全ての実験は、パーデュー大学の動物実験委員会とパデュー大学実験動物プログラムの監督の下で行われた。 この作品は、を介して、信頼性の高いニューラル技術プログラムの一環として、博士ジャック·W·ジュディ（jack.judy @ darpa.mil）の後援の下に、米国防総省の国防高等研究計画庁（DARPA）のマイクロシステム技術事務所（MTO）が主催したスペースと海上戦システムコマンド（SPAWAR）システムセンター（SSC）の太平洋助成金番号N66001-11-1から4013まで。 著者らは、これらの顕微鏡の専門知識を共有するためのミハイルSlipchenko、ドン·レディ、グレッグ·リヒター、アーロンテイラー、ケビンEliceiriに感謝したいと思います。

<ol>
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著者は、金融やそれ以外の場合、宣言する関連する開示を持ちません。

ここで示した &quot;デバイスキャプチャ組織学&quot;（DCHist）メソッドは、脳組織および組織形態学的にインプラント間の相互作用の維持に近い組織学的評価が可能になります。 DCHistの組織採取は、脳に移植したコンポーネントから頭蓋骨にマウントされたデバイスコンポーネントを慎重に分離する必要があります。 DCHistも厚い組織学的組織切片（&gt; 250μm）のコレクションを必要とします。これらの組織切片は、一度、標識されたクリアされ、搭載され、画像化され、注入傷害またはデバイス留置後に慢性的な応答に新たな洞察を提供することができます。 図3-5で示されるように、高度な顕微鏡検査ツールを使用して、組織とデバイス間のインターフェイスは、高詳細に画像化し、分析することができます。 彼らの現在の形で紹介する手法は、ゆっくりと注入装置のポイントは2つの部分から成る歯科用セメントとクイック·ジンシルから作らheadcapを離れ発掘する能力に依存しています。離れて燃焼またはそうでなければ削除することができます歯科用セメントと小さなハサミが視覚的に非常に正常にその頭蓋骨実装部品から移植された装置を分離するのに役立つと導くことができるそれを通して明確なシリコンエラストマーを利用。頭蓋骨にマウントされたインプラントは、脳のかなりの量を引き出されるように、その場でそれを収集するために、頭蓋骨の下に、脳上記デバイスを切断しようとすると、推奨されません。 そのようなNeuroNexus TechnologiesからシングルシャンクのMEAとしてシンナー、小さなインプラントは、DCHistに最も適していますが、原則は、シングル·デバイス·シャンクまたは微小電極アレイに限定されません。コレクションおよびイメージング戦略は要件がそれらがどんな頭蓋骨マウントから分離し、厚い組織切片内で収集しなければならないことであることと、マルチシャンクデバイスやカニューレなどの大型インプラントに広く適用されています。著者は、組織の分析に焦点を当てていますが周囲の皮質インプラントは、脳の奥深くに駆動装置はまた、収集され、画像化される可能性があります。インプラント挿入の深さは、挿入の既知の角度から激しく逸脱していないデバイスを提供してスライスにインプラントの取り込みに影響を与えるべきではない。 制限はDCHist法の有用なアプリケーションに存在しています。光学決済ソリューションが大幅に様々な組織21の撮像深度を向上させることができますが、脳組織切片は、特に白質の分野で、数百マイクロメートルを介して画像に挑戦しています。さらに撮像深度を向上させるために、2光子励起顕微鏡を説明した光クリアと一緒に使用することができる。 記載された方法のもう一つの潜在的な制限は、研究者によって使用される特定の蛍光免疫組織化学法と抗体であり得る。受動拡散は、典型的には、固定組織を介してこれらのマーカーの取り込みを駆動および抗原結合部位へ。最終抗体作業濃度が背景標識の高いレベルを回避しながら、ラベルの普及率を最大化するために、ケースバイケースでの研究者によって決定されなければならない。抗体標識は、同じように処理されるスライス間の変数であってはならないが、別の抗体は、いくつかの抗体が容易に抗原をマイクロメートルの唯一の数十が深い抗原を標識する多くの深い、数百マイクロメートルと他人をラベリングして、それらの抗原を貫通してタグ付けする能力が大幅に異なる場合があります。我々は、アプリケーションの複数日間、および希薄洗剤とブロッキング血清を含有する溶液中で、典型的な濃度よりも高い抗体でラベルを適用することによって、この拡散を改善について説明します。定期的にスライスをひっくり返すこともあってもラベリングを推進しています。抗原賦活手順や代替固定プロセス（ 例えばグルタルアルデヒド、電子レンジなど）は、特定の抗原に対して適切であるかもしれません。二次抗体-fluorochローマコンジュゲートはまた、これはInvitrogenからのAlexa Fluorラベルを使用して執筆者によって観察されていませんが、厚い部分にラベルを付ける彼らのパフォーマンスは異なる場合があります。あるいは、目的の細胞型で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック動物の被験者は、抗体のラベルの浸透の問題を回避するために利用することができるようeGFPのような多くの蛍光タンパク質として、ホルムアルデヒド処理した後、その蛍光を保持し、組織切片での即時視覚化することができる。 DCHistは、脳組織に注入されたマイクロデバイスの影響をキャプチャし、分析するための技術の強力なセットです。電気の質と電極インピーダンスデータの in vivo評価22 で 、この組織学的プロトコルを結合することにより、大幅に生理の変動や劣化の生物学的起源についての我々の理解を向上させることができます。特に移植神経補装具の分野には、詳細なDCHist IMAの恩恵を受ける可能性があり生物学的に中性のMEA機器の更なる発展を知らせるために無傷デバイス/組織界面の変更する。

