ESBは、NIHのディレクターの新イノベーター賞（OD002002 - 01 DP2）、NIHのチャレンジグラント1RC1MH088182 - 01、NIHグランド機会グラント1RC2DE020919 - 01、NIH 1R01NS067199 - 01、NSF（0835878と0848804）、マクガバン研究所Neurotechnologyアワードプログラムによって資金を認め、防衛、NARSAD、アルフレッドP.スローン財団、ジェリーとマージバーネット、神経科学、MITメディアラボ、ベネッセ財団、ウォレス時間コールター財団におけるイノベーションのためのSFN研究賞の部。

1。定位クランプの構築<ol><li>定位クランプは、インジェクターが定位固定アームと平行になるように、stereotaxにインジェクタのアレイを取り付けるために使用されます。 </li><li>それは複数の手術を同時に行なうことができることが予想されていない限り、各研究室では、唯一のクランプが必要です。このケースでは、同時手術の予想最大数と同じ数を作る。また、最初の損傷の場合には、余分を加えようとするのはお勧めかもしれません。 </li><li>定位クランプを行うには、まず、1.5ミリメートル外径（OD）鋼カニューレは、長さ2インチにカットされ、一端は平らになるまでダウンDremeledている。 </li><li>次に、小片（約0.5 × 0.5 cm）をスペーサーとして使用されるように、PCBプロトタイプボードから切り出しています。 </li><li>行われたカットは、材料の表面に対して垂直になるようにレーザーカッターを使用して、二つの同一の長方形（1 / 2&quot;× 3 / 8&quot;）1 / 8&quot;アクリルシート、の二つの円形孔を有する各四角形からカットされています長方形の対角線。最初の穴は直径1.5mmを持ち、しっかりと金属製のカニューレを保持するのに十分な大きさであり、2番目の穴は直径1 / 16&quot;（ 図1C）を持っている。 </li><li>金属カニューレは、2番目の1.5mmの穴から、つの四角形の1.5 mmの穴に挿入されます。カニューレの下端は、ホッケースティックの形状を形成し、底面の長方形の底面に揃えて配置されます。 </li><li>しっかりつの矩形間で開催されたスペーサを保ちながら、この構造体は接着の長方形にスペーサーを避けるために注意しながら、カニューレと1.5ミリメートルの穴の周りにホットグルーを使用して一緒にセメントされています。粘土は、このプロセス中に物事を一緒に保持するために役立つことがあります。 </li><li>接着剤が乾燥した後、1〜72ネジは長方形の上辺から16分の1穴に挿入されます。その後、1〜72六角ナットは1から72スクリューの端にねじ、と締め付けられる。ネジとナットが一緒にクランプを保持するために役立つ。 </li><li>底部の四角形の底面に六角ナットを添付するには、5分エポキシ少量のエポキシ樹脂は、六角ナットやネジのスレッドに取得できるようにすることなく、六角ナットのエッジの周りにドロップされます。どんな粘土が削除され、そしてそれは、スペーサーはネジを締めて、しっかりと所定の位置に保持できることが確認された。 </li></ol> 2。ハミルトンポンプとstereotax：カスタマイズされたインジェクタの配列のためにシステムの準備<ol><li>インジェクタアレイシステムは、脳内の座標のほぼすべてのセットにカスタマイズすることができます。 </li><li>ユーザーが最初に設置したstereotaxで使用される適切な座標に変換する、マウス（または他の種）の脳アトラスの目的の注射部位の座標（ここで、X -、Y、およびZ座標）。注射部位の数（ 図1Aおよび1Bの3つ） 以下、K呼び出されます。 </li><li> 10μlのハミルトンシリンジのkの数は、ハーバード大学の装置からこのような注入/撤退シリンジポンプに配置されます。 </li><li>ポリエチレンチューブの次、3フィートの長い作品はしっかりとそれぞれのハミルトンシリンジの針に取り付けられている。 </li><li>ポリエチレンチューブの部分ごとに、アップチャーチ科学からF - 252チューブスリーブは開放端にスライドさせると付属のナットを使用してP - 627チューブアダプターに接続し、アップチャーチ科学からも、フェルール。 </li></ol> 3。カスタマイズされたインジェクタの配列を構築する<ol><li>各インジェクタの配列は、ユーザーが選択する座標のセットにカスタマイズされています。しかし、翻訳および/または回転によってのみ異なる座標のセットのために、同じインジェクタの配列を使用することができます。 </li><li>唯一の相対的なXおよび注射部位のY座標を考慮すると、k個の穴が&quot;同じ相対的な間隔で、これらの穴がModelaミニ工場と0.011を使用して掘削している&quot;厚さ1 / 32のPCBのプロトタイプボードに掘削されていますマクマスター - カーから直径のドリルビット。ドリルビットを壊したり、消耗を避けるために掘削の遅い速度（Z -スピード）を使用してください。工場からボードを取り外す前に、長方形小さいものを着用を避けるために、直径1 / 32&quot;の大きなドリルビットを使用して、小さな穴の周りに掘られているミニミルのためのコードが簡単にMATLABを使用して生成することができます。。サンプルコー​​ドは以下のファイルで提供されています。 <ol class="lroman"><li> generate.m - 目的の座標からModelaコードを生成するためのMATLABコード</li><li> holes_ex.rml - プロトボードに呼び出し音のパターン（8つの穴）をあけるためのModelaコード</li><li> outline_ex.rml - 穴の周り掘削四角形のModelaコード</li></ol></li><li> 245μmのOD/100μmの内径（ID）フューズドシリカキャピラリーチューブ、ポリマイクロTechnologiesから入手は、3インチの部分のk個の数にカットされます。これらは、個々のインジェクタを備える。キャピラリーチューブの使い捨て部分は通過突かれる穴の各々は、実際のインジェクターを詰まらせることなくゴミを一掃するために。インジェクターは、それらがお互いにしっかりと平行に保持されるように、途中でそれぞれの穴に挿入されます。インジェクターは、インジェクターの配列の構造を形成し、基板にepoxiedされています。残っているのは、正しい長さにインジェクターをトリミングすることです。 </li><li>インジェクタの配列は、アクリルの長方形の間に、して定位クランプのネジを締めて、プロトボードのいずれかの隅を配置することにより、定位固定クランプに取り付けられています。次に、クランプの金属カニューレはstereotaxの付着メカニズムを使用して、stereotaxに添付されます。 </li><li>以下のすべては、顕微鏡下で行われます。外側のインジェクター（つまり、他のインジェクターのいずれかに衝突することなく、ストレートエッジと側面からアプローチをすることができるもの）のいずれかの、プロトボードの底部を越えて伸びる先端をハサミでカットされます。皮質注射の場合、それはインジェクタがproto -ボードの表面を越えて約5ミリメートル延長したことは適切である。深く注射の場合、この数値は、深さの増加に対応増加させることができる。先端は、ドレメルツールを使用して平坦化される。深さの精度がそれほど重要ではない場合、インジェクタの先端にはまた、目詰まりに対して余分な予防措置としての角度で地面にすることができます。 </li><li>次に、安定した基準点は、定位固定アームの範囲内で選択され、インジェクタの配列は、外側のインジェクタの扁平な先端が、この基準点になるように移動されます。 </li><li>第二インジェクタは、対応する座標と一緒に、選択されます。第一および第二のインジェクタの座標間の高さの相対的な違いは、（z方向）であると考えられ。インジェクタの配列は、この相対距離によってZ軸方向に移動されます。第二インジェクタ第二インジェクターの先端が、現在フラットであり、基準点の高さになるよう、トリミングして、正しい長さにDremeledている。インジェクタの配列は、基準点とインジェクタの先端の比較を容易にするためにX方向とY方向に移動することができます。 </li><li>トリミングのこのプロセスは、残りのインジェクターのために繰り返されます。 </li></ol> 4。システム全体の組み立て<ol><li>定位クランプおよびカスタマイズされたインジェクタの配列は、両方とも既に構築された、この部分のために必要とされています。 </li><li>各インジェクタのバックエンドは（トリミングされていないエンド）、P - 235ナットとアップチャーチ科学からP - 200フェラルを使用して、F - 240チューブスリーブ青と挿入され、すでに接続されているネジアダプターに接続されているポリエチレンチューブによるハミルトンのポンプに。メーカーの指示は、詳細を相談することができます。 </li><li> 27ゲージ針を用いて、シリコーンオイルは、システム全体がまったく空気の泡で、インジェクタの先端にハミルトンシリンジから充填されるようにハミルトンシリンジの後ろに注入されます。 </li><li>ハミルトンシリンジがハミルトンのポンプで再配置されるように、シリコーンオイルの最大限の量は、シリンジ内に保持されます。 </li><li>実験は、ポンプよりも多くのシリンジが（この場合は2）のために設計されている必要がある場合は、注射器は互いにそれらを平行に保つために、そしてすべての作品があることを確認するためにプラスチック製の小さな断片（例えば、針のキャップ）を配置できますと同程度に、ポンプでプッシュ。または、マルチラックのアップグレードキットは、一度に10注射器まで保持するためにハーバード大学の装置から購入することができます。 </li></ol> 5。注射/手術<ol><li>並列インジェクターで注入するプロセスは、単一のピペットで注入すると非常によく似ています。 </li><li>高速ポンプが大型と小型のチューブとの間の関節に負荷をかける可能性があるので、ゆっくりとリフィルを使用する/このプロセスを通じて金利を注入することが不可欠です。推奨最大速度：ウイルスをロードするための2μlの/ minとし、ウイルスを注入するために0.1μL/分。 </li><li>麻酔マウスはstereotaxに配置し、実験全体を通して麻酔のままです。 </li><li>必要に応じてマウスを準備します。例えば、メスで、シングルカットは、目の間から耳の間に、皮膚の正中線を下に行われます。皮膚は、頭蓋骨を露出するために引き戻され、そして筋膜はオフに洗浄される。プルガラスピペットはstereotaxに添付されます。耳のバーの位置ブレグマとラムダまで調整されていますが、同じ高さに揃え、そしてそれらを結ぶ線はstereotaxのY -軸に平行であるようにされています。 stereotaxの軸は、注入の座標が計算される座標系に基づいて提供いたしております。定位はブレグマのガラスピペットの先端を持つゼロ化され、その後チップはX -及び注射部位の一つのY座標でわずかに頭蓋骨の上に配置されている。 </li><li>骨の極めて薄い層が残るまで、歯科用ドリルを使用して、先端下に頭蓋骨は慎重に離れて比べています。ガラスピペットが低くなる可能性が掘削中の穴が正しい位置を中心とされていることを確認するためにedと引き上げた。 