著者は、静脈アクセスラインの配置を伴う外科手術を完了するため博士シルビアBカンポス-BilderbackとジョージJロードスに感謝したいと思います。彼らはまた、シモンセンとFrömter株の両方で構成されるミュンヘンのWistarコロニーを維持するためにサラE離乳に感謝したいと思います。

1。スルホ-ローダミン101スルホニルクロリド（テキサスレッド）へアルブミンラット血清の結合<ol><li> 50ミリリットルコニカルチューブ中の最終濃度15 mg / mlの、100mMの重炭酸ナトリウムのpHは9.0の6.667ミリリットルで（RSA）ラット血清アルブミン100mgを溶かす。 </li><li>場所の氷/水ビーカー内の溶液と0〜4℃の間にクール</li><li>テキサスレッド塩化スルホニル（TRSC）10mgのバイアルに高品質の無水ジメチルホルムアミド（DMF）を200μlを加え、15秒間媒体上渦。 </li><li>渦RSA媒体上の液と溶解TRSCを追加します。 </li><li>ホイルでラップ50ミリリットルコニカル（形成されたパラフィルムは、密封を確実にするために使用することができます）、水平方向のw /アイスのみと場所（気泡の形成を避ける）をゆっくりとソリューションを撹拌するためのロッカー上の氷のバケツに場所は、反応は0で継続することができますに4℃で1時間。 </li><li> 0.9％食塩水の5 Lを作成し、クリップ付きのいずれか）を透析膜することができます室カットオフ50 kDaの分子量、b）は、ジを濡らすフロート·アナライザ、またはc）のスライド·アナライザカセット（すべての非共役TRSCの除去に適しています）のようにalysisチューブ。 </li><li> 5 Lコンテナのw / 0.9％生理食塩水で透析室と所定の位置に置く反応混合物は、攪​​拌棒を用いて穏やかに撹拌しながら4℃で一晩透析する。 </li><li>ほとんどない色の変化で一晩インキュベーション結果（これは典型的には少なくとも4交換で〜48時間かかります）まで、午前中と夕方の5 Lの透析液を変更します。さらに、50 kDaでMWCOがRSA、66kDaの分子量に非常に近いことと、それは明確な解決策を生み出すことはありませんすることが可能であるが、これは膜の孔径に分布に依存することになる; 60時間と5交流がある十分な時間以上。 </li><li>測定量とTR-RSAの近似濃度を与えるようにボリュームで100ミリグラムの初期重量を分け、通常の濃度範囲10-13 mg / mlのから。最後の染料：アルブミン比は15,00あたり〜4時01分、1発蛍光団であるべきタンパク質MWの0ダルトン。 4℃で保存、発生する可能性があり、断片化を結果としては透磁率の値が変更されますように、TR-RSAソリューションを凍結しないでください。 </li></ol> 2。イメージング/顕微鏡セッティング用倒立顕微鏡ステージの準備<ol><li>場所〜完全に40ミリメートルのカバースリップ底（カバーガラスボトムディッシュ）で50ミリメートル皿の内側に互いに上に積層オートクレーブテープの4-7枚（約¾ &quot;長い）。これらは近いエッジのいずれかに配置する必要がありますので、それはテープの端は、腎臓の曲の端に接触することなく、客観的な光パス（ 図1Aおよび1B）をブロックしません。大きいラットは料理のテープとエッジの間に多くのスペースが必要になります。 </li><li> 50ミリメートル皿（ 図1A）と並んで、ステージ横にプレイス2 REPTI-サームパッド。ステージ上の温暖化ウォータージャケット毛布を置きます。 </li><li>客観的なタレットを保証することで画像を収集すると、10倍の空気Oを持っている時の効率を最大化R 20X（空気や水浸）客観的かつ定量のための画像を収集するために、より高い動力を与えられた水浸対物レンズ。 </li><li>撮像中の目標に水を追加するには、最も効率的な方法は、側にそれらを回転させ、目標のトップに到達することができますPE-200チューブの長い作品と1ccのシリンジを用いて水を追加することです。 </li><li>ソフトウェア上のNDフィルターを使用して〜15〜20％に10ワットレーザーの励起強度を設定します。