著者らは、S Castorani、AJユースティス、ジョージアガンベッタ、CM Manuck、Z Nasafi、とZedanに感謝したいと思います。この仕事はによって資金を供給された：農業·農業研究サービス現在の研究情報システムの資金、米国エネルギー省（研究プロジェクトなし5306-21220-004-00、高度な光源は、Director、科学局、基本のOfficeでサポートされています。エネルギー科学、契約番号DE-AC02-05CH11231下、米国エネルギー省の）;。とNIFA特殊作物研究イニシアティブ助成AJMへ。

以下に記述されているプロトコルの詳細は高度な光源8.3.2ビームラインでの仕事のために特別に書かれたものです。適応は、他の放射光施設での仕事のために必要となる場合があります。適切な安全性と放射線のトレーニングは、これらの施設を使用するために必要です。 1。生きている植物のためのサンプル調製<ol><li> 〜直径10cmの鉢に植物を育てると、主茎（またはスキャンされる植物の部分）のように縦にポットの可能性と志向で中央に配置されていることを確認します。高度な光源の限界でHRCT楽器ハッチの物理的な寸法は、高さ約1mに植物を生きています。結果として、生きている植物のイメージングが最高の小さなポットで栽培苗/苗木上で実行されます。実験に応じて、さまざまな土壌タイプ（干ばつ実験などで）土壌水分量を制御するために使用することができ、柔軟なシュートを持ついくつかの植物（ 例えばブドウ）のために長いシュートは慎重tuのことができます後述のアクリルチューブにcked（ 図1および図2を参照）。 </li><li>カスタムメイドの剛性アルミポットホルダーでライブ鉢植えをマウントします。天板高さは鉢の高さの範囲に対応するように調整することができます。プレートの上部は、土壌表面の上部に合わせ、2つの部分の板の中心からの植物が突出するように設計されている。ポットホルダーの目的は、植物の茎、振動やサンプルモーションを最小限にするために所定の位置にしっかりと保持されていることを確認することです。スキャン中にサンプルモーションを最小にすることが不可欠です。 </li><li>いったんホルダーに取り付けられた、事前スキャンに対する植物の生理状態を決定するために、それぞれScholanderスタイル圧力室またはクリップオンリーフポロメーターを用いて幹の水ポテンシャルや葉の蒸散を測定します。 </li><li>植物の上やアルミニウム工場ホルダーの上に薄い壁のアクリルシリンダーを置き、安定させるために粘土パテで固定しサンプル（ 図2）。上部の葉のいずれかの振動や動きは幹を下に伝達され、スキャンされたエリア内の植物組織は、最終​​的に画像の歪みにつながる、移動させることになります。シリンダーは、植物の葉が含まれていると、スキャン時の振動をもたらすハッチ内の他の機器擦れ植物の葉を防ぐために使用されます。追加のプラスチックラップ、ペーパータオル、テープがさらに植物の部分（ 図4のサンプルの動きに関連する問題を参照してください）の振動や動きを最小限にするために使用されるべきである。その機能を実行するために十分な剛性を維持しつつ、そのX線吸収を（与えられた露光時の画質を低下させることができる）を減少させるために、含まれているシリンダーは、できるだけ薄い壁を有している必要があります。 </li><li>エアベアリングステージにカスタムポットホルダーを取り付け、X線源とイメージングセンサとカメラ機器との間で所定の位置に（ネジ）をロックします。 Positiサンプルを確保するために、磁気チャックベースで可能と中心として垂直などの幹に回転する間に視野内に留まります。 </li></ol> 2。フレッシュ切り出し、植物組織のためのサンプル調製<ol><li>新鮮な植物材料、一般的に茎や葉柄、生植物から即時に除去した後にスキャンすることができます。実験の目的は、木部ネットワーク全体を可視化することである場合には、血管内の水が空気と排気し、交換する必要があります。これを行うには、Scholanderスタイル圧力室に試料をマウントして、約5分間、低圧（&lt;0.05メガパスカル）で試料を通る圧縮空気または窒素を押してください。種は、血管網を避難させるために必要な時間が異なります。意図は、新鮮な植物組織における塞栓形成の程度を評価し、新鮮なカミソリの刃を用いて植物から次に消費税サンプルと水中で切り傷を作ることである場合。 </li><li> PRにパラフィルムの層でサンプルを包むスキャン中にイベントの乾燥。 </li><li>エアベアリングステージにねじ込まれている金属板に固定し、ドリルチャックに試料をマウントします。中央と東洋は、垂直などのサンプルを確保するために、上記のサンプルでは、​​視野の中に残っています。 </li></ol> 3。干し木質組織のためのサンプル調製<ol><li>最適な組織試料の可視化と画像コントラストのために、それは徐々に全体の木質組織試料を脱水する必要がある。長さは約6cmにサンプルをカットします。ターゲットとスキャン領域で可能な限りまっすぐにされているサンプルを選択し、≤1cmの直径を有する。 </li><li>徐々に組織の任意の亀裂や分裂を引き起こすことなく、サンプルを乾燥させるために低温で乾燥オーブンに木質組織サンプルを入れます。このプロセスは、種や組織間で異なる可能性があります。