We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.

1.組織解剖および固定（60分） <ol><li>ショウジョウバエの脳の場合は、1×PBS（リン酸緩衝生理食塩水）のドロップ第3齢幼虫を置く。積極的に過密でないバイアルまたはボトルからクロールされている大規模な第3齢幼虫を選択してください。 <ol><li>本体の長さ（ 図1A、B）の下2/3をつかむために、口のフックと、別のピンセットのペアのホールドをつかむために1超微細ピンセットのペアを使用してください。脳、腹側神経節、唾液腺と幼虫の消化管の一部が露出するように口のフックに慎重に引き抜いてください。プラスチックペトリプレート上1X PBT（Tweenでリン酸緩衝生理食塩水）の液滴中の他の組織および場所から脳と腹側神経節（ 図1A、B）を分離するためにピンセットを使用してください。 </li></ol></li><li> キョウ精巣解剖のために、男性の3日齢の蛹（赤い目と黄色の体）を選択します。雄キョウが ​​fに対する小翼パッドの長さを有する蛹（ 図1C）中にemales。 <ol><li> 1ピンセットペアと胸部領域の近くに腹部の上部に蛹を持ち、他のピンセットのペアを使用して、腹部の非常に遠位先端をつかむと、涙形の精巣を引き出し（彼らは脂肪に囲まれて静かに振とうすることができます体; 図1D）。プラスチックペトリプレート上1X PBTの液滴に適切な押しつぶし、と場所を防ぐことができます精巣、からの外装ボディパーツを取り外してください。 </li></ol></li><li>各スライドについて、4つ、又は5つの組織サンプル（ すなわち 、 ショウジョウバエ幼虫の脳またはキョウ精巣 ）の合計を分析。 注：複数の5つのサンプルは、超満員の核および染色体につながる。 </li><li>必要に応じて、低張液で組織を治療、有糸分裂染色体の真正染色質領域での姉妹染色分体のいくつかの分離を達成するために：5-10 0.5％クエン酸ナトリウムの低下に1X PBTからの脳を転送する（せいぜい10）分ない NOTE：コルヒチン（有糸分裂阻害剤）中期11で有糸分裂像の数を増加させるために有用であることができる。それが否定的な染色体の解像度に影響を与えることができるので、非常に大きな健康な幼虫が広がり、形態、使用、さらに望ましくている場合は、その使用は不要である。 </li><li>クリーンシグマコート処理したカバースリップの表面上に固定液の液滴（〜20μL）（45％酢酸中2.5％パラホルムアルデヒド）を配置します。 注：各使用日の固定剤溶液は新鮮なことを確認します。 45パーセント酢酸中1.8-3.7％のパラホルムアルデヒドに至るまで固定液ソリューションは、魚のために最良の結果をもたらす。脳や精巣以外の組織を使用して、または免疫FISHのためにこのプロトコルを適応すると、別の固定剤を使って実験が必要な場合があり（異なる固定剤のリストについては、12を参照のこと）。 </li><li>注意深く極細ピンセット、小指と固定液滴に解剖バッファー（1×PBT）から各組織サンプルを転送する固定液にバッファを解剖の転送をシュッ。彼らは一様に固定液滴内の互いに離間されるように、組織サンプルを置きます。室温で4分間固定液中で組織をインキュベートする。 </li><li>組織とカバースリップ上にダウンポリリジンコートスライド顔を慎重に配置します。この時点で下に押し、その代わりにカバースリップ、スライドの下にスティックように、2つを軽く接触させないでください。カバースリップが上になるようにスライドを反転。 </li><li>ろ紙の折返し片内側スライド/組織/カバースリップを挟む。安定した表面には、非常にしっかりとまっすぐ下に直接カバースリップ上の位置に親指、プレスを使用。 （これは組織の汚れが発生します）カバースリップの滑り横を避けるように注意してください。 </li><li>液体窒素中にスライド/組織/カバースリップ水没（ 図1E、Fで装置を参照）、および窒素が沸騰（長いをf停止するまで放置するINE）。スライドを削除し、すぐに（カミソリの刃で固定組織を傷つけない）上方向にカバースリップの角をフリックで新鮮なカミソリの刃でカバースリップをオフにスナップ。 <ol><li>ドライアイスのブロックのスライド/組織/カバースリップを予冷、カバーが前に割れからスライドを防ぐことができます液体窒素中に沈めることに1〜2分間、最大スリップ。 </li></ol></li><li>すぐに室温で100％エタノールを充填したコプリンジャーに組織にスライドを配置し、（必要に応じて、この時間を長くすることができる）は、少なくとも5分間放置する。 