ガリウム砒素リン非デスキャン検出器は、赤の排出量を収集するための緑の排出量、および625を収集するために750に設定されています。青色発光（例えば、核の染色ヘキスト33342など）は750から800の間で設定で標準nondescanned multialkaline検出器を使用して収集されます。 </li><li>ボーマン空間内で低強度の排出量の適切な回収を確保するため、検出器の下限値は、これらの値を除外しないように設定されていることを確認。ビジュアル警告マーカーは感度があれば表示されます設定が低すぎると、これらの値は、ゼロの強度値を与えられている。 </li><li> 1 CCの総容積を持ち出すために0.9％滅菌生理食塩水で希釈した蛍光アルブミン溶液の約5-8 MGと1ccのシリンジをロードします。 </li></ol> 3。生体内のためにミュンヘンのWistar系ラットにおける腎臓を露出する2光子イメージング<ol><li> Pentabarbitol（50 mg / mlの溶液を、120μl/100体重100g）、Inactin（130 mg / mlの溶液を、120μ/100グラム体重）、またはイソフルラン（5％誘導、1.5を使用して事前に麻酔をかけたラットで始まる留置静脈アクセス回線（どちら頚または大腿静脈）、とばかりにただ左大腿上記胸郭下から剃ら左脇腹、）2.5％保守まで。 </li><li>ように、その右側にフラットラットを置きその左、坊主側が上を向いている、その姿勢が伸長します（ 図前足がお互いに触れ、お互いとリアの足に触れて、うずくまっていないと、それは、テーブルの上に平らであることを確認してください2A）。 </LI&gt; <li>非常に軽く、それが自然に後腹膜内に産む場所を決定し、シャーピーを使って本体（胸郭から太ももまで）（ 図2A）に平行な直線を描画するために腎臓を感じるように触診。 </li><li>歯ピンセットで皮膚をピックアップし、組織をつぶすと出血を防ぐために、止血のペアを使用して描かれた線に沿って皮膚をつまむ。手術用はさみのペアを使用して切開に沿ってカットします。カットする前に外側の皮膚と筋肉の層を破砕すると劇的に削減し、一般的に出血がなくなります。 </li><li>薄くて外側の筋肉層、について、この手順を繰り返します。 </li><li>腹膜を公開します内側の筋肉層、切開の場合は、大きさを推定するために腎臓を再度触診。腎臓より小さい切開ラインをつまんで、切開を保証するだけで、腎臓の上にある。この切開があまりに小さく、必要に応じて、それを大きくすることをお勧めします。これは大きすぎるなされた場合は、縫合が必要となる。この最後の切開が重要であり、あまりにも遠く任意の方向に経由すると、ステージ上の安定性に影響を与え、呼吸からモーションアーチファクトのいずれかを誘発する（ベストケースシナリオ）や腎茎を伸ばすに悪影響腎灌流を（最悪の場合）削減されます。 </li><li>腎臓の位置を確認します（ 図2（b）に示すように）とグリップピンセットを用いて周囲の脂肪、手のファッションの上に手に腎臓の下極に向けて取り組んでいます。 </li><li>腎臓の下極に到達すると、非常に静かに体外に出すために腎臓の下に絞りながら、優しく切開を通して腎臓を引き出します。切開が小さすぎると、筋層を粉砕し、それを広げるためにカット、腎臓を露出させるための手順を繰り返す。 </li></ol> 4。イメージングのために、ステージ上のミュンヘンのWistarラットを配置<ol><li>腎臓とカバースリップの皿の端の方に腎臓を置き、わずかに、ラットの背側（背面側）に向かって回転させ、腎臓の腹側ので、私sがカバーガラスボトムディッシュ（ 図1A）と接触する。お皿に温め、無菌の09％食塩水を追加します。 </li><li> 10倍または20倍客観的に目を通すと、動きを確認してください。動きが検出された場合は胸部が遠くカバーガラスボトムディッシュからですので、少し上のラットを転がし、腎臓などの腎茎（ 図1B）を伸ばすことなく、お皿の端に近いことを確認してください。 </li></ol> 5。アルブミンの腎透過を定量化するために画像を取得<ol><li>糸球体透過性（Glomeruluarふるい係数; GSC）を計算する任意の高分子のことは事前の蛍光分子の注入への個々の糸球体の基準背景画像を撮影する必要があります。