質量感受性粒子追跡により、脂質膜上で拡散している個々の生体分子を観察し、そのダイナミクスをリアルタイムで定量化することができ、すべて完全に標識されていません。標識が不要なため、生体分子の動的挙動を乱す危険性はありません。この方法のもう1つの利点は、その質量感受性であり、膜結合オリゴマー状態を決定することを可能にする。
その汎用性のために、我々は、任意の膜関連システムにこの方法を適用することができます。特に、リガンド誘導性受容体複合体の形成を研究するために使用することができる。まず、PTFEホルダーに同数の顕微鏡スライドを配布します。
PTFEホルダーをビーカーに移します。超純水を加え、室温で15分間超音波処理する。ピンセットを使用してホルダーをビーカーに移し、超高純度イソプロパノールを追加します。
15分間再び超音波処理し、次いで再びイソプロパノールを超純水と交換し、ホルダーを含むビーカーを15分間超音波処理する。ビーカーからホルダーを取り外し、窒素ガスまたは圧縮空気の安定した流れの下でホルダー内の顕微鏡スライドを吹き飛ばして乾燥させます。大型顕微鏡スライドの入った乾燥ホルダーをプラズマクリーナーに入れ、スイッチを入れます。
平らな段ボールをアルミホイルで包みます。洗浄した24ミリメートルを24ミリメートルの顕微鏡スライドで広げ、互いに十分な距離を置いてアルミ箔上にスライドさせる。次に、スライドの上端と下端に両面テープストリップを取り付けます。
各顕微鏡スライドをメスで切り取り、アルミホイルから取り外せるようにします。各スライドには、スライドの上端と下端に両面テープのストライプを貼り付ける必要があります。次に、2 枚の両面テープストリップでスライドを親水化スライドに取り付けます。
これにより、小さい顕微鏡スライドと大きい顕微鏡スライドの間に流路が形成されます。新しく押し出された小さな単層小胞またはSUVを、必要な反応緩衝液中で1ミリリットル当たり0.4ミリグラムの最終濃度に希釈する。任意選択で、小胞破裂を促進するために、2ミリモルの塩化カルシウムを小胞懸濁液に加える。
流量チャンバーを質量光度計ステージに取り付けます。25マイクロリットルのベシクル懸濁液を流チャンバに流し、チャンバを2分間インキュベートし、次いで、毎回200マイクロリットルの反応緩衝液によるフローチャンバの繰り返し洗浄を通して未融合ベシクルを除去する。脂質膜に未融合小胞がなくなったら、50マイクロリットルの目的タンパク質をサンプルチャンバーに加える。
次に、視野の大きさ、露光時間、フレームレート、取得時間などの撮影条件を集録ソフトウェアで設定します。フォーカスを自動的に調整します。必要に応じて、横方向制御を使用して、視野を均質な膜のある位置に移動します。
プロジェクトフォルダを作成し、ムービーの録画を開始します。録音が完了したら、集録ソフトウェアからプロンプトが表示されるダイアログでファイル名を指定します。ムービーは、その後の解析のためにMPファイルとしてプロジェクトフォルダに自動的に保存されます。
録画したビデオを分析するには、Jupyter ノートブック アプリを起動します。表示されるフォルダ リストで、MSPT 分析を行う場所に移動します。ipyノートブックファイルが保存され、ファイルをクリックします。
Jupyter ノートブックでは、コードはセルに編成され、段階的に実行できます。セルの横にある小さな再生ボタンをクリックするか、セルを選択してShift Enter キーを押してセルを実行します。まず、分析に必要なすべてのパッケージをインポートします。
次のセルを実行して、ファイルプロンプトを起動します。分析する1つまたは複数のMPビデオファイルを含むフォルダを選択し、[フォルダの選択]を押します。選択したファイルのリストがセルの下に印刷されます。
ピクセル単位の背景推定アルゴリズムで光の支配的な静的散乱を除去するには、パラメータモードの連続中央値オプションを選択し、スライド中央値ウィンドウに適切な長さを設定します。必要に応じて、背景を削除した後、save_processed_movies True に設定してムービーを保存し、パーティクル検出と軌道リンクに使用します。CPU での処理の場合は並列 True と GPU False を、GPU での処理の場合はその逆を設定してください。
パーティクルとそのそれぞれの位置は、ムービー全体で識別され、ローカライズされます。画像の二値化によって候補スポットを強調表示するために使用されるしきい値パラメータを使用して、粒子検出の感度を調整します。スポット検出感度に対するしきい値パラメーターの変化の影響を、ムービー ビジュアライゼーションと呼ばれる別のノートブックで調べます。