30ゲージ針を用いて、層の小片を優しく正しいX -とY -座標、で、オフピックアップされるので、硬膜が露出されていること。この穴は、インジェクター（0.25ミリメートルワイド）のどれにも適合するのに十分な大きさにする必要があります。 図については、 図1Dを参照してください。このように、小さい、0.25ミリメートル幅の穴がで、頭蓋骨で作られていますX -及び各注射部位に対応するY -座標。 </li><li>ガラスピペットは、鋭利物容器に廃棄され、そしてカスタマイズされたインジェクタの配列は、定位クランプを使用してstereotaxに添付されます。 </li><li>正しくインジェクタの配列の角度を設定するために、二つの外側インジェクターは、以下のように、所定の基準点に校正するように選択される。インジェクタのいずれかが基準点と一致した後で、相対的なX -とこのインジェクタからの相対注射部位の間にY -の距離とその他のいずれかを考慮してください。 stereotaxの軸は、全体のインジェクタの配列は、これらの相対的な距離によってX -とY -方向に移動されるように調整されます。第二インジェクタが現在の参照ポイントに合っていない場合、金属製のカニューレを緩めて回転される。インジェクタの配列が正しく角度れるまで、このプロセスは反復的に繰り返されます。 </li><li>注射器は、2μlのポイント（またはそれ以上）になるまでウイルスにインジェクターを充填する前に、インジェクターは、シリコーンオイルが充填されています。これは、先端に詰まり、気泡や、簡単に、以前に記述し、注射器の後ろからシリコーンオイルで補充して、システム全体をしなくても、ハミルトンポンプを使用して前方にオイルを押すことによって削除できるように、緩衝地帯を提供します。 </li><li>パラフィルムの滅菌ピースは頭蓋骨に配置され、インジェクターを穏やかにパラフィルムの上に低下する。大幅に変化する深さ、カスタム粉砕した部分（例えば、階段状のオブジェクト）で座標を読み込む促進することができます。 </li><li>以下のパーツは、ウイルスの1μLが（少量が必要な場合次の量を縮小する必要がある）各サイトでロードすることを前提としています。ウイルスの&gt; 1μlを各サイトで注入されることを保証するためには、ウイルスの1.5μlを各インジェクタの先端にパラフィルムや階段の上にピペッティングします。 </li><li>ハミルトンのポンプの補充率は1μL/分に設定すると、ウイルスの1.2μlを各インジェクターに補充される。 </li><li>最長インジェクタの先端はブレグマに0で埋められ、その後、インジェクタの配列は、そのインジェクタのX -とY -座標にシフトされます。ウイルスがすべてのインジェクタの先端から出てきた見ることができるようになるまでにも脳に注入器の先端を挿入する前に、それは、ポンプの注入を開始するために時々お勧めです：目詰まりが問題になる場合は多くの深いターゲットが関与している場合、と言う。これは、インジェクタ先端に気泡を除去し、さらには目詰まりがないことを保証します。目詰まりの場合には、ハミルトンのポンプは静かに目詰まりをクリアするために、2μlの/分の高速で短いパルスを注入するために設定されています。 </li><li>インジェクタの配列は、正しいZ深度に、30ゲージの針で作った小さな穴から、低下する。 </li><li>ウイルスの1μlを0.1μL/分で、それぞれのインジェクタを介して注入される。 </li><li>注射は、30分間放置されています。 </li><li>インジェクタの配列が徐々に脳から抽出された後、ハミルトンのポンプは、各インジェクタの詰まりをチェックするためには、0.1μL/分の同速度で注入するために設定されています。 </li><li>その後インジェクターを2μL/ minでエタノールを1.5μlを補充して注入することによって洗浄されます。 </li><li>最後に、インジェクターは各ハミルトンシリンジに2μlのバッファーゾーンを維持するためにシリコーンオイルを再充填されています。 </li><li>すべての機器は、所属機関のバイオセーフティおよび動物使用のプロトコールにしたがって、処理の開始前および終了後に滅菌されるべきである。 </li></ol> 6。代表的な結果個々の時間は施術者のスキルに依存するが、並列インジェクタの配列は、セットアップと回復時間をカウントしない、インジェクターの数に等しい係数で大体手術をスピードアップします。 1マイクロリットルの注入のために、我々は通常、約直径1ミリメートル（ 図1E）の球で、レンチウイルスの発現を見た。注入の精度は、先端の位置の変動は、臨床試験から臨床試験に、約45ミクロン（先端の位置から目的の先端位置までの距離の標準偏差）となるようだ。 <img src="/files/ftp_upload/1489/1489fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。設計、実装、およびパラレルウイルスインジェクタの配列の使用。、並列インジェクタアレイシステムの概略、3つの同時注射のために、トリプルインジェクタの構成を示す。B、に図示したようにトリプルパラレルインジェクタの配列の写真。 <st栄&gt; C、 定位クランプ、トップからアウトラインに示すようにD、効率的で、被害最小化のための手法の実例、脳内に注入器の挿入のために頭蓋骨に穴を開ける。。歯科用ドリルで、〜50ミクロンの厚さにダウン頭蓋骨薄く、その後使用してください小開頭を開くには鋭い針の先端。E、channelrhodopsin - 2を示す蛍光画像（ChR2）としてBに示すように、トリプルインジェクタの配列の標的に、3つのマウス皮質領域での細胞- GFP標識