あなたの顕微鏡はマーキング位置が可能な電動ステージが装備されている場合は、検索および低電力対物レンズを用いて個々の糸球体の中心と、それぞれの場所をマーク。デュアルパスフルオレセイン/ローダミン落射蛍光FILどちらエミッションフィルタは（位相コントラストや照明の他の非蛍光源は動作しません）動作しますが、ターは、この手順のために理想的です。糸球体は、デュアルローパスフィルタを通して見たときに特有の黄橙色autoflourescenceを持つ近位尿細管に囲まれた空の円形の構造として表示されます。 </li><li>あなたの顕微鏡は電動ステージを持っていない場合は、低消費電力を目的としたラスタパターンで腎臓をスキャンして、個々の糸球体がどこにあるかの初歩的なマップを作ること、そのような腎カプセルの上にある大規模な表在血管のような自然なランドマークに頼るまたは脂肪パッチ。 </li><li>高電力、水浸対物レンズにタレットを切り替えて毛細血管ループやボーマン空間がはっきりと見えることを確認し、それぞれの糸球体の3Dデータセットを取る。擬似カラーパレット（B / W以外のもの）を使用すると、これらの構造を視覚化するのに役立ちます。 </li><li>表在血管の中を当て、ゆっくりとTで吹き込む彼は、蛍光アルブミン意思確認時間は全身分布を可能にするために与えられている。低GSCを有する分子のためには、プラズマ中の強度値を最大化することではなく、顕微鏡の光検出器を飽和させるレベルに到達しないことが不可欠である。これは、フィルタリングされた分子の検出能を向上させます。注：時間の間に5-7秒経過は通常存在する蛍光アルブミンは、それが画面に表示されます（約1コマ/秒でフルフレームを取得する）時に導入される。 </li><li>約10分はアルブミンGSCの計算に使用される1ミクロン間隔で3Dボリュームを獲得する前にクリアして、潜在的な小分子量のフラグメントを許可することができます。一般的には、ミュンヘンのWistarラットのシモンセンの株がはるかに少ない表面糸球体があり、視覚化することができることすべてを撮像し、定量化されているそう。 Frömter株は、我々は〜10に定量数を制限するように、はるかに大きな数を持っています。 </li><li>研究の終わりに、ラットをanesthetの過剰摂取を介して安楽死させているicが研究に使用した。デュアルpneumothoracotamyは安楽死を保証するために行われる。 </li></ol> 6。 3Dボリュームから蛍光アルブミンための計算GSC <ol><li>各糸球体用の3Dデータセットをロード変形者の画像処理ソフトウェアを用いて、両方の背景セットと蛍光アルブミンの注入後に撮影セット。 </li><li>その定義されたマージンとボーマン嚢の端の間に十分なスペースが空きスペースとの表面的な毛細血管ループを見つけ蛍光アルブミンを含むボリュームで。 </li><li>背景ボリュームにアルブミンを含む画像のすべての視覚的な手がかりが含まれている必要があり、同じ焦点面を探します。関心の毛管ループ内の領域を選択し、平均強度の読みに注意してください。次にボーマン空間内の領域を選択し、平均強度の読みに注意してください。これらは、バックグラウンド値として使用される。 </li><li>定量のために、アルブミンのCボーマン空間内類似領域を選択画像をontaining。ボーマン空間内の平均強度の平均値を取るために、少なくとも2つの他の地域のためにこれを行います。 </li><li>明るいプラズマ強度と毛細血管のループを選択し、周囲の領域を描画します。閾値関数を使用して、次の、RBCのを循環している暗い縞を回避、循環血漿内明るい値を強調。選択されたプラズマ空間の平均強度値に注意してください。血中の要因が唯一の原因と血漿蛍光レベルの過小評価するのに役立つでしょうので、それは優先的にプラズマの明るい部分を選択することが重要である。 </li><li> Microsoft ExcelスプレッドシートがどこGSCを計算するために値を入力します使用： </li></ol><img alt="図1" fo:content-width="2.95in" fo:src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1.jpg" />

