これらのプロトコルは、2Dまたは3D培養条件下でECMおよびDCMフリー環境の両方で、構造的に模倣および内分泌機能精巣オルガノイドを多数生成することを可能にする。これらの技術は、非常に再現性が高く、標準的な生物学的実験室の設定に簡単に適用され、共通のツールと材料のみを利用しています。精巣オルガノイドは、インビトロで精子形成と生殖内分泌をシミュレートするための新しいツールであり、いつかインビトロゲーム産生の研究を可能にするかもしれません。
まず、安楽死させたマウスの上に、解剖マットの上にマウスの上を置き、70%エタノールで腹部を殺菌します。下腹部の皮膚を鉗子でテントに張り、はさみで開きます。腹部の左下および右のりぎり領域に精巣を見つけ、精管およびアンカー結合組織への接続を切断する。
その後、動物から精巣全体を持ち上げます。事前に平衡したBMのペトリ皿に入れます。解剖顕微鏡の下で、小さなマイクロ解剖はさみのいずれかで、または2つの細かい鉗子で穏やかに引き裂くことによって、各精巣の一端にチュニカアルブギネアに小さな切開を行います。精巣を切開の反対側の端から保持しながら、細かい鉗子で軽く絞り、テクリアの穴に向かってスイープモーションを押し込み、精巣組織を1つのまとまりのある部分として放出します。
組織を小さく切ります。1ミリリットルのプリウォーム解離溶液1つに入れ、摂氏37度で10分間インキュベートします。インキュベーション後、P1000ピペットで精巣片を50回軽くトリチュレートします。
細管が互いに分離し、間質組織から分離することを確認します。塊が残っている場合は、さらに5分間インキュベートし、再びトリチュールします。解離混合物の1ミリリットルあたり33マイクロリットルのヒアルロンジダーゼストック溶液を加える。
その後、P1000ピペットで50回トリチュレートし、5分間摂氏37度でサンプルをインキュベートします。インキュベーション後、P200ピペットで50回トリチュレートします。目に見える細管または細胞の塊が存在することを確認した後、サンプルの総体積の10%にFBSを加えることによって解離酵素をクエンチし、P200ピペットで数回それを三分化する。
40マイクロメートルの細胞ストレーナーの中央を培地で濡らし、吸引し、サンプルを予め濡れたストレーナーに加え、それを濾過して単一細胞懸濁液を作り出します。懸濁液を100回gで7分間遠心する。上清を捨て、新鮮なBMで細胞を再中断します。トリパンブルーの排除を使用してヘモサイトメーター上の生存細胞を数え、遠心分離機を再び、新鮮なBMで再中断します。2D ECMフリー培養の場合、プレート単細胞懸濁液を4ウェルチャンバースライドに直接配置し、スライドを35°Cインキュベーターに配置します。
2D ECM-cultureの場合、冷たい1対1の希釈された細胞外マトリックス媒体の100マイクロリットルを4ウェルチャンバースライドに分配し、ゲルが皿底を覆うことを保証する。ECMがゲルに重合できるように、最低30分間、インキュベーターにスライドを置き、その上に細胞懸濁液を加えます。3D ECMフリーの文化のために、アガロース3Dペトリ料理を24ウェルの文化皿に入れ、1ミリリットルのBMで覆います。35°Cインキュベーターで少なくとも30分間BMで平衡化し、BMを捨て、新鮮なBMの1ミリリットルでもう一度平衡を繰り返します。ウェルからすべてのBMを取り出し、3Dペトリ皿の中央凹部の内側ではなく、新鮮なBMの200マイクロリットルを分配し、マイクロウェルインサートの中央セルシード凹部の内側から残りのBMを収集します。
単一セルの懸濁液を中央の凹部に分配し、上下に軽くトリチュレートします。食皿を加湿した35度の培養器に入れます。翌日、アガロース3Dペトリ皿の周りから既存のメディアをゆっくりと慎重に取り除き、新鮮なBMの1ミリリットルに置き換えます。オルガノイドは一晩で圧縮され、底部で休むことを可能にするはずです。
3D ECM培養の場合、BMの細胞懸濁液の等しい部分を冷たプレ解凍ECMと組み合わせて単細胞懸濁液を調製する。それが十分に混合されていることを確認するために数回トリチュレート。その後、すぐに4ウェルチャンバースライドに混合物を分配し、プレートの底全体を覆っていることを確認します。
チャンバースライドを摂氏35度でインキュベートし、その内容物を少なくとも30分間重合させます。重合後、培養物の上に500マイクロリットルのBMを加える。35°Cですべてのオルガノイドモデルタイプを培養します。
すべての文化タイプについて、メディアの半分を2日ごとに新鮮なBMと交換します。このプロトコルは、若年性マウス精巣細胞を用いて24時間以内にオルガノイド生成を達成するために使用された。正常に生成された組織は、最初は3D細胞クラスターとして観察された。
ECM 環境では、セル・クラスターはクラスターとその周辺環境の間に明確なマージンを持っていました。細胞クラスターは、ECMを横断し、融合することも観察された。3D ECM カルチャでは、他のすべてのカルチャメソッドよりも、de novo 構造体を組み立てるのにかなり多くの時間が必要でした。
そして、3D ECMフリー培養は、3Dアガロースペトリ皿の各井戸内に単一の大きくてコンパクトなクラスターを持つ最大のクラスターを生産しました。オルガノイドモデルがネイティブ組織に似ているかどうかを評価するために、生物学的構築物を細胞特異的マーカーについて調査し、免疫蛍光で視覚化した。2D ECMおよび3D ECMフリーの方法は精巣の区分の非常に模倣の内形学を有するオルガノイドを作り出した。
3D ECMフリーの集付オルガノイドに対して長期分析を行った。オルガノイドを14日間培養し、次いで細胞および構造特異的マーカーについて調査した。チューブ状構造が観察された。
3D ECMフリーオルガノイドは、ゴナドトロピン刺激を伴う12週間の培養で内分泌機能についても研究された。テストステロンとインヒビンBは、両方ともオルガノイド調整培地から定量化された。12週間後, ゴナドトロピンを除去しました 48 時間, テストステロンとインヒビン B 濃度が減少します。.
性腺刺激ホルモンが戻ったとき、両方のホルモン濃度が有意に増加し、適切な内分泌応答性を示す。オルガノイドアセンブリは、生存可能な未熟精巣細胞の自律的な行動を利用する。創造的な実験はカスタマイズされた細胞分類または雑種細胞混合物を使用して容易に考案することができる。
細胞播種後、ライブビデオイメージングまたはタイムラプスイメージングを使用して、オルガノイドの自己集合を定量化することができます。培養物全体、オルガノイドおよびコンディション培地を収集して、組織学的およびアミノアッセイ分析を行うことができます。