ipyノートブック。ムービーをフレームビューアにロードしたら、しきい値スライダーを使用して粒子検出しきい値を調整し、適切な設定を見つけます。他のノートブックに戻り、Python パッケージのトラックピーを使用して、連続するフレーム内のパーティクルを軌道にリンクするための 3 つのパラメーターを選択します。
予想される最大拡散速度に従って、あるフレームから次のフレームへのパーティクルの最大変位を設定します。パーティクルが消えて再表示されるフレームの最大数を選択しますが、それでも同じパーティクルと見なされます。点が少なすぎる軌道は、拡散係数をよりロバストに決定するために、パラメータminimum_trajectory_lengthを使用して削除できます。
セル内のすべてのパラメータを実行して修正します。次のセルを実行して、選択したすべてのビデオを選択したパラメータで分析します。各処理ステップの進行状況バーがセルの下に表示されます。
ビデオの長さ、パラメータ設定、ハードウェアによっては、この処理に時間がかかることがあります。次のステップでは、ジャンプ距離分布と平均二乗変位解析の両方に基づいて、前のセクションで見つかった軌道の拡散係数が決定されます。まず、ムービーのframe_rateとpixel_sizeを指定します。
セルを実行して修正し、次のセルを実行して、trackpyによって生成されたすべてのCSVファイルを含む親ディレクトリを選択します。見つかったCSVファイルのリストがセルの下に印刷されます。次のセルで、結果が保存されているHDF5コンテナの名前を選択して実行します。
最後にセルC.4を実行し、拡散解析を行う。セルC.5では、既知の質量のサンプルを使用して決定された傾きとオフセットを意味する質量較正線パラメータへのコントラストを入力し、それを実行してすべての粒子コントラストを分子量に変換します。セル C.6 を実行して、膜上の見かけの粒子密度を評価し、検出された粒子と各フレーム間の現在の軌跡に関する中央値の値をデータ フレーム内の追加の列として返します。
質量係数と拡散係数の相関関係の最終プロットを生成するには、セル D.1 を実行してファイル プロンプトを読み込み、MSPT 結果を含む HDF5 ファイルを指定してから、1 つのビデオからデータ セットを選択してセル D.2 にプロットするか、セル D.3 を実行して複数のビデオのデータを 1 つのデータ フレームに結合します。この例では、すべてのビデオが同じサンプルの複製であるため、データセットはプールされます。最後に、セルD.4を実行して2Dカーネル密度をプロットします。
これで問題が解決しない場合は、プロットをセル D.5 の PDF ファイルに保存する場所を指定して実行します。インタクトな支持脂質二重層を有する、支持された脂質二重層の形成中のガラスカバースライドの表面粗さの代表的な画像、およびSLB上で再構成された例示的なタンパク質の代表的な画像がここに示されている。4つの例はすべてネイティブモードで表示され、測定自体の間にアクセスでき、中央値ベースの背景除去後に処理されたレシオメトリック画像として表示されます。
コントラストを分子質量に変換する較正は、ビオチン - ストレプトアビジン - ビオチン複合体を介して既知の質量の生体分子をSLBに結合させることによって達成することができる。例示的な戦略として、それ自体が膜中のビオチン含有脂質に結合しているストレプトアビジンに結合するウシ血清アルブミン、プロテインA、アルカリホスファターゼ、およびフィブロネクチンのビオチン化変異体を使用することができる。これらの例示的な巨大分子のますます顕著なコントラストは、それぞれのビオチン化標準物質の分子量の増加を反映している。
コントラストヒストグラムの各ピークを標準タンパク質のオリゴマー状態の対応する質量に割り当てることにより、コントラストと質量の線形関係が明らかになり、その後、未知の巨大分子系の解析に使用することができる。ビオチン化アルドラーゼまたはビオチン修飾ヤギ抗ウサギIgG抗体との複合体における4価ストレプトアビジンの質量および拡散係数の両方の2Dカーネル密度推定をここに示す。代表的な画像は、ビオチン修飾アルドラーゼまたはIgGとの4価ストレプトアビジンの複合体について決定されたオリゴマー質量および予想される分子量の比較を示す。
MSPTを使用すると、生体分子を脂質膜上で直接追跡し、それらがどの質量を持ち、どのように動き、どのように相互作用するかを決定できます。この技術が、膜上および膜を用いた生物学的プロセスの理解を変えると確信しています。