<ol>
	<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+kidney+filters+nephritic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells;+retrieval+is+disrupted+in+nephritic+states.">The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states.</a> Kidney International. 71, 504 (2007).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy.">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489 (2009).</li><li>Sandoval, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+influence+glomerular+albumin+permeability+in+rats.">Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447 (2012).</li><li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique.">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263, 601 (1992).</li><li>Asgeirsson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+sieving+of+three+neutral+polysaccharides,+polyethylene+oxide+and+bikunin+in+rat:+Effects+of+molecular+size+and+conformation.">Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation.</a> Acta Physiologica. 191 (3), 237 (2007).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+endocytosis+in+vivo+using+intravital+two-photon+microscopy.">Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multi-photon+microscopy.">Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

手順はここで我々は、彼らが次の落とし穴を回避するため、一貫性のある正確な透過性値が生成されたものであると感じるものを表す強調： <ol><li>散乱：長い波長の光子が散乱しにくい傾向があるので、赤色発光蛍光体の使用は、光をより効率的に回収を可能にする。どちら緑色または青色発光蛍光団を使用するので、毛細血管ループとボーマン空間3からの強度値の増加変動GSC年...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope</td>
 <td>Olympus America</td>
 <td></td>
 <td>Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser</td>
 <td>Spectra-Physics</td>
 <td></td>
 <td>Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gallium arsenide phosphide photodetectors</td>
 <td>Hamamatsu Corp</td>
 <td></td>
 <td>Note: Front or Side mounted configurations available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metamorph Image processing Software</td>
 <td>Molecular Dynamics</td>
 <td></td>
 <td>Note: Version 6.1r1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsoft Excel</td>
 <td>Microsoft Corportation</td>
 <td></td>
 <td>2007 version</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Handling Forceps</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78266-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mayo Dissecting Scissors</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72962</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CA Micro scissors Model 1C300</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78180-1C3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kelly Hemostatic Forceps (straight)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72930</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water Jacket Blanket + Heating Pad</td>
 <td>Gaymar</td>
 <td></td>
 <td>T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repti-Therm Under Tank Heater</td>
 <td>ZooMed</td>
 <td></td>
 <td>RH-4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Texas Red Sulfonyl Chloride</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>Cat# T-353</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat Serum Albumin</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# A-6272</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High Quality Anhydrous DMF</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# 270547</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Strate-Line Autoclave Tape</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>Cat# 11-889-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 70665-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in munich wistar rats