neuroprosthetic研究の分野では、デバイス1,2をインターフェースCNSを通じて体内に罹患または損傷した構造をバイパスすることにより、様々な障害や疾患を患っている人を支援することを目指しています。このような微小電極アレイ（MEAの）などの脳注入マイクロデバイスは、記録または刺激する脳の構造を、したがってエレクトロニクスおよびCNS組織3から5の間に長期的なインタフェースの構築を可能にするために使用することができます。貫 ​​通MEAS、脳組織に追い込まれているデバイスは、彼らが近くのニューロン6の比較的小さいセットに電極を提示し、その中に近接のための双方向インターフェイスとして特定の約束を保持する。 しかし、貫通MEAの長期注入から複雑な組織応答の結果は、多くの場合、数日から数カ月にわたって変数と徐々に分解する電気生理学的信号対雑音比で、その結果、および電気インピーダンスの増加電極部位とグランドの間に7,8インピーダンス。これらの変化の推定上の起源は、ミクログリアの活性化、マイクロデバイスに沿って反応性星状細胞、及び移植デバイス9月11日に周囲の組織から神経細胞の損失または移行が含まれています。慢性的、浸透MEAの周りこれらの組織変化を理解するための主要な課題は、慢性的に注入されたデバイス12を取り囲む無傷組織界面の組織学的データをキャプチャすることが困難であることである。デバイス/組織界面で組織の組織学的分析は依然として存在し、現在のデバイス取り外し学的プロトコルによって改善するであろう。組織に邪魔されずに残っているデバイスでは、このような生体適合性コーティング13,14または電極表面15,16の電気的清算の活用など、比較的微妙な相互作用、生物学的影響は、画像化することができ、インプラントに関して分析した。 HERE我々は、収集する方法、プロセス、および画像周囲の脳組織の詳細な顕微鏡ベースの分析のために無傷マイクロデバイス·インターフェースを示しています。この方法では、デバイスとその周辺の脳組織をビブラトームを用いて厚さ（&gt; 250μm）で組織切片内で収集されます。これらの厚いスライスに組織学的ラベルの浸透を改善するために、蛍光組織化学的および免疫組織化学のラベルが複数日のブロッキング血清および界面活性剤を含有する溶液中に高濃度で適用されます。光学決済ソリューションは、顕微鏡イメージング深度を向上させるために採用され、組織は共焦点顕微鏡17をスキャンし 、その後のレーザー用両面室に搭載されている。完全な組織学的インタフェースをキャプチャするには、コンピュータ制御された並進ステージは、インプラントの長さに沿ってzスタックパノラマを収集するために、撮像時に使用されます。イメージングに加え、インプラントから戻っレーザ反射率を集め、組織のラベルを適用と組織の両方の助けを介して透過光は、周囲の組織との関係でデバイスインターフェイスをローカライズします。組織が ​​この&quot;デバイスキャプチャ組織学&quot;を用いて調製し（DCHist）プロトコルは、形態学的に保存された組織/デバイスの相互作用のイメージングのアクセスを提供し、その結果以前のデバイス取り外し学的プロトコル18を改良したものです。