<ol>
	<li>Chow, B., Han, X., Qian, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-performance+halorhodopsin+variants+for+improved+genetically-targetable+optical+neural+silencing.">High-performance halorhodopsin variants for improved genetically-targetable optical neural silencing.</a> Frontiers in Systems Neuroscience. , (2009).</li><li>Bi, A., Cui, J., Ma, Y. P., Olshevskaya, E., Pu, M., Dizhoor, A. M., Pan, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+expression+of+a+microbial-type+rhodopsin+restores+visual+responses+in+mice+with+photoreceptor+degeneration.">Ectopic expression of a microbial-type rhodopsin restores visual responses in mice with photoreceptor degeneration.</a> Neuron. 50, 23-33 (2006).</li><li>Han, X., Qian, X., Bernstein, J., Zhou, H., Franzesi, G., Stern, P., Bronson, R., Graybiel, A., Desimone, R., Boyden, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-Timescale+Optical+Control+of+Neural+Dynamics+in+the+Nonhuman+Primate+Brain.">Millisecond-Timescale Optical Control of Neural Dynamics in the Nonhuman Primate Brain.</a> Neuron. 62 (2), 191-198 (2009).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Brauner, M., Liewald, J. F., Kay, K., Watzke, N., Wood, P. G., Bamberg, E., Nagel, G., Gottschalk, A., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+fast+optical+interrogation+of+neural+circuitry.">Multimodal fast optical interrogation of neural circuitry.</a> Nature. 446 (7136), 633-639 (2007).</li><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity.">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li><li>Han, X., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple-color+optical+activation,+silencing,+and+desynchronization+of+neural+activity,+with+single-spike+temporal+resolution.">Multiple-color optical activation, silencing, and desynchronization of neural activity, with single-spike temporal resolution.</a> PLoS ONE. 2, e299-e299 (2007).</li><li>Szobota, S., Gorostiza, P., Del Bene, F., Wyart, C., Fortin, D. L., Kolstad, K. D., Tulyathan, O., Volgraf, M., Numano, R., Aaron, H. L., Scott, E. K., Kramer, R. H., Flannery, J., Baier, H., Trauner, D., Isacoff, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+neuronal+activity+with+a+light-gated+glutamate+receptor.">Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor.</a> Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).</li><li>Lima, S. Q., Miesenbock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remote+control+of+behavior+through+genetically+targeted+photostimulation+of+neurons.">Remote control of behavior through genetically targeted photostimulation of neurons.</a> Cell. 121 (1), 141-152 (2005).</li><li>Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Channelrhodopsin-2+and+optical+control+of+excitable+cells.">Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells.</a> Nat. Methods. 3, 785-792 (2006).</li><li>Ishizuka, T., Kakuda, M., Araki, R., Yawo, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+evaluation+of+photosensitivity+in+genetically+engineered+neurons+expressing+green+algae+light-gated+channels.">Kinetic evaluation of photosensitivity in genetically engineered neurons expressing green algae light-gated channels.</a> Neurosci Res. 54 (2), 85-94 (2006).</li><li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+neural+circuits.">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57 (5), 634-660 (2008).</li></ol>