NOTE：冷100％エタノールを使用することもできる。 </li><li> 、組織とスライドを取り外します（固定組織に触れることなく）キムワイプと過剰のエタノールを逃がすし、1時間空気乾燥スライドを残す。 <ol><li>ステップ2またはハイブリダイゼーションを実行する前に、数ヶ月に低湿度空気中または数週間のための乾燥室で乾燥スライドを維持するために直接進む。 </li></ol></li></ol> 図1：脳を解剖するための幼虫ダウン方法の口のフックをつかむためにどこにするために示された位置との（A） 第3齢ショウジョウバエ幼虫（右）、（*で示される）と2/3。 第3齢ショウジョウバエ幼虫（右）と、このの概略から解剖（左）同じ発達段階A幼虫の概略、幼虫の頭の中の脳の相対的な位置を示した。（B）は 、脳と腹側神経節蛹をつかむために示す位置に3日齢のキョウオス蛹（右）から解剖組織（左）。黄色のボディ·赤目の段階で（C）3日齢キ ​​ョウ蛹 。（D）精巣組腹部の後部に（*で示される）と体の途中。 （左）は概略を描いた男性と女性だったp個の蛹。雄の蛹は、プロファイルを越えて延びる翼を有する雌とは対照的に、矢状プロファイル（黒矢印）を越えて延びない翼によって区別す​​ることができる。精巣ペアの相対位置は、雄蛹に示されている。液体窒素の容器中にスライドを浸漬するために使用されるペーパークリップ、及び（F）方法の（E）の装置列。複数のクリップ列が複数のスライドの同時浸漬のために使用することができる。 in situハイブリダイゼーション 2（1日目の30分、長いプローブ·オン2日のために1時間〜2.5時間） <ol><li> 1.1倍のハイブリダイゼーション緩衝液20μlに各プローブの1μL（100 NG）を追加します。固定組織の表面上にピペットプローブ/ハイブリダイゼーション緩衝液（組織には手を触れないでください）​​。 </li><li>慎重にカバースリップが組織の真上に中央に配置されていることを確認して、プローブ/ハイブリダイゼーション緩衝液に直接カバースリップを配置。バッファが目に移行する必要があります気泡を残さず、カバースリップの電子外縁。 注：組織と接触しない小さな気泡がプロシージャに何の問題も引き起こさない。慎重にカバースリップの角を持ち上げ、慎重にスライドの上にバックドロップすることで、大きな気泡を除去します。 </li><li> 95°C（カバースリップ上）に予備加熱ブロックの表面上にスライド/組織/カバースリップを置きます。露光を防止するためにアルミホイルの大きなピースでカバー。スライドを5分間95℃でインキュベートしましょう​​。 注：チューブ用の穴を持つ典型的なヒートブロックがスライド/組織/カバースリップを配置する平坦な表面を提供するために裏返しすることができます。 </li><li>それは触ると暖かくなるまで、それは少し冷却させる、スライドを削除します。慎重に、その下に液体を密封するために、カバースリップに張架パラフィルムの一部を包む。 </li><li>湿度チャンバ内の密封されたスライドを配置し、30℃に予熱インキュベーターにチャンバーを配置。 4時間一晩に30℃でインキュベートする。<ol><li>下部に配置湿らせたキムワイプまたはペーパータオルで空の先端ボックスから湿度室または蓋付きタッパーウェアコンテナを作成します。 注：一本鎖DNAオリゴプローブは45-47℃の理論上の融解温度（T m）を達成するために、28〜33塩基であるように設計されている。これらの長さおよびT mの範囲は、我々が研究してきた多くの反復配列がATリッチであるため、非常に低いGC含量を有するという事実を反映する。より長いプローブは、おそらく、より高いT m値を有することになる。これは、30℃の標準的なハイブリダイゼーション温度で、より高いバックグラウンドハイブリダイゼーションを生じ得る。したがって、ハイブリダイゼーション温度を有するいくつかのトラブルが最良の結果を達成するために必要とされてもよい。段階的に、5℃で最高のハイブリダイゼーション温度、増加（または減少）温度を検索するには。 </li></ol></li><li>慎重にスライドからパラフィルムを除去した後、丁寧にゆっくりと1コーナーを持ち上げてカバースリップを取り外します。ワ0.1×SSC緩衝液中でのshスライドを15分間3回洗浄。光の露出を最小限にするための洗浄中にアルミホイルでコプリンジャーをカバーしています。 </li><li>長いビオチン化プローブを使用していない場合は、2.8に進みます。 <ol><li>長いビオチン化プローブを使用している場合は、組織自体に触れないように注意しながら、キムワイプで組織周辺を乾燥させます。