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> 試薬 </td></tr><tr><td>ヘキスト33342 </td><td>インビトロジェン</td><td> 14533 </td><td> DNAマーカー</td></tr><tr><td>ウサギ抗Iba1 </td><td>和光市（日本） </td><td> 019から19741 </td><td>単球抗体</td></tr><tr><td>歯科アクリル</td><td>ラング歯科（様々な代理店） </td><td>ジェット義歯修理パウダー＆リキッド</td><td> Headcap建設</td></tr><tr><td>クイック·シル</td><td>ワールド·精密機器</td><td> KWIK-SIL </td><td>露出した頭蓋インプラントをカバー</td></tr><tr><td>正常ヤギ血清</td><td>ジャクソンイムノリサーチ</td><td> 005-000-121 </td><td>組織処理</td></tr><tr><td>トリトンX-100 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> X100-500ミリリットル</td><td>組織処理</td></tr><tr><td>尿素</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> U4883 </td><td>ソリューションをクリア</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> G20225 </td><td>ソリューションをクリア</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 機器 </td></tr><tr><td>湾曲したマイクロ剪刀</td><td>ワールド·精密機器</td><td> 14208 </td><td>脳を取り外す前に、インプラントを切断</td></tr><tr><td>剃刀の刃</td><td>テッドペラ</td><td> （各種サイズ） </td><td>脳のブロックを使用するため</td></tr><tr><td>アクリル脳Matrice </td><td>テッドペラ</td><td> 15054 </td><td>組織における初期平面を作成するための脳のブロック</td></tr><tr><td>プラスチック製のスライド</td><td>テッドペラ</td><td> 260225 </td><td>取付組織</td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>テッドペラ</td><td> （各種サイズ） </td><td>取付組織</td></tr><tr><td>電極アレイ</td><td> NeuroNexusテクノロジーズ</td><td> （様々なデザイン） </td><td>例のMEA </td></tr><tr><td>ビブラトーム</td><td>ライカ</td><td> VT1000のS </td><td>提示された方法で使用される特定のシステム</td></tr><tr><td>ビブラトームブレード</td><td> （様々なサプライヤー） </td><td></td><td>スライスを収集</td></tr><tr><td> 24ウェルプレート</td><td> （様々なサプライヤー） </td><td></td><td>組織切片の保存と処理</td></tr><tr><td>電動XYスキャニングステージと共焦点顕微鏡</td><td>カールツァイス顕微鏡</td><td>ツァイスLSM 710および &#39;禅2010&#39;ソフトウェア</td><td>提示された方法で使用される特定のシステム</td></tr><tr><td>はんだごて</td><td> （様々なサプライヤー） </td><td></td><td> headcapを掘る</td></tr></tbody></table>

intact histological characterization of brain-implanted microdevices and surrounding tissue