すべての手順は、実験動物のためのNIHのガイドにしたがっていたし、MITの動物実験とバイオセーフティ委員会により承認。

近年では、遺伝的に符号化された光学増感剤の数は、光の短いパルス（例えば、1,4,5,6,7,8に対応して、時間的に正確な方法で生体内で活性化し、沈黙するニューロンを有効にしている、11）。神経細胞が哺乳類の脳で明らかに感作されているとの主要なメソッドは、で、マウスからサルに至るまで、動物の脳にオプシンをコードする遺伝子を提供できるようなレンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス（AAV）などのウイルスを介してです。安全で永続的なファッション（例えば、2,9,10）。ウイルスは、特に、ラットやサルなどの遺伝的モデル生物ではない生物に対して、遺伝子組換えを行うよりも高速TATを可能にし、オプシンのためにトランスジェニックのシナリオでは可能ではないかもしれない高い発現レベルを有効にすることができます。ここでは、全体の3次元の脳の構造がウイルス単一の外科のステップで、遺伝子を標的とすることを可能にする迅速なタイムスケール、&quot;回路レベルのトランスジェニック、&quot;で、作成することができる並列インジェクタの配列を示しています。インジェクタの配列は、各ドライブの高圧耐性のコネクタを介して、キャピラリー/フューズドシリカがポリイミド中に供給するそれぞれの注射器のセット、1つ以上の容積式ポンプで構成されています。毛細血管が割り当てられており、その後このように、ウイルスやその他の試薬は、脳領域の所望の設定に配信できるように、カスタム製粉定位位置決めボードで指定された所望の位置に、挿入。デバイスを使用するには、外科医は、まず、油を完全に流体サブシステムを埋めますウイルスに毛細血管をバックフィル、挿入する脳内のデバイス、および（&lt;0.1μL/ min）をゆっくりと試薬を注ぎこむ。 この技術は、（などのような動作時に正確なタイミングで複雑形状の構造のミリ秒スケールのシャットダウン（例えば海馬など）、冗長的に作用してもよい二国間の構造の時間的に正確な不活化などの実験の新しい種類、多種多様を有効にします左と右扁桃体）、および複数の離散的な脳領域の摂動（例えば、の部分集合をサイレンシングしながら、クロス領域の同期が地域に各地域内の活動に依存する、または刺激的な入力方法を学ぶために位相が接続された2つの領域を駆逐ターゲット）これらの入力の効果を仲介するための重要ないくつかのターゲットのかを理解するため。霊長類のもののような大きな脳の場合は、これで我々は最近、光細胞型に特異的神経活性化3、行動に関連した領域で活動を摂動すると、大きな、複雑な構造のウイルスのラベリングを必要とする可能性を実証している。薬物、神経修飾物質、神経伝達物質、あるいは細胞 - - 脳の複雑な3次元パターンで、時間的に正確な方法で我々は並列インジェクタの配列は、ほぼすべてのペイロードを注入するために使用されるかもしれないことに注意してください。最後に、翻訳の観点から、それは急速に、患者のカスタマイズ、遺伝子治療や薬物送達デバイスが急速になっている可能性があります特注設計の潜在的を使用して、病理学の様々な新しい治療法をサポートする、個々の脳の形状を一致させる作製光制御分子。 インジェクタの配列は、両方の空間的および容積、正確であるように設計されています。 X -とY -方向で、これは安価なミニミルを使用して非常に正確に配置された穴をあけることによって達成され、インジェクターに合わせて十分な大きさの穴と、インジェクターが互いに平行に保持されるように、そして正確に場所。 Z -方​​向で、インジェクターは定位手術そのものと同等の精度のレベルをできるように、定位固定装置を使用してトリミングされます。体積の精度は、ハミルトンのポンプの精度だけでなく、高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）フィールドから適応がほぼゼロデッドボリュームコネクターから生じる。インジェクターは強いし、それがそのような鋼のカニューレなどの代替の大きな壁の厚させずに、圧力下で正確な形状と間隔を維持している十分な剛性がフューズドシリカキャピラリーチューブから作られています。小さな変更は、容易に実験の様々な並列インジェクタの配列を適合させることができます。例えば、ウイルスやより細かい間隔の小さいボリュームが必要な場合は、小さなキャピラリーチューブは、対応する小さなドリルビットと一緒に用いることができる。将来のデバイスは、サイズを（おそらく自由に動く動物の頭の上にマウントされるようなデバイスを可能にする）最小限に抑えるために、並列インジェクターの数を増やすために、マイクロ流体チャネルとポンプを利用してもよい。