組織上のブロッキング溶液を100μlを置き、トラップ気泡を避けるように注意しながら、カバーガラスで優しくカバーしています。パラフィルムでカバースリップ上にスライドをラップし、30分間37℃で配置します。 </li><li>慎重にカバースリップを削除し、キムワイプで組織を中心にブロット。ピペットローダミン - アビジン希釈した1100μlの：組織上のSBTで千とトラップの泡を避けるように注意しながら、カバーガラスで優しくカバーすること。パラフィルムでカバースリップ上にスライドをラップし、30分間37℃で配置します。 </li><li>慎重その後カバースリップを削除して、4倍SSCTで5分間ずつスライドを3回洗浄し、0.1×SSC中で5分間3回ずつ。 注：スライドをより長い期間にわたって洗浄することができる。 </li></ol></li><li> （組織に触れないように）スライドを削除し、余分な緩衝液を除去するために乾燥したキムワイプを用いて組織を中心にブロット。 10〜15分間、または水分が完全に消散するまで、暗所でスライド組織側を上に置きます。 </li><li>のVectashieldマウンティング培地をピペットで11μlの（4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドールDAPI）組織へ。慎重に直接封入剤と組織の中心部のきれいなカバースリップ（シグマコートで処理されていない）を配置します。封入剤は、カバースリップの端に向かって外側へゆっくりと移行する必要があります。 注：封入剤は、すべての側面にカバースリップの縁に到達するのに失敗した場合は、封入剤の追加の1-2μlの必要な体積を埋めるためにカバースリップの縁の一つの位置に適用することができる。この場合は、前のスライド表面から余分なメディアを離れて拭いてくださいシーリング。 </li><li>マニキュアでカバースリップの端をシール。組織サンプルの上にマニキュアを塗ることは避けてください。 </li><li>暗い場所で直立スライドを置き、完全にハード（通常は30分以上）まで、ネイルポリッシュ乾燥させる。この時点で、画像後でイメージングのため最大1週間-20℃で組織またはストア。 </li></ol>バッファ/ソリューションのレシピ 10倍のPBS <ul><li> 80グラムのNaCl </li><li> 2.0グラムのKCl </li><li> 14.4グラムのNa 2 HPO 4 </li><li> 2.4グラムのKH 2 PO 4 </li><li> 7.4にpHを、H 2 Oに1 L </li></ul> 1X PBT <ul><li> 5ミリリットル10倍のPBS </li><li> 45ミリリットルのH 2 O </li><li> 0.1％のTween 20 </li></ul> 20X SSC <ul><li> 175.3グラムのNaCl </li><li> 88.2グラムクエン酸ナトリウム</li><li> 800ミリリットルのH 2 O中</li><li> 7のpHを、H 2 Oの1 L </li></ul> 4X SSCT <ul><li> 200ミリリットル20X SSC </li><li> 799ミリリットルのH 2 </サブ&gt; O </li><li> 0.1％のTween 20 </li></ul> 0.1×SSC <ul><li> 5ミリリットル20X SSC </li><li> 995ミリリットルのH 2 O </li></ul>ハイブリダイゼーション混合物（20μL; 11から変更） <ul><li> 10μlのホルムアミド</li><li> 4μlの50％のデキストラン硫酸</li><li> 2μlの20X SSC </li><li> 4μlのH 2 O </li></ul> SBT 8（10ml）中<ul><li> 2ミリリットル20X SSC </li><li> 0.01グラムのウシ血清アルブミン（BSA） </li><li> 10μlのトゥイーン20 </li><li> 7.9ミリリットルのH 2 O </li></ul>ブロッキング溶液8（10ml）中<ul><li> 0.3グラムのBSA </li><li> 10μlのトゥイーン20 </li><li> 2ミリリットル20X SSC </li><li> 8ミリリットルのH 2 O </li></ul>パラホルムアルデヒド固定液（1ml）を<ul><li> 393.75μlのH 2 O（最初の水を追加） </li><li> 450μlの氷酢酸</li><li> 156.25μlの16％のパラホルムアルデヒド</li></ul>

