nucleoskeleton and include the nuclear lamina, the nucleoli, and nuclear bodies. Although many variants of fluorescence in situ hybridization (FISH) exist to study the genome and its organization, these are often limited by resolution and provide insufficient information on the genome&#39;s association with nuclear structures. The DNA halo method uses high salt concentrations and nonionic detergents to generate DNA loops that remain anchored to structures within nuclei through attachment regions within the genome. Here, soluble nuclear proteins, such as histones, lipids, and DNA not tightly bound to the nuclear matrix, are extracted. This leads to the formation of a halo of unattached DNA surrounding a residual nucleus which itself contains DNA closely associated with internal nuclear structures and extraction-resistant proteins. These extended DNA strands enable increased resolution and can facilitate physical mapping. In combination with FISH, this method has the added advantage of studying genomic interactions with all the structures that the genome is anchored by. This technique, termed HALO-FISH, is highly versatile whereby DNA halos can be coupled with nucleic acid probes to reveal gene loci, whole chromosomes, alpha satellite, telomeres and even RNA. This technique provides an insight into nuclear organization and function in normal&#160;cells and in disease progression such as with cancer.

Combining DNA halo preparations with fluorescence in situ hybridization enables high-resolution analysis of genomic interactions with the nucleoskeleton. Attached genome leads to hybridized fluorescent signals located within the residual extracted nuclei, whereas non-attached genome is in the halo of DNA surrounding the residual nuclei.

全染色体、テロメア、遺伝子座を明らかにするためのDNAハロー調製物での蛍光In situハイブリダイゼーション

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

HCR-DNA FISH: A Fluorescence In Situ Hybridization Technique to Detect Viral DNA in Infected Cells

Source: Wei Liu&#160;et al., <a href="https://www.jove.com/v/58950"> Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection</a>, J. Vis. Exp. (2019).
In this video, the cells infected with MCPyV virions were subjected to in situ hybridization chain reaction to detect MCPyV specific genomes. Further, the DNA-HCR technique was combined with FISH to visualize the MCPyV DNA in infected human skin cells.

HCR-DNA FISH:感染細胞中のウイルスDNAを検出するための蛍光In Situハイブリダイゼーション技術

Source: Wei Liu&#160;et al.,  Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection, J. Vis. Exp. (2019).
In this video, the cells infected with MCPyV virions ...

蛍光DNAための簡単な方法

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単一分子蛍光In-situハイブリダイゼーション (smFISH) における出芽酵母の栄養増殖と減数分裂

ヒト初等細胞の核アーキテクチャを研究する3D多色DNA FISHツール

蛍光その場でハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル

抗体標識用ショウジョウバエ多糸染色体のカボチャの準備

自動化を使用して染色体のハイスループット物理マッピング

蛍光灯と組み合わせることで染色体の複製タイミング

3D原子力組織の変化を研究するために3D保存状態間期核に組み合わさ免疫やDNA FISH

直接標識プローブを用いた堅牢な3DのDNA FISH

全染色体、テロメア、遺伝子座を明らかにするためのDNAハロー調製物での蛍光In situハイブリダイゼーション

HCR-DNA FISH:感染細胞中のウイルスDNAを検出するための蛍光In Situハイブリダイゼーション技術

蛍光DNAための簡単​​な方法

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ヒト初等細胞の核アーキテクチャを研究する3D多色DNA FISHツール

蛍光その場でハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル

抗体標識用ショウジョウバエ多糸染色体のカボチャの準備

自動化を使用して染色体のハイスループット物理マッピング

蛍光灯と組み合わせることで染色体の複製タイミング

3D原子力組織の変化を研究するために3D保存状態間期核に組み合わさ免疫やDNA FISH

直接標識プローブを用いた堅牢な3DのDNA FISH

全染色体、テロメア、遺伝子座を明らかにするためのDNAハロー調製物での蛍光In situハイブリダイゼーション

HCR-DNA FISH:感染細胞中のウイルスDNAを検出するための蛍光In Situハイブリダイゼーション技術

蛍光DNAための簡単な方法