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Dremel Tool</td>
<td>Tool</td>
<td>Dremel</td>
<td>3956-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Laser Cutter</td>
<td>Tool</td>
<td>Universal Laser Systems</td>
<td>VLS2.30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hot glue gun</td>
<td>Tool</td>
<td>Stanley Bostitch</td>
<td>GR20</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Injection/withdrawal syringe pump (Hamilton pump)</td>
<td>Tool</td>
<td>Harvard Apparatus</td>
<td>702001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 &mu;l Hamilton syringes</td>
<td>Tool</td>
<td>Hamilton Company</td>
<td>701N</td>
<td>Need one per injection site</td>
</tr>
<tr>
<td>Mouse stereotax</td>
<td>Tool</td>
<td>Stoelting</td>
<td>51725D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Modela mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Roland</td>
<td>MDX-15</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.011" diameter drill bit for mini mill</td>
<td>Tool</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8915A12</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1/32" diameter drill bit For mini-mill</td>
<td>Tool</td>
<td>McMaster-Carr</td>
<td>8848A35</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>High speed dental drill</td>
<td>Tool</td>
<td>Lynx</td>
<td>333</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dental drill accessories</td>
<td>Tool</td>
<td>Pearson</td>
<td>F 35-08-25 F 35-07-10 P 86-02-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
<td></td>
</tr>
<tr>
<td>1.5mm outer diameter (OD) stainless steel cannula</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HTX-15R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 binding slotted machine screw</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>MX-0172B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-72 hex nut</td>
<td>Material</td>
<td>Small-Parts</td>
<td>HNX-0172</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PCB proto-board, 1/32" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Digi-Key</td>
<td>PC57-T-ND</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acrylic Sheet, 1/8" thick</td>
<td>Material</td>
<td>Mcmaster-Carr</td>
<td>8560K239</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HPLC connectors</td>
<td>Material</td>
<td>Upchurch Scientific</td>
<td>F-252, P-627, P-200, P-235, F-240 (some of these can be bought in 10-packs; simply add an &#x2018;x&#x2019; to the end of the part number)</td>
<td>Need one per injection per site, except F-252, P-627, and P-235, which can be reused</td>
</tr>
<tr>
<td>Fused silica capillary tubing, OD: 245 &mu;m, ID: 100 &mu;m</td>
<td>Material</td>
<td>Polymicro Technologies</td>
<td>2000022-10M</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
<td>Material</td>
<td>Permatex</td>
<td>84101</td>
<td>5-minute general purpose epoxy</td>
</tr>
<tr>
<td>Polyethylene tubing .066 x .095 inch</td>
<td>Material</td>
<td>VWR</td>
<td>63018-827</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

scalable fluidic injector arrays for viral targeting of intact 3-d brain circuits