<ol>
	<li>Blattes, R., Kas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+(FISH)+on+diploid+nuclei+and+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+melanogaster+larval+tissues.">Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li><li>Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+with+transposable+element+probes+to+mitotic+chromosomal+heterochromatin+of+Drosophila.">Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).</li><li>Pardue, M. 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M., Noor, M. A., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+Y-linked+genes+to+the+dot+chromosome+in+Drosophila+pseudoobscura.">Translocation of Y-linked genes to the dot chromosome in Drosophila pseudoobscura.</a> Molecular Biology and Evolution. 27 (7), 1612-1620 (2010).</li><li>Ferree, P. M., Barbash, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+heterochromatin+prevents+mitotic+chromosome+segregation+to+cause+hybrid+lethality+in+Drosophila.">Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila.</a> PLoS Biology. 7 (10), e1000234 (2009).</li><li>Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. 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H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSR+(paternal+sex+ratio)+chromosomes:+the+ultimate+selfish+genetic+elements.">PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements.</a> Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial or any other conflict of interest.

DNA ISHは、しばしば、染色体に特異的な配列をマッピングするために使用される。我々は、高コピー数、ヘテロクロマチンの配列のために最適化DNA ISHのための簡単​​な方法を記載している。むしろ、他の既存のDNA ISHプロトコールにおいて必要条件で、ホルムアミド溶液中での洗浄を使用するのではなく、我々は、DNAを変性させるために予め加熱されたブロックに直接組織に取り付けられた...