このような微小電極アレイとして脳注入マイクロデバイスの設計と利用の研究は、脳組織を周囲の慢性的インターフェースの臨床的に関連するデバイスを製造することを目指しています。これらのインプラント周囲の組織は、デバイスの周囲の絶縁 &quot;グリア性瘢痕&quot;の形成を含む時間を超えるデバイスの存在に反応すると考えられている。しかし、これらの組織変化の組織学的分析は、一般的に関心の組織の形態を混乱させることができるプロセスでは、デバイスをexplanting後に実行されます。 ここでは、皮質の注入装置は、げっ歯類の脳組織を取り巻く内にそのまま収集されているプロトコルを示しています。我々は一度固定液で灌流方法、説明し、脳をexplantingデバイスを回避するような方法で除去し、スライスされています。我々は有益な、まだ厚い組織を製造するために有用な蛍光抗体標識と光決済方法を概説セクション。最後に、我々は脳注入装置周辺の生体界面を調べるために、これらの組織切片のマウントおよびイメージングを実証している。

脳移植MEAは、第一の脳に埋め込 ​​まれたコンポーネントから任意の頭蓋骨実装部品を分離することにより、組織切片に収集することができます。 図2aは、歯科用セメントheadcapとMEAケーブルを取り巻くクイック·シルの部分の片側を削除した結果を示していラット頭蓋骨。はんだごては、ドラフト内で歯科用セメントとクイック·シルを除去するために使用されていました。ケーブル配線と、任意の非注入MEAの構造は次のゆっくり固定脳の表面にクイック·ジンシルを通って下掘削によってマイクロはさみで切断した。 スライスした後、ラベリング、および組織をクリアし、シンプルなカスタムメイドのスライドが厚い組織切片（ 図2b）を搭載するのに便利です。注入されたマイクロデバイスを含むマウント脳切片を図2cに示されている。 図3に示されるように、スライドのどちら側を通ってイメージングを使用すると、装置の周りのインターフェイスを評価できるようにすることができます</st電極部位とトレースに沿ってチョロンMEAのシリコン裏に沿ってミクログリアが片側から見える&gt;、（ 図3a）とミクログリアは反対側（ 図3b）上に表示されます。 マウントされた組織は、XY移動ステージを用いて画像化することができる。全体の組織切片全体で蛍光標識の概要は、所望の分解能（ 図4）で生成することができます。注入されたマイクロデバイスの周りに形態学的に保存された組織·インターフェースの詳細な検証は、局所組織反応（ 図5）の分析のための高倍率下で収集することができます。 <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig1.jpg" alt="図1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig1highres.jpg"/> 図1。手順の概要。（AC）脳マイクロインプラント手術はFINAアールカバーアクリルセメントに続いてすぐにデバイスを取り巻くクウィク-Silのポリマーの層でlized。 （D、E）に続いて安楽死、アクリル層が離れて焼かれ、デバイスの頭蓋骨実装部品は、シリコーンエラストマーを介して切断することにより注入された成分から分離される。 （f、g）は脳はその後頭蓋骨から削除され、カットとビブラトームステージに取り付けられている。 （HK）組織切片は、デバイスを含む組織切片を含めて、収集されます。 （L）組織が ​​処理され、詳細な顕微鏡用のカスタムチャンバーに取り付けることができます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50126/50126fig1large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig2.jpg" alt="図2"/> 図2（a）のクイック·シルシリコーンエラストマーsuをクリアrroundingを電極アレイ·ケーブル（矢印）は、はんだごてを使用して灌流し、げっ歯類の頭の上に歯科用セメントのキャップでウィンドウを離れて燃焼させて暴露された。 （b）の厚い組織切片のいずれかの側にイメージングに対応するために、単純な&quot;スライド室&quot;プラスチック製のスライドをカットし、組織の周りにどちらかの側にカバーガラスを接着し、ソリューションを実装することによって行うことができる。 （c）は無傷のインプラント（赤矢印）とラット脳組織切片をマウントした後に表示されます。組織のいずれかの側には、この設定で顕微鏡画像にすばやくアクセスできます。パネル（A、B、C）が下部に渡って80ミリメートルいる間スケールの場合、パネル（a）は 、下部に渡っ25mmである。 <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig3.jpg" alt="図3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig3highres.jpg"/> 図3の最大値intensityは40μm厚の画像スタックのz予測、裏面（）および移植微小電極アレイの前面（b）の周りに集めた。ミクログリア（抗Iba1とAlexa Fluor 633で標識された、白）とデバイスの表面から採取したレーザー光の反射率（赤）は、順次400μmの厚い組織切片の両側から撮像した。脳インプラントはしばしば不透明であるように、両側に光アクセスでマウントすると、顕微鏡の対物レンズに対するインプラントの &quot;背後&quot;とラベルされた組織構造のクリアな視界を提供します。スケールバーは50μmである。 <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig4.jpg" alt="図4"/> 図4：共焦点レーザ走査型顕微鏡にコンピュータ制御されたステージを用いて画像化ラベル付きDCHistスライス。 （a）細胞核（ヘキスト33342で染色）及び（b）の単球/ミクログリア（抗Iba1で標識）を同時に別々のチャネル上に結像された。 （c）は透過光と反射率もヘキストとIba1データに対して4週間のインプラントの位置を示す、収集した。 （d）すべてのチャネルが、送信のオーバーレイも表示されます。白い長方形の領域が右側に現れるイメージで展開される。スケールバーは1mmである。 <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig5.jpg" alt="図5" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig5highres.jpg"/> 図5：コンピュータ制御顕微鏡ステージ、適切なソフトウェアを使用して、パノラマ画像データはインプラントの周りを収集することができる。反射率（）と透過率（b）の蛍光抗体又は化学的標識（C、ミクログリアおよびmacの抗Iba1ラベリングしながら、装置の局在を許可rophages）は無傷の組織の界面に沿って組織成分の詳細なイメージングを可能にする。スケールバーは200μmである。