神経回路の我々の理解 - 大幅に急速に複雑な3遺伝子を標的とするための技術によって促進される - 彼らが補助する感覚、思考、感情、そして行動、およびそれらがどのように神経や精神疾患で破損しているが、こと計算を仲介する方法 - の迅速な作成を可能次元神経回路、&quot;回路レベルのトランスジェニックを。&quot;我々は最近、光感受性タンパク質のウイルスのエンコーディングは、ミリ秒のタイムスケールの活性化に特定の種類の細胞を感作し、無傷の脳内で黙らせることのできる方法を開発した。ここでは、脳の3次元構造内で定義される点の数十にウイルス（または他の液体）を供給可能なインジェクタの配列の設計と実装を示す（<strong&gt;図。 1A、1B</strong&gt;）。インジェクタの配列は、各ドライブの高圧耐性のコネクタを介して、キャピラリー/フューズドシリカがポリイミド中に供給するそれぞれの注射器のセット、1つ以上の容積式ポンプで構成されています。毛細血管が割り当てられており、その後このように、ウイルスやその他の試薬は、脳領域の所望の設定に配信できるように、カスタム製粉定位位置決めボードで指定された所望の位置に、挿入。デバイスを使用するには、外科医は、まず、油を完全に流体サブシステムを埋めますウイルスに毛細血管をバックフィル、挿入する脳内のデバイス、および（&lt;0.1マイクロリットル/分）をゆっくりと試薬を注ぎこむ。インジェクタの配列の並列性は、光活性化と定義されている脳の回路のサイレンシングを有効にするような光学増感剤などのウイルスのペイロードを持つ全体の神経回路の迅速、正確、そして堅牢なラベリングを容易にします。このような脳領域の所望のセットへの光配信用光ファイバアレイなどの他の技術と共に、我々は、無傷の脳の因果神経機能のプロービングの体系を可能にするツールボックスを作成したいと考えています。この技術は、哺乳類において回路に焦点を当てた神経科学へのそのような体系的なアプローチを開いて、そしてそのようなヒト以外の霊長類などの大型動物での脳領域の標識促進するだけでなく、細胞特異的光制御の補綴の臨床トランスレーショナルのパスを開くことができない場合があります、その精度は、難治性の脳疾患の治療の改善を有効にすることができます。最後に、ここで説明するようなデバイスは、容易にユーザーによるカスタマイズが可能な方法で、3次元構造に、そのような幹細胞と薬理学的作用物質のような他のペイロードの正確なタイミングによる流体の配信を、容易にすることができる。

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Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

神経回路の制御と解析<em&gt; in vivoで</em&gt;脳領域の所望の3次元セットにウイルスや他の試薬の配信のための技術によって促進される。我々は複雑な脳の回路の光学的操作を可能にする、カスタマイズされた流体インジェクタの配列の製作、およびウイルスによりエンコードされた光学増感剤の配信を実証する。

無傷の3 - D脳の回路のウイルス標的のためのスケーラブルな流体インジェクタの配列

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.2K ビュー.  Massachusetts Institute of Technology. 神経回路の制御と解析 in vivoで脳領域の所望の3次元セットにウイルスや他の試薬の配信のための技術によって促進される。我々は複雑な脳の回路の光学的操作を可能にする、カスタマイズされた流体インジェクタの配列の製作、およびウイルスによりエンコードされた光学増感剤の配信を実証する。

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Targeting of Deep Brain Structures with Microinjections for Delivery of Drugs, Viral Vectors, or Cell Transplants

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an injecting needle produces during its trajectory is a major concern especially in the mouse brain for not only the brain is small but also sometimes multiple injections are needed.  We show here a method to produce glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen which significantly reduces the brain damage and allows a precise targeting into the rodent brain. This method allows a delivery of small volumes (from 20 to 100 nl), reduces bleeding risks, and minimizes passive diffusion of drugs into the brain parenchyma. By using different size of capillary glass tubes, or changing the needle lumen, several types of substances and cells can be injected. Microinjections with a glass capillary tube represent a significant improvement in injection techniques and deep brain targeting with minimal collateral damage in small rodents.

In this article, we show a method to make glass capillary needles with a 50-&mu;m lumen. This technique significantly reduces the brain damage, minimizes passive diffusion of drugs and allows a precise targeting into the rodent brain.