in situハイブリダイゼーション （DNA ISH） における DNAは、特定の染色体領域にシーケンスをマッピングするために一般的に使用される方法である。長いDNA生成物1,2及びdeoxygeninの取り込みのニックトランスレーションまたは末端標識（DIG）を含む、ユークロマチン内の単一コピー領域へのプローブのアプローチの一握りを介して生成することができますが、多種多様を通じてヌクレオチドおよびそれらの認識を-attachedグループ標識抗体1-3。少数または単一のコピー数の真正染色質系列の可視化は、高い特異的活性または集合シグナルを増強複数の、より小さなプローブのカクテルを持つ単一の、大規模なプローブのいずれかを使用する必要があります。 彼らは通常、数万のブロックとして知られている単一の染色体領域に密集反復の千として存在しているのでこれとは対照的に、そのようなサテライトDNAとしてヘテロクロマチンに見られる高度反復配列は、DNA ISHのために簡単にターゲットである。転移因子はまた、であることができる明確な染色体遺伝子座2で高コピー数で発見。これらのケースでは、低い比活性を持つ単一のプローブは、効果的に複数のサイトで彼らのハイブリダイゼーションのためにヘテロクロマチン系列ラベルを付けることができます。反復配列に対するプローブは、市販の短いオリゴヌクレオチド（30-50 bp）を合成し、化学的に異なる複数の蛍光性基のいずれかと結合体化され得る。ゲノム配列決定技術を用いて、ヘテロクロマチン内の反復配列をマッピングすることにより、高度に反復的な衛星のブロック4-6,7内の建物の足場で遭遇する課題には困難である。現在、ISHは、サブ染色体レベルでのこれらの配列をマッピングする最も効果的な方法として表す。この戦略は、進行中のゲノム及びトランスクリプトーム配列決定研究によって明らかにされている反復配列の多数をマッピングするために重要である。 スライドマウント染色体上の反復配列のマッピングの効率および容易さがGREであろうatly DNA ISHのために単純化されたプロトコルによって強化。例えば、DNA ISHのための既存のプロトコルは、このようにマッピングシーケンスの所要時間と実質的に添加しても高価な試薬のための化学廃棄物を大量に産生する、ホルムアミド溶液中でハイブリダイズ2,8組織の複数回の洗浄を含む。ここでは、ホルムアミドの洗浄の必要性を回避し、基本的な実験装置および試薬を利用して修正されたDNA ISH方法について説明します。この方法は、本来の蛍光色素とコンジュゲートしている、商業的に合成されたオリゴを用いて、 ショウジョウバエ幼虫の神経芽細胞の異質領域において高度に反復DNA配列の迅速なマッピングのために設計された。しかし、この方法はまた、他の手段9,10を介して、複数の異なる組織及び染色体タイプにわたって合成された大きいプローブを使用して反復配列をマッピングするために働く。さらに、この方法は、より長いまたはmultip使用してユークロマチンシーケンスをマッピングするために使用することができるル、関心の真正染色質配列内に短いプローブ。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="542">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:285px;"></td>
			<td style="width:257px;">Company</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Materials&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Ultrafine tweezers (5 gauge)</td>
			<td>Dumont</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">22mmx22mm cover slips, Sigmacote-treated by immersion for 15 seconds, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear</td>
			<td>Fisher</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Sigmacote</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Filter paper (75-150mm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Paraffin wax paper</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Heat block with thermometer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Dry incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Razor blades</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Humidity chamber (empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Coplin jars (with slide grooves)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Aluminum foil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pasteur pipettes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1.5 mL microfuge tubes</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Nail polish (clear or colored)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">2-20 &#956;L micropipette and plastic tips</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">20-25 standard metal paperclips linked to form a chain</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td>Company/Notes</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Reagents</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">16% EM grade paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Acetic acid</td>
			<td>Sigma</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Liquid nitrogen</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">100% Ethanol, chemical grade</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Long biotinylated probe (e.g. nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen)</td>
			<td>Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Rhodamine-Avidin (for detection of long biotinylated probe)</td>
			<td>Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Hybridization buffer</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">4X SSCT (Saline-sodium citrate + Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">0.1X SSC (Saline-sodium citrate)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Blocking solution</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">SBT (SSC, Bovine serum albumin, Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1X PBT (Phosphate-buffered saline + Tween)</td>
			<td>Recipe below</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">1X PBS (Phosphate-buffered saline)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td colspan="2" height="17" style="height:17px;">Hypotonic solution (0.5% sodium citrate in H2O)</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Formamide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vectashield mounting medium with DAPI</td>
			<td>Vector laboratories</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple method for fluorescence dna in situ hybridization to squashed chromosomes