例えば、血清アルブミンなどの大型不可欠巨大分子の尿中損失を伴う腎疾患は、長い足細胞、血管内皮細胞、および一斉に作業基底膜からなる透過バリアの変化によって引き起こされると考えられてきた。生体2光子顕微鏡を用いた我々の研究室からのデータは、フィルタアルブミンの取得は、近位尿細管細胞（PTC）1,2、と呼ばれる細胞の初期のサブセットに生じると、以前に生理的条件下では考えられていたよりも透過性の糸球体濾過障壁（GFB）を明らかにした3。 腎臓のろ ​​過および流体内容と分析4のサンプリングでこれらの初期の管状セグメントの内腔の微小穿刺を関与ろ過障壁の特性を確立することを研究するために使用前のテクニック。密接に対応し、これらの研究は事実上存在しないことを腔液のアルブミン濃度を決定する通常は尿中に検出されるものである。しかし、この技術によって定義されたサイズを有するデキストランポリマーの特徴付けは、血清アルブミンと同様のサイズのものを明らかにした管状の管腔および尿中のより高いレベルを持っていた。透過性の増大5を示唆している。 ここでは、直接生体内での糸球体蛍光アルブミン透過性を可視化し、定量化するために使用される技術の詳細な概要です。この方法は、ボーマンスペース（尿ろ過の初期室）にろ過関門フィルタリングアルブミンの検出を可能に、そしてまた近位尿細管およびその後アルブミントランス6の可視化により、アルブミン再吸収の定量が可能になります。膀胱への途中後で管状セグメントに沿って蛍光アルブミンが存​​在しないことは、以前の近位尿細管セグメントにおける検索経路の効率を強調しています。さらに、この技術を適用したときの浸透性を決定するアルブミン実質的に同一の透過性値に類似した大きさを有するデキストランの2を報告した。これらの観​​察結果は、直接、近位尿細管細胞の埋め立てに含まれる改変には多くの蛋白尿腎疾患の焦点を拡大する必要性をサポートしています。

図3は、ミュンヘンウィスター系ラットFrömterと蛍光アルブミンの浸透性を決定するために取られるステップの表面の糸球体から撮影画像の一例を示す図である。ミュンヘンWistarラットとき飼育条件3でのこの株で見られる範囲内で、この個々の糸球体の落下に対して導出0.0111のアルブミンためGSC値。これらのイメージで見られる安定性は、慎重な計画と、図1および?...

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Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

技術が直接表面糸球体でgloemrularろ過を視覚化し、定量化するために、高解像度intavital 2光子顕微鏡を用いた。このメソッドは、正常および病的両方の状態における高分子の透磁率特性を直接測定することができます。

ミュンヘンWistar系ラットにおける2光子顕微鏡を用いた蛍光高分子の糸球体透過性を定量化

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

quantifying-glomerular-permeability-fluorescent-macromolecules-using

Research

JoVE Journal

Medicine

10.4K ビュー.  Indiana University School of Medicine. 技術が直接表面糸球体でgloemrularろ過を視覚化し、定量化するために、高解像度intavital 2光子顕微鏡を用いた。このメソッドは、正常および病的両方の状態における高分子の透磁率特性を直接測定することができます。

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Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

LEPR<sup&gt; DB</sup&gt; 2型糖尿病のマウスモデル：無傷の膵島の膵島単離およびライブセル2光子イメージング

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

医学

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

腫瘍関連血管系を使用しての生体顕微鏡が背高度な蛍光トランスジェニック マウスの皮下脂肪のウィンドウの部屋

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

加速度計を使用して日常生活に上肢のパフォーマンスを定量化する方法

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&#232;re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this patient group but has yet to be confirmed. This protocol describes a method of in vivo evaluation of neural changes especially well suitable for cranial nerve analysis using magnetic resonance imaging (MRI). MD-patients and normal hearing persons were examined in a 3-T MR-scanner using a scan protocol including strongly T2-weighted 3D gradient-echo-sequence (3D-CISS). In the patient group, MD was additionally confirmed using MRI-based assessment of endolymphatic hydrops. Morphometric analysis was performed using a freeware DICOM viewer. Evaluation of cranial nerves included measurements of cross-sectional areas (CSAs) of the nerves at different levels as well as orthogonal diametric measurements.

&lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&amp;#232;re&#039;s Disease Ears and Normal Hearing Ears

To evaluate morphological changes of cranial nerves such as loss of neural structures or swelling of cranial nerves in Meni&#232;re&#39;s Disease (MD) or in healthy persons in vivo, a protocol of evaluation has been developed using magnetic resonance imaging (MRI). Additional MRI-based confirmation of MD was performed.