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Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

ここでは、光学的にクリアし、齧歯類の脳組織における慢性的に注入されたマイクロデバイスの周りにイメージング無傷の脳組織のインターフェイスを、ラベリング、キャプチャするための組織学的手法を提案する。この方法を含む技術から得られた結果は、その周囲の組織の様々な鋭い脳インプラントの影響を理解するために有用である。

脳移植マイクロデバイス及び周辺組織の無傷の組織学的性状

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

intact-histological-characterization-brain-implanted-microdevices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.7K ビュー.  Purdue University. ここでは、光学的にクリアし、齧歯類の脳組織における慢性的に注入されたマイクロデバイスの周りにイメージング無傷の脳組織のインターフェイスを、ラベリング、キャプチャするための組織学的手法を提案する。この方法を含む技術から得られた結果は、その周囲の組織の様々な鋭い脳インプラントの影響を理解するために有用である。

ビデオ: Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

無傷の3 - D脳の回路のウイルス標的のためのスケーラブルな流体インジェクタの配列

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

神経科学

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

無傷の網膜におけるGFP発現細胞集団の電気生理学的特性

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

無傷アダルトゼブラフィッシュの脳における電気生理学的記録

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

無傷の鋤鼻器官と副嗅球のex vivoでの準備

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional units of the ventricles are ciliated epithelial cells termed ependymal cells, which line the ventricles and through ciliary action are capable of generating laminar flow of CSF at the ventricle surface. This monolayer of ependymal cells also provides barrier and filtration functions that promote exchange between brain interstitial fluids (ISF) and circulating CSF. Biochemical changes in the brain are thereby reflected in the composition of the CSF and destruction of the ependyma can disrupt the delicate balance of CSF and ISF exchange. In humans there is a strong correlation between lateral ventricle expansion and aging. Age-associated ventriculomegaly can occur even in the absence of dementia or obstruction of CSF flow. The exact cause and progression of ventriculomegaly is often unknown; however, enlarged ventricles can show regional and, often, extensive loss of ependymal cell coverage with ventricle surface astrogliosis and associated periventricular edema replacing the functional ependymal cell monolayer. Using MRI scans together with postmortem human brain tissue, we describe how to prepare, image and compile 3D renderings of lateral ventricle volumes, calculate lateral ventricle volumes, and characterize periventricular tissue through immunohistochemical analysis of en face lateral ventricle wall tissue preparations. Corresponding analyses of mouse brain tissue are also presented supporting the use of mouse models as a means to evaluate changes to the lateral ventricles and periventricular tissue found in human aging and disease. Together, these protocols allow investigations into the cause and effect of ventriculomegaly and highlight techniques to study ventricular system health and its important barrier and filtration functions within the brain.