in situハイブリダイゼーション （DNA ISH） における DNAは、特定の染色体領域にシーケンスをマッピングするために一般的に使用される方法である。このアプローチは、計算上のアプローチが法外な課題に直面してヘテロクロマチン領域にマッピング高度反復配列に特に有効である。ここでは、他のDNA ISHプロトコルにおける標準手順ですホルムアミドの洗浄を回避するDNA ISHのための合理化されたプロトコルを記述します。我々のプロトコルは、効果的に異なる昆虫の組織タイプの数にわたって異質染色体領域内の反復DNA配列をマークする蛍光色素を担持する短い一本鎖DNAプローブとのハイブリダイゼーションのために最適化されている。しかし、アプリケーションは、単一コピーの大きいプローブおよび可視化（非反復）のDNA配列で使用するように拡張することができる。私たちは、 キイロショウジョウバエの神経細胞とキョウから押しつぶされた染色体に複数の異なる反復配列をマッピングすることにより、この方法を実証するvitripennis精母。我々は両方の小、商業的に合成されたプローブの比較のために、より大きなプローブのハイブリダイゼーションパターンを示している。この手順は、単純な実験室用品および試薬を使用し、DNA ISHを実施するとの経験がほとんどない研究者に最適です。

いくつかの異なる組織からの染色体に、;この方法を実証するために、我々は、化学的に蛍光複合体（ 図2）と（ 図2B PCR産物のニックトランスレーションを通じて行わ）長いビオチン化プローブで修飾した小型の商業的に合成されたオリゴのセットをハイブリダイズタイプ（ 表1参照）。標的配列は、D.から有糸分裂染色体の動原体周囲（ヘテロク?...

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Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

蛍光DNAための簡単​​な方法<em&gt;その場で</em&gt;ぺしゃんこ染色体へのハイブリダイゼーション

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

17.9K ビュー.  University of Rochester. Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

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Pyrosequencing: A Simple Method for Accurate Genotyping

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a tremendous amount of data available comes an explosion of genotyping methods. Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. It also has the ability to identify tri-allelic, indels, short-repeat polymorphisms, along with determining allele percentages for methylation or pooled sample assessment. In addition, there is a standardized control sequence that provides internal quality control. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.


Pyrosequencing(R) is one of the most thorough yet simple methods to date used to analyze polymorphisms. This method has led to rapid and efficient single-nucleotide polymorphism evaluation including many clinically relevant polymorphisms. The technique and methodology of Pyrosequencing is explained.

パイロシーケンシング：正確なジェノタイピングのための簡単​​な方法

Pharmacogenetic research benefits first-hand from the abundance of information provided by the completion of the Human Genome Project. With such a ...

生物学

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

蛍光その場で</emヒト精子の>ハイブリダイゼーション（FISH）プロトコル

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male urethra, which relies on androgenic signals and epithelial-mesenchymal interactions1,2. Understanding the molecular mechanisms responsible for prostate development may reveal growth mechanisms that are inappropriately reawakened later in life to give rise to prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia and prostate cancer.
The developing LUT is anatomically complex. By the time prostatic budding begins on 16.5 days post conception (dpc), numerous cell types are present. Vasculature, nerves and smooth muscle reside within the mesenchymal stroma3. This stroma surrounds a multilayered epithelium and gives rise to the fetal prostate through androgen receptor-dependent paracrine signals4. The identity of the stromal androgen receptor-responsive genes required for prostate development and the mechanism by which prostate ductal epithelium forms in response to these genes is not fully understood. The ability to precisely identify cell types and localize expression of specific factors within them is imperative to further understand prostate development. In situ hybridization (ISH) allows for localization of mRNAs within a tissue. Thus, this method can be used to identify pattern and timing of expression of signaling molecules and their receptors, thereby elucidating potential prostate developmental regulators.
Here, we describe a high throughput ISH technique to identify mRNA expression patterns in the fetal mouse LUT using vibrating microtome-cut sections. This method offers several advantages over other ISH protocols. Performing ISH on thin sections adhered to a slide is technically difficult; cryosections frequently have poor structural quality while both cryosections and paraffin sections often result in weak signal resolution. Performing ISH on whole mount tissues can result in probe trapping. In contrast, our high throughput technique utilizes thick-cut sections that reveal detailed tissue architecture. Modified microfuge tubes allow easy handling of sections during the ISH procedure. A maximum of 4 mRNA transcripts can be screened from a single 17.5dpc LUT with up to 24 mRNA transcripts detected in a single run, thereby reducing cost and maximizing efficiency. This method allows multiple treatment groups to be processed identically and as a single unit, thereby removing any bias for interpreting data. Most pertinently for prostate researchers, this method provides a spatial and temporal location of low and high abundance mRNA transcripts in the fetal mouse urethra that gives rise to the prostate ductal network.