生体内でMenière の病気耳と健聴耳の磁気共鳴イメージ投射を使用して人間の脳神経の形態計測的解析

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

糸球体疾患のマウス ・ モデルにおける腎機能の評価

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

マウスにおける糸球体濾過率の経皮吸収測定

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the glomerulus and reabsorbed in the tubular system up until the absorption limit is reached. Early increases in pathological albumin filtration may, thus, be missed by analyzing albuminuria. Therefore, the use of tracers to test glomerular permselectivity appears advantageous. Fluorescently labeled tracer fluorescein isothiocyanate (FITC)-polysucrose (i.e., FITC-Ficoll), can be used to study glomerular permselectivity. FITC-polysucrose molecules are freely filtered by the glomerulus but not reabsorbed in the tubular system. In mice and rats, FITC-polysucrose has been investigated in models of glomerular permeability by using technically complex procedures (i.e., radioactive measurements, high-performance liquid chromatography [HPLC], gel filtration). We have modified and facilitated a FITC-polysucrose tracer-based protocol to test early and small increases in glomerular permeability to FITC-polysucrose 70 (size of albumin) in mice. This method allows repetitive urine analyses with small urine volumes (5 &#181;L). This protocol contains information on how the tracer FITC-polysucrose 70 is applied intravenously and urine is collected via a simple urinary catheter. Urine is analyzed via a fluorescence plate reader and normalized to a urine concentration marker (creatinine), thereby avoiding technically complex procedures.

Here, we present a protocol to test glomerular permeability in mice using a highly sensitive, nonradioactive tracer. This method allows repetitive urine analyses with small urine volumes.

フルオレセインイソチオシアネート-ポリスクロースを用いたマウスにおける糸球透過性の高感度測定 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

マウスの洞房結節と房室結節のホールマウント免疫蛍光染色、共焦点イメージング、3D再構成

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

マウス洞房・房室結節からの常在型心臓マクロファージの単離と培養

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ineffective in many patients. To improve patient care, novel and innovative therapeutic concepts causally targeting arrhythmia mechanisms are needed. To study the complex pathophysiology of arrhythmias, suitable animal models are necessary, and mice have been proven to be ideal model species to evaluate the genetic impact on arrhythmias, to investigate fundamental molecular and cellular mechanisms, and to identify potential therapeutic targets.
Implantable telemetry devices are among the most powerful tools available to study electrophysiology in mice, allowing continuous ECG recording over a period of several months in freely moving, awake mice. However, due to the huge number of data points (&gt;1 million QRS complexes per day), analysis of telemetry data remains challenging. This article describes a step-by-step approach to analyze ECGs and to detect arrhythmias in long-term telemetry recordings using the software, Ponemah, with its analysis modules, ECG Pro and Data Insights, developed by Data Sciences International (DSI). To analyze basic ECG parameters, such as heart rate, P wave duration, PR interval, QRS interval, or QT duration, an automated attribute analysis was performed using Ponemah to identify P, Q, and T waves within individually adjusted windows around detected R waves. 
Results were then manually reviewed, allowing adjustment of individual annotations. The output from the attribute-based analysis and the pattern recognition analysis was then used by the Data Insights module to detect arrhythmias. This module allows an automatic screening for individually defined arrhythmias within the recording, followed by a manual review of suspected arrhythmia episodes. The article briefly discusses challenges in recording and detecting ECG signals, suggests strategies to improve data quality, and provides representative recordings of arrhythmias detected in mice using the approach described above.

Here we present a step-by-step protocol for a semiautomated approach to analyze murine long-term electrocardiography (ECG) data for basic ECG parameters and common arrhythmias. Data are obtained by implantable telemetry transmitters in living and awake mice and analyzed using Ponemah and its analysis modules.

マウスの不整脈を検出するための長期心電図記録の分析

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...