Using MRI scans (human), 3D imaging software, and immunohistological analysis, we document changes to the brain&#8217;s lateral ventricles. Longitudinal 3D mapping of lateral ventricle volume changes and characterization of periventricular cellular changes that occur in the human brain due to aging or disease are then modeled in mice.

ヒトとマウスにおける脳室周囲の組織の側脳室および組織学的特性の3次元モデリング

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to non-human primates. The large brain size of the pig allows the use of conventional clinical brain imagers and the direct use and testing of neurosurgical procedures and equipment from the human clinic. Further macroscopic and histological analysis, however, requires postmortem exposure of the pig central nervous system (CNS) and subsequent brain removal. This is not an easy task, as the pig CNS is encapsulated by a thick, bony skull and spinal column. The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and the pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.

The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.

組織学的分析のための豚CNSの露出：斬首、スカルオープニングのためのマニュアル、および脳の取り外し

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to ...

Electroencephalographic, Heart Rate, and Galvanic Skin Response Assessment for an Advertising Perception Study: Application to Antismoking Public Service Announcements

The evaluation of advertising, products, and packaging is traditionally performed through methods based on self-reports and focus groups, but these approaches often appear poorly accurate in scientific terms. Neuroscience is increasingly applied to the investigation of the neurophysiological bases of the perception of and reaction to commercial stimuli to support traditional marketing methods. In this context, a particular sector or marketing is represented by public service announcements (PSAs). The objective of this protocol is to apply electroencephalography (EEG) and autonomic signal analysis to study responses to selected antismoking PSAs. Two EEG indices were employed: the frontal alpha band EEG asymmetry (the Approach Withdrawal (AW) index) and the frontal theta (effort index). Furthermore, the autonomic Emotional Index (EI) was calculated, as derived from the Galvanic Skin Response (GSR) and Heart Rate (HR) signals. The present protocol describes a series of operational and computational steps required to properly estimate, through the aforementioned indices, the emotional and cerebral reaction of a group of subjects towards a selected number of antismoking PSAs. In particular, a campaign characterized by a symbolic communication style (classified as "awarded" on the basis of the prizes received by specialized committees) obtained the highest approach values, as estimated by the AW index. A spot and an image belonging to the same PSA campaign based on the "fear arousing appeal" and with a narrative/experiential communication style (classified as "effective" on the basis of the economical/health-related improvements promoted) reported the lowest and highest effort values, respectively. This is probably due to the complexity of the storytelling (spot) and to the immediateness of the image (a lady who underwent a tracheotomy). Finally, the same "effective" campaign showed the highest EI values, possibly because of the empathy induced by the testimonial and the explicitness of the message.

The following protocol describes a series of operational and computational steps required to properly estimate the emotional and cerebral reaction of a group of subjects towards a selected number of Public Service Announcements (PSAs) against smoking, aired in the USA and Europe during the period between 1998 and 2015.

脳波、心拍数と広告認識のための皮膚電気反応評価研究: 禁煙の公共サービスの発表への応用

The evaluation of advertising, products, and packaging is traditionally performed through methods based on self-reports and focus groups, but these ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

栓塞狭窄軽度子宮内血流の低下のモデルラット

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

体外における感覚神経と運動神経からの線維芽細胞およびシュワン細胞の精製

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...