この作品は、ニューヨーク州保健局（C026878）によってサポートされていました。 MSはニューヨーク幹細胞財団Druckenmillerフェローだった。ダイム財団の月からの研究助成金番号5-FY11-571によって部分的にサポートされています。

1。フィーダー細胞の調製以下に記述されているすべての試薬 ​​は（ 表1＆2を参照）滅菌方法で準備されるべきであることに注意してください。このプロトコルは、成体マウス精巣の体細胞の形質転換された誘導体であり、他の場所で3記載されているフィーダーとしてJK1細胞株（セルバイオラボズ社、カタログ＃CBA-315）を採用しています。すべての動物の手続きは制度的ガイドラインと規則に従って行われるべきであることにも注意してください。 <ol><li> JK1細胞は、培養中に維持し、最大通路39までの電路として正常に使用することができます。フィルター滅菌したフィーダー細胞増殖培地（DMEM、10％ウシ胎児血清[FBS]、2mMのL-グルタミンおよび抗生物質を添加した）の10ミリリットル、100mmの細胞培養ディッシュ（BDファルコン、カタログ＃353003）で培養JK1細胞。文化が95％コンフルエントに達すると、細胞を1時06 -1:10比を分割します。 </li><li>コンフルエントJK1フィーダー細胞モノから培地を除去層。 </li><li>カルシウムとマグネシウムを含まないPBSで一度細胞層を洗浄してください。 </li><li>あらかじめ温めておいたトリプシン/ EDTA、1×（0.05％trypsin/0.53 mMのEDTA、コーニングCellgro、カタログ＃25-051-CI）を追加し、37℃で5〜10分間インキュベートする。 </li><li>フィーダー増殖培地と等量のトリプシンを不活性化する。細胞を回収し、5分間300×gで遠心分離します。フィーダー増殖培地中で細胞を再懸濁する。 </li><li>うまくカバーし、室温で5分後に削除するために十分な0.4パーセントゼラチン溶液を添加することにより、プレコートは、マルチウェル細胞培養プレート。 </li><li>プレート〜ゼラチンコート細胞培養プレートで1mm 2当たり250細胞（ 例えば、48ウェルまたは6ウェルフォーマット）。 16から24時間37℃で培養をインキュベートする。 </li><li>井戸から培地を取り除きます。注意：細胞増殖を不活性化するDMEM中で希釈された10μg/ mlのマイトマイシン-Cの新鮮な溶液を追加するには、各ウェル（ 例えば 200μl/ウェル、48ウェルプレート用）。マイトマイシン-Cは有毒である。ハンドルと注意して処分してください。でインキュベート37℃で4時間。 </li><li>細胞からマイトマイシンC溶液を除去します。メッキ幹細胞の前にDME​​Mで3回洗浄する。 </li><li>継代中にフィーダーの乾燥を防ぐために、フィーダー細胞の井戸からDMEMを外し、十分な幹細胞培地を追加します（ 表3を参照48ウェルプレートの100μl/ウェル）。フィーダを含むウェルの指示されたサイズを使用して、セクション3.1または3.4で後述するように、同じ日にSSCを追加します。 </li></ol> 2。マウス精巣組織の解離は、ドナー生殖細胞を得るために<ol><li>収穫成体マウス滅菌方法では、精巣および一時的に覆われたペトリ皿（どのような液体なしで追加された）で睾丸を格納します。皿はdessicationを防ぎ、細胞の生存を維持するために氷の上に置かなければなりません。 </li><li> ¾距離THR -滅菌微鉗子や細胞培養フードの微細はさみを使って、完全に精巣（ つまり 、カット〜½のtransectingずに白膜における横切開を加えるウワーッ）とプレートの隅に精細管を絞り出すためにピンセットを使用し、廃棄ニカと添付組織。それによって、その整合性を維持し、蒸発を防ぎ、組織を維持するために冷やした氷の上でプレート全体に保管してください。 </li><li>氷の上に板を維持しながら、迅速に睾丸あたり少なくとも3分間は、晴れた春のはさみで細管をミンチ。 </li><li> 50 mlコニカルチューブ内の尿細管の断片を収集し、アルブミン冷PBS / 1％ウシ血清の約40ミリリットルで洗う。 </li><li>精子や破片から細管断片を分離するために10分間60×gで遠心分離します。上清を捨てる。 </li><li> 15 mlコニカルチューブでは、あらかじめ温めておいた解離緩衝液（DMEM、0.05％トリプシン、0.03％コラゲナーゼI型、DNアーゼIの80 U / mlとウシ血清アルブミン、0.5％の精巣あたり3 mlにペレットを再懸濁し、 表を参照してください。解離緩衝液のより具体的な詳細については、2）。 </li><li>最大化するために15分間37℃で150 rpmのシェーカーセット内のラックに水平コニカルチューブを置きますgitation。 </li><li>解離していないチャンクから単一細胞を分離するために10分間60 xgでスピンダウンします。 </li><li>次のステップまでペレットを含むチャンクを保存します。ステップ2.8から上清を回収し、解離緩衝剤を中和するために3ミリリットルDMEM/10％ウシ胎児血清を追加します。一時的にチューブを氷上に置きます。 </li><li>ステップ2.8の後に残っ再度ダイジェストチャンクへのステップ2.9から保存されたペレットと2.6から2.7の手順を繰り返します。 </li><li>解離緩衝剤を中和するDMEM/10％FBSの等量を追加します。 </li><li>ステップ2.9から保存した細胞懸濁液を持つステップ2.11から再結合するサスペンション。 300×gで5分間遠心します。 </li><li>精巣のペアあたり16ミリリットルの容積の幹細胞培地中でペレットを再懸濁します（ 表3を参照）。 </li></ol> 3。精巣細胞懸濁液のめっき<ol><li> 37＆で細胞培養インキュベーター中でマイトマイシン-Cおよび場所で有糸分裂で不活化フィーダー細胞を含む6ウェルプレートのウェルあたりの細胞懸濁液をプレート2ミリリットル度、C、5％CO 2中。 </li><li> 48時間、吸引培地後、2 mlの新鮮な培地を追加して、インキュベーターに戻ります。 </li><li> 48時間後、各ウェルに0.5 mlの新鮮な幹細胞培地を追加して、インキュベーターに戻ります。 </li><li> 48時間後、続いて細胞を週3回、その後、大、控えめなコロニーは（&gt; 50セル）（7〜21日以内）に表示​​されるまで、次のように食べます。毎週供給第一及び第二の場合（ 例えば 、月曜日と水曜日）培地の約50％を除去し、新鮮な培地の体積でバック50％を追加します。第3の供給（ 例えば金曜日）には、すべての培地を吸引し、2 mlの新鮮な培地と交換してください。このアプローチは、完全培地の変更の回避は培地9に分泌されるパラクリン信号の濃度の変動を最小限に抑えることの理論的根拠に基づいています。 </li></ol> 4。初通過のためのコロニーピッキング<ol><li>継代するコロニーを含むウェルから培地を除去し、新鮮な幹細胞培地を加える。 </li><li> 10倍の対物レンズを用いてコロニーを同定する。少し脱焦点顕微鏡を用いて、ウェルのエッジでのSSCコロニーが細胞ので、それは個々のセルの枠線を識別することが困難または不可能である多くの11から12μmの直径の細胞から成る均質明るい塊、、として表示されます（ 図1A）一緒に融合現れる。非SSCのコロニーが識別可能な境界線（ 図1A、はめ込み）で、暗く、よりきめ細かな、多かれ少なかれ均質な表示されることがあります。 </li><li> 50μlにpipettemanセットで、200μlのピペットチップを用いて、第1ウェルから培地を取り、先端を濡らし追い出す。その後、静かに急速に先端（ 図1B）に吸引によってコロニーを取り除くために、50μlの培地を引き抜く前に、先端でコロニーをナッジ。 </li><li>幹細胞培地（ 図1C）100μlで不活化したフィーダー細胞を含む48ウェルプレートのウェル1にコロニーを含む培地を追放。 </li><li>ステップを繰り返し4.3およびウェルあたり500μLを超えることなく、同一のウェルに8コロニーまで追加。 </li><li>通路1 SSCのコロニーを48ウェルプレートの追加のウェルを準備するために4.3から4.5の手順を繰り返します。 </li><li>ウェルズは（1D図 ）7〜14日で、または500細胞までの大きな塊が出てきた後に分割できるようになります。 </li></ol> 5。粉砕によってSSCのその後の展開と継<ol><li> 1時06分（7日ごと）に、最初の3継代のための1:2の分割比の14日への通路1でセルアップ後に新鮮な餌箱の上に継代されるべきであり、1:4その後、以下のとおりです。優しくセルにわたって洗浄媒体によって1ミリリットルピペットチップで半コンフルエント裕福コロニー（ 例えば 〜300,000のSSC / 6ウェルプレートの）粉薬。コロニーは取り外し見ることができます。液体の流れとあまりにも力が不要なフィーダー細胞があまりにも外れてしまいます。 </li><li> 、300×gでコニカルチューブと遠心分離機中で磨砕し、細胞を回収5分。注：調査員が希望する場合、トリプシン処理ステップが無事にここに追加することができます。 </li><li>上清を吸引除去し、徹底的にコロニーを破壊するために上下にピペッティングして新鮮な幹細胞培地中に再懸濁する。 </li><li>マイトマイシンCで不活性化し、新たに調製したフィーダー細胞上にプレートSSCは、セクション1で説明した。 </li><li>次のように細胞を1週間に3回を養う。第一及び第二の授乳のために（ 例えば 、月曜日と水曜日）新鮮な培地の体積で50％を追加します。第3の供給（ 例えば金曜日）には、すべての培地を吸引し、2 mlの新鮮な培地と交換してください。プレートは7-10日にコンフルエントになるでしょう。培養は、体細胞10から生殖細胞を区別するために（ 例えば、マウス生殖細胞マーカーGCNAを使用）免疫染色に基づいて5から7までの継代後&gt; 98％の生殖細胞（ すなわち 、&lt;1％混入した体細胞）から構成されるべきである。注：これらのメソッドは、機関によって定められた規制や要件に準拠して開発されたワイルコーネル医科大学のアル動物のケアと使用委員会。 </li></ol>