薬の配達のためのMicroinjections、ウイルスベクター、または細胞移植で脳深部構造のターゲティング

Microinjections into the brain parenchyma are important procedures to deliver drugs, viral vectors or cell transplants.  The brain lesion that an ...

神経科学

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

脳移植マイクロデバイス及び周辺組織の無傷の組織学的性状

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

無傷アダルトゼブラフィッシュの脳における電気生理学的記録

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

感染ニューロンの3-Dイメージングと分析<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;トキソプラズマ</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

商工会議所のコンポーネントとマルチスケール光イメージングの3次元印刷を組み込むColliculo、視床皮質マウス脳スライスの変更、

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

脳スライスにおける恐怖回路のex vivo光遺伝学解剖

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not represent the underlying cytoarchitectural and functional complexity of the affected individuals carrying suspected disease variants. Conventional 2-D models remain incomplete representations of in vivo-like structures and do not adequately capture the complexity of the brain. Thus, there is an emerging need for more 3-D hiPSC-based models that can better recapitulate the cellular interactions and functions seen in an in vivo system.
Here we report a protocol to develop a 3-D system from undifferentiated hiPSCs based on the serum free embryoid body (SFEB). This 3-D model mirrors aspects of a developing ventralized neocortex and allows for studies into functions integral to living neural cells and intact tissue such as migration, connectivity, communication, and maturation. Specifically, we demonstrate that the SFEBs using our protocol can be interrogated using physiologically relevant and high-content cell based assays such as calcium imaging, and multi-electrode array (MEA) recordings without cryosectioning. In the case of MEA recordings, we demonstrate that SFEBs increase both spike activity and network-level bursting activity during long-term culturing. This SFEB protocol provides a robust and scalable system for the study of developing network formation in a 3-D model that captures aspects of early cortical development.

Here we report a protocol to develop a three-dimensional (3-D) system from human induced-pluripotent stem cells (hiPSCs) called the serum free embryoid body (SFEB). This 3-D model can be used like an organotypic slice culture to model human cortical development and for the physiological interrogation of developing neural circuits.

生理学的に関連性のあるアッセイを用いた3-D幹細胞培養物の調査のためのHiPSC由来の無血清胚様体の開発

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

オプトジェネティクスを組み合わせてそのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子ノックダウンの効果を特徴付ける人工マイクロ Rna

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

Generation of 3-D Collagen-based Hydrogels to Analyze Axonal Growth and Behavior During Nervous System Development

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is centered on culturing small pieces of embryonic or early postnatal rodent brains inside a 3-D hydrogel formed by the rat tail tendon-derived type I collagen with specific porosity. Tissue pieces are cultured inside the hydrogel and confronted to specific brain fragments or genetically-modified cell aggregates to produce and secrete molecules suitable for creating a gradient inside the porous matrix. The steps of this protocol are simple and reproducible but include critical steps to be considered carefully during its development. Moreover, the behavior of growing axons can be monitored and analyzed directly using a phase-contrast microscope or mono/multiphoton fluorescence microscope after fixation by immunocytochemical methods.

Here, we provide a method for analyzing the behavior of growing axons in 3D matrices, mimicking their natural development.

神経系発達中の軸の成長と挙動を解析する3Dコラーゲンベースのヒドロゲルの生成

This protocol uses natural type I collagen to generate three-dimensional (3-D) hydrogel for monitoring and analyzing the axonal growth. The protocol is ...

Multi-Fiber Photometry to Record Neural Activity in Freely-Moving Animals

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and smaller functional subgroups, it becomes paramount to record from projections and/or genetically-defined subpopulations of neurons. Fiber photometry is an accessible and powerful approach that can overcome these challenges. By combining optical and genetic methodologies, neural activity can be measured in deep brain structures by expressing genetically-encoded calcium indicators, which translate neural activity into an optical signal that can be easily measured. The current protocol details the components of a multi-fiber photometry system, how to access deep brain structures to deliver and collect light, a method to account for motion artifacts, and how to process and analyze fluorescent signals. The protocol details experimental considerations when performing single and dual color imaging, from either single or multiple implanted optic fibers.

This protocol details how to implement and perform multi-fiber photometry recordings, how to correct for calcium-independent artifacts, and important considerations for dual-color photometry imaging.

自由に動く動物の神経活動を記録するマルチファイバー光メトリー

Recording the activity of a group of neurons in a freely-moving animal is a challenging undertaking. Moreover, as the brain is dissected into smaller and ...