A High Throughput in situ Hybridization Method to Characterize mRNA Expression Patterns in the Fetal Mouse Lower Urogenital Tract

Here, we describe an efficient high throughput in situ hybridization (ISH) method for visualizing patterns of mRNA expression in developing fetal mouse prostate tissue sections. The method can be easily adapted to visualize mRNA expression patterns in other mouse tissues or in tissues from other species.

ハイスループットその場で</em胎児マウス下部尿生殖路のmRNAの発現パターンを特徴づける>ハイブリダイゼーション法

Development of the lower urogenital tract (LUT) is an intricate process. This complexity is evidenced during formation of the prostate from the fetal male ...

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Viruses that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve to divert energy and resources for viral replication. Many aspects of host cell function are commandeered by viruses, usually by the expression of viral gene products that recruit host cell proteins and machineries. Moreover, viruses engineer specific membrane organelles or tag on to mobile vesicles and motor proteins to target regions of the cell (during de novo infection, viruses co-opt molecular motor proteins to target the nucleus; later, during virus assembly, they will hijack cellular machineries that will help in the assembly of viruses). Less is understood on how viruses, in particular those with RNA genomes, coordinate the intracellular trafficking of both protein and RNA components and how they achieve assembly of infectious particles at specific loci in the cell. The study of RNA localization began in earlier work. Developing lower eukaryotic embryos and neuronal cells provided important biological information, and also underscored the importance of RNA localization in the programming of gene expression cascades. The study in other organisms and cell systems has yielded similar important information. Viruses are obligate parasites and must utilise their host cells to replicate. Thus, it is critical to understand how RNA viruses direct their RNA genomes from the nucleus, through the nuclear pore, through the cytoplasm and on to one of its final destinations, into progeny virus particles 1.
FISH serves as a useful tool to identify changes in steady-state localization of viral RNA. When combined with immunofluorescence (IF) analysis 22, FISH/IF co-analyses will provide information on the co-localization of proteins with the viral RNA3. This analysis therefore provides a good starting point to test for RNA-protein interactions by other biochemical or biophysical tests 4,5, since co-localization by itself is not enough evidence to be certain of an interaction. In studying viral RNA localization using a method like this, abundant information has been gained on both viral and cellular RNA trafficking events 6. For instance, HIV-1 produces RNA in the nucleus of infected cells but the RNA is only translated in the cytoplasm. When one key viral protein is missing (Rev) 7, FISH of the viral RNA has revealed that the block to viral replication is due to the retention of the HIV-1 genomic RNA in the nucleus 8. 
Here, we present the method for visual analysis of viral genomic RNA in situ. The method makes use of a labelled RNA probe. This probe is designed to be complementary to the viral genomic RNA. During the in vitro synthesis of the antisense RNA probe, the ribonucleotide that is modified with digoxigenin (DIG) is included in an in vitro transcription reaction. Once the probe has hybridized to the target mRNA in cells, subsequent antibody labelling steps (Figure 1) will reveal the localization of the mRNA as well as proteins of interest when performing FISH/IF.

Detection of Viral RNA by Fluorescence in situ Hybridization FISH

A fluorescence in situ hybridization (FISH) method was developed to visually detect viral genomic RNA using fluorescence microscopy. A probe is made with specificity to the viral RNA that can then be identified using a combination of hybridization and immunofluorescence techniques. This technique offers the advantage of identifying the localization of the viral RNA or DNA at steady-state, providing information on the control of intracellular virus trafficking events.