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MSはJK1細胞を分配するには、Cell Biolabs社、株式会社にライセンスを通じてワイルコーネル医科大学からロイヤルティーを受け取る。

成体精巣由来のフィーダー細胞を用いた成人のSSCを導出するためのこの方法は、堅牢であり、共通の遺伝的背景（ 例えば FVB、C57BL6および混合129SV/C57Bl/6）と、さまざまな変異株は2,3,7,14を用いた場合に成功しました。 7実際には、培養系で作成された微小環境は、 生体内での成人のSSCを（ - / -動物PLZFの場合など ）を維持することへの遺伝的障壁の...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>コー​​ニング</td><td> 10から013 </td><td>解離緩衝液の希釈</td></tr><tr><td>トリプシン/ EDTA </td><td>メディアテック</td><td> 25から051-CI </td><td></td></tr><tr><td>幹細胞基本培地（StemPro-34） </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 10639-011 </td><td>篠原らに従って補充を必要とします。 （2003）* </td></tr><tr><td>細胞培地サプリメントを食い止める</td><td>さまざまな</td><td>表3を参照してください。 </td><td>篠原らに従って補充を必要とします。 （2003）* </td></tr><tr><td> JK1細胞</td><td>セルBiolabs社株式会社</td><td> CBA-315 </td><td>当たりSeandel ら 、成体の精巣間質細胞と置き換えることができます。 （2007） </td></tr><tr><td>マイトマイシンC（注意） </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M4287 </td><td>毒性、慎重に取り扱ってください。 </td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G1890 </td><td>水の0.4％溶液</td></tr><tr><td> EVOS XLデジタル倒立顕微鏡</td><td>高度な顕微鏡グループ</td><td> - </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1。特定の試薬 ​​および装置。 *表3を参照してください</td></tr><tr><td> DMEM </td><td>コー​​ニング</td><td> 10から013 </td><td>解離緩衝液の希釈</td></tr><tr><td>トリプシン（1:250） </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 27250-018 </td><td>解離緩衝液：0.05ファイナル％重量/体積</td></tr><tr><td>コラゲナーゼは、235 U / mlをI型</td><td>ワージントン</td><td> CLS1 235 </td><td>解離緩衝液：ファイナル0.03パーセント重量/体積</td></tr><tr><td> DNアーゼI </td><td> SIGMアルドリッチ</td><td> DN25 </td><td>解離緩衝液：80ファイナルU / mlの</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td> ICPのバイオ</td><td> ABRE-100G </td><td>解離緩衝液：0.5ファイナル％重量/体積</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表2。解離緩衝液 </td></tr><tr><td> StemPro-34 SFM </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> StemPro-34栄養補助食品</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> 追加料金** </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> M7145 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> MEMビタミン溶液</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 11120-052 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td>メディアテック</td><td> 25-005 </td><td> 2mMの</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td> ICPのバイオ</td><td> ABRE </td><td> 0.50パーセント</td></tr><tr><td>抗生物質抗真菌ソリューション</td><td>メディアテック</td><td> 30-004-CI </td><td> 1X </td></tr><tr><td> D（+）グルコース</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G8769 </td><td> 6 mg / mlの</td></tr><tr><td> β-エストラジオール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> E2758 </td><td> 30 ng / mlの</td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td>カルビオケム</td><td> 5341 </td><td> 60 ng / mlの</td></tr><tr><td>ウシ胎仔血清</td><td>変数</td><td> N / A </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>ウシホロトランスフェリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> T1283 </td><td> 100μg/ mlの</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>ジェミニバイオ製品</td><td> 700-112P </td><td> 25μg/ mlの</td></tr><tr><td>人間GDNF </td><td>人生Technologies </td><td> PHC7041 </td><td> 10 ng / mlの</td></tr><tr><td>ヒトbFGF </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> PHG0023 </td><td> 10 ng / mlの</td></tr><tr><td>マウスEGF </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> PHG0313 </td><td> 20 ng / mlの</td></tr><tr><td>プトレッシン</td><td>リサーチ·オーガニック</td><td> 0778P </td><td> 60μMの</td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> S5261 </td><td> 30nMの</td></tr><tr><td>ピルビン酸</td><td> Alfa Aesar社</td><td> A13875 </td><td> 30μg/ mlの</td></tr><tr><td> DL-乳酸</td><td> JTベーカー</td><td> 0196から04 </td><td> 1μg/ mlの</td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 21985-023 </td><td> 50μMの</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> A4544 </td><td> 100μMの</td></tr><tr> &lt;TD&gt; D-ビオチン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> B4639 </td><td> 10μg/ mlの</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表3。細胞培地を食い止める </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * 注：培地を使用する前に、以下のサプリメントを追加します。フィルタ4℃で殺菌し、それを維持媒体は、少なくとも2週間安定です。 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> **私たちはどんな明白な有害作用せずに、異なるメーカー、製剤、および/またはこれらの試薬のロット番号を使用している。一般的に、細胞培養グレードの試薬を採用する必要があります。 </td></tr></tbody></table>

serial enrichment of spermatogonial stem and progenitor cells (sscs) in culture for derivation of long-term adult mouse ssc lines