蛍光によるウイルスRNAの検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）

Viruses  that infect cells elicit specific changes to normal cell functions which serve  to divert energy and resources for viral replication. Many ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

自動化を使用して染色体のハイスループット物理マッピング<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for using FISH to quantify the number of mRNAs in single yeast cells. Cells can be grown in any condition of interest and then fixed and made permeable. Subsequently, multiple single-stranded deoxyoligonucleotides conjugated to fluorescent dyes are used to label and visualize mRNAs. Diffraction-limited fluorescence from single mRNA molecules is quantified using a spot-detection algorithm to identify and count the number of mRNAs per cell. While the more standard quantification methods of northern blots, RT-PCR and gene expression microarrays provide information on average mRNAs in the bulk population, FISH facilitates both the counting and localization of these mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

This protocol describes an experimental procedure for performing Fluorescence in situ Hybridization (FISH) for counting mRNAs in single cells at single-molecule resolution.

蛍光を用いたmRNA分子の可視化と分析<em&gt;その場で</emで&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

マイクロRNA<em&gt;その場で</em&gt;ホルマリン固定腎臓組織のためのハイブリダイゼーション

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization (FISH) to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in cytogenetics and cancer diagnostics, and can detect aberrations of the genome, which often has important clinical implications. RNA FISH can be used to detect RNA molecules in cells and has provided important insights in regulation of gene expression. Combining DNA and RNA FISH within the same cell is technically challenging, as conditions suitable for DNA FISH might be too harsh for fragile, single stranded RNA molecules. We here present an easily applicable protocol which enables the combined, simultaneous detection of Xist RNA and DNA encoded by the X chromosomes. This combined DNA-RNA FISH protocol can likely be applied to other systems where both RNA and DNA need to be detected.

Combined DNA-RNA Fluorescent In situ Hybridization FISH to Study X Chromosome Inactivation in Differentiated Female Mouse Embryonic Stem Cells

Fluorescent in situ hybridization (FISH) allows the detection of nucleic acids in their native environment within cells. We here describe a protocol for the combined, simultaneous detection of RNA and DNA by means of FISH, which can be used to study X chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells.

組み合わせたDNA-RNA蛍光<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）差別雌マウス胚性幹細胞におけるX染色体の不活性化を研究するために、

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique which enables the detection of nucleic acids in cells. DNA FISH is often used in ...

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a &#39;whole mount&#39; tissue preparation, or developmental stage (such as an embryo or larva) of interest. WMISH is extremely powerful because it can significantly contribute to the functional characterization of complex metazoan genomes, a challenge that is becoming more of a bottleneck with the deluge of next generation sequence data. Despite the conceptual simplicity of the technique much time is often needed to optimize the various parameters inherent to WMISH experiments for novel model systems; subtle differences in the cellular and biochemical properties between tissue types and developmental stages mean that a single WMISH method may not be appropriate for all situations. We have developed a set of WMISH methods for the re-emerging gastropod model Lymnaea stagnalis that generate consistent and clear WMISH signals for a range of genes, and across all developmental stages. These methods include the assignment of larvae of unknown chronological age to an ontogenetic window, the efficient removal of embryos and larvae from their egg capsules, the application of an appropriate Proteinase-K treatment for each ontogenetic window, and hybridization, post-hybridization and immunodetection steps. These methods provide a foundation from which the resulting signal for a given RNA transcript can be further refined with probe specific adjustments (primarily probe concentration and hybridization temperature).

A Whole Mount In Situ Hybridization Method for the Gastropod Mollusc Lymnaea stagnalis

The goal of this protocol is to provide users with a set of methods for the high-throughput decapsulation of Lymnaea stagnalis embryos and larvae in preparation for whole mount in situ hybridization, and for subsequent pre- and post-hybridization treatments.

全体のマウント<em&gt;その場で</em腹足類軟体動物のための&gt;ハイブリダイゼーション法<em&gt;モノアラガイstagnalis</em

Whole mount in situ hybridization (WMISH) is a technique that allows for the spatial resolution of nucleic acid molecules (often mRNAs) within a ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

核酸の濾過単離：簡易迅速DNA抽出方法

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

蛍光DNAための簡単​​な方法

蛍光DNAための簡単な方法