精巣の精原幹細胞や前駆細胞（SSCS）は哺乳類成体幹細胞の典型的な例を表しており、動物のほぼ生涯のための妊孕性を温存。 生体内で自己複製と分化を支配する正確なメカニズムは研究に挑戦しているが、様々なシステムが特殊な培地と1-3フィーダー細胞の組み合わせを用いてin vitro でマウスのSSCを伝播するために以前に開発されてきた。 SSCの生物学へのin vitroでの進出で大部分が成人の細胞株4を得ることが困難であるため、おそらく新生児から細胞株を導出した。しかし、精巣は最もマウス系統で年齢の〜5週間まで成長し続けている。早期産後の期間では、劇的な変化は精巣のアーキテクチャでは、数多くの幹細胞関連の発現レベルの変化を含む体細胞および精子形成細胞の両方の生物学、発生する遺伝子。したがって、新生児由来のSSC線が完全に成体精巣が定常状態に達した後も持続成人SSCの生物を再現しない場合があります。 いくつかの要因は、歴史的に成人のSSCラインの生産を妨げてきた。まず、機能的な幹細胞の割合は、内因性又は外因性の要因5,6のために、どちらかの、成人期に低下することがあります。さらに、他の成体幹細胞と同様に、それは免疫選択または他のソート戦略7の組み合わせを使用することなく、合計成人精巣細胞から十分にSSCを豊かにすることは困難であった。一般的に用いられる戦略は、他の細胞型8〜幹細胞の比率が高いのため、ドナー細胞の供給源としての停留マウスの使用が含まれる。初期培養から体細胞の除去はSSCの生存のために不可欠である幹細胞ニッチとの相互作用を破壊するという仮説に基づいて、我々は以前に成人リットルを導出する方法を開発免疫選択または停留ドナーを必要とするのではなく、文化の中でのSSCのシリアル濃縮を採用していないアイネスは、証券取引等監視委員会2,3と称する。 以下に説明する方法は、精巣間質細胞株（JK1）3から成るフィーダ上の細胞のメッキに続いて成人ドナー精細管を、解離することによって大人のSSC線を導出するための簡単な手順を必要とする。シリアル継代を通じて、強固に癒着して、汚染非生殖細胞はSSCの併用で濃縮培養から枯渇している。このように製造された文化は、長期的な自己再生能力に基づいてSSCを、含まれている、分化の様々なステージで精原細胞の混合物を含んでいる。証券取引等監視委員会法の核心は、それが根本的に異なる微小環境におけるin vitroで長期自己複製に生体内で自己複製から困難な移行を行うためにSSCを可能にすることで、汚染の自由な、長期的なSSCの行が生成されます体細胞と、それによってSSCのその後の実験的操作を可能にします。

7日後に通過ゼロ野生型、成人SSCコロニーの外観を図1に示します。三次元のコロニーが上に成長しているSSCの複数のレイヤーを持つフィーダーにより堆積フィーダまたは下っ端細胞外マトリックスに接続されている平らな細胞の層で構成されています。健康SSCは明るく屈折性と均一に11から12μmの直径ですが、セルの枠線を区別するのは困難であり、コロニーの大きさがウェル内?...

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Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

派生して、成体マウスの精子幹細胞や前駆細胞株を維持するために簡単な方法は、ここに提示されます。この方法は、成体マウスの精巣の体細胞コンパートメント由来するフィーダー細胞を利用しています。この技術は、トランスジェニック、ノックアウトを含む一般的なマウス系統に適用可能であり、ノックインマウス。

長期成体マウスのSSCラインの導出のために文化の精原幹細胞や前駆細胞の濃縮シリアル（SSCS）

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

serial-enrichment-spermatogonial-stem-progenitor-cells-sscs-culture

Research

JoVE Journal

Biology

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

13.7K ビュー.  Weill Cornell Medical College. 派生して、成体マウスの精子幹細胞や前駆細胞株を維持するために簡単な方法は、ここに提示されます。この方法は、成体マウスの精巣の体細胞コンパートメント由来するフィーダー細胞を利用しています。この技術は、トランスジェニック、ノックアウトを含む一般的なマウス系統に適用可能であり、ノックインマウス。

ビデオ: Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

マウス胚性幹細胞から造血幹細胞の導出

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

生物学

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

分離と成人ヒト内皮コロニー形成前駆細胞の大規模拡張

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

マウスES胚細胞の単離と導出

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

胚盤胞からマウス栄養膜幹細胞の導出

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

ヒト皮膚から大人上皮幹細胞の単離と培養

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

甲殻類との長期致死毒性試験アルテミアfranciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

成体マウス切歯から歯科上皮幹細胞の単離および培養

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

成体マウス頭蓋冠骨髄中の造血幹細胞および前駆細胞のin vivo 4次元トラッキングで

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

マウス骨髄からの破骨細胞の導出

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...