木質茎については、40℃のオーブン中で12時間は、通常、かなりの茶を発生させることなく、優れたコントラストを提供するのに十分であるステムの物理的な構造でNGES（ 図3で示した急速乾燥の問題を参照してください）。 </li><li>いくつかの状況では、走査型電子顕微鏡を使って後続の解剖と視覚化はHRCT画像内の特定のポイントに配向させることができるようなサンプル内の受託者マーカーを有することが望ましい。これを行うには、接辞金属やガラスビーズまたはパラフィルムを用いて幹の外側にワイヤー。もう一つの方法は、（Brodersen ら 2010年の例を参照）は、単一の木部導管に注入することができるシリコーン樹脂（ 例えば 、RTV-141、ブルースターシリコーン、イーストブランズウィック、ニュージャージー州）を使用することです。一度硬化し、シリコーン樹脂は、試料中にはっきりと見えて簡単に他の空気で満たされた容器とは区別される。正確にサンプルの特定の領域を見つけるには、このマーカーを使用します。 </li><li>上記のようにドリルチャックとセンター内のサンプルをマウントします。 </li></ol> 4。リーフTissuのためのサンプル調製2次元（2D）X線写真のためのe <ol><li>ほぼリアルタイムで葉における容器の内容を可視化するために、葉は歯科用X線に似た2D X線像を生成するためにスキャンすることができます。薄いアクリルプラスチックの2枚の間に葉をマウントして、クリップで端を固定します。その後、光学ブレッドボードは、イメージングシステムとX線源の隣にポストホルダシステムと位置に取り付けられたサンプルを添付。 </li></ol> 5。 8.3.2ハッチで試料を走査<ol><li>あなたのアプリケーションのために最善に動作する倍率を決定します。 ALSのビームライン8.3.2 2倍、5倍、10倍との倍率のレンズを使用してスキャンする機能があります。それぞれ画像の画素の大きさ4.5、2.25、0.9μmの中でこれらの結果。視野が増加倍率で減少すると倍率に応じて、サンプルは、適切なサイズでなければなりません。カメラとレンズの選択の詳細は、 表1に得られた画像パラメータを参照してください。</li></ol><table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="2"> PCO.4000（4008x2672） </td><td colspan="2"> PCO.Edge（2560x2160）（OPTIQUEピーター） </td></tr><tr><td> レンズ </td><td> ピクセル（μm）と </td><td> 視野（mm）の </td><td> ピクセル（μm）と </td><td> 視野（mm）の </td></tr><tr><td> 10倍</td><td> 0.9 </td><td> 3.6 </td><td> 0.65（0.69） </td><td> 1.7（1.7） </td></tr><tr><td> （4x）の5倍</td><td> 1.8 </td><td> 7.2 </td><td> 1.3（1.72） </td><td> 3.3（4.4） </td></tr><tr><td> 2倍</td><td> 4.5 </td><td> 18 </td><td> 3.25（3.44） </td><td> 8.3（8.8） </td></tr><tr><td> 1X </td><td> 9 </td><td> 36 </td><td> 6.5（ - ） </td><td> 16.6（ - ） </td></tr></tbody></table> 表1。4964908詳細ALSは8.3.2でカメラやレンズ。 <ol start="2"><li> X線エネルギーは15 keVで設定します。これは、（Brodersen ら 2010、2011、2012A、B参照）、ほとんどの植物のアプリケーションのための優れた画像のコントラストを提供することが示されている。露光時間は、一般的に100〜1,000ミリ秒の間の範囲の試料の厚さと密度（したがって倍率が使用される）に依存しています。長い露出時間（限り、検出器の画素が飽和していないとして）は、一般的に対ノイズ比が高い信号につながるが、増加したスキャン時間を犠牲にします。 </li><li>アプリケーションに適した角度の増分を選択してください。サンプルは、スキャン中に180°回転し、回転中に撮影した画像の数は、データセットのサイズ、スキャン間隔の長さと、最終的な画質に大きく影響することがありますが、一般的に品質の戻りが減少している。典型的なスキャンはスキャンごとに721の画像が得られ、0.25°単位で行われます。 incremenを下げる細かい詳細を可視化するためのより良いイメージで0.125°結果にトンが、こうして収穫1440の画像、より大きなデータセット（関心のある一般的な地域のために、この手段〜データの10〜30ギガバイト対5ギガバイト）。しかし、信号対雑音比は、しばしば改善され、増加したスキャン時間とデータサイズの両方の価値がある。スキャン中に変形/縮小しにくいドライ茎を損なうことなく、より長い間隔（小さい角度インクリメント）に供することができる。生物学的プロセス（ 例えば、塞栓修理）短いスキャン間隔を選ぶ、短い時間スケールで起こる画像の生きている植物は、この上のX線放射の潜在的な有害な影響を制限する方が好ましい場合、組織が ​​、これは潜在的な損失に来る画質。短いスキャン間隔は、画像がキャプチャされながら、試料を連続的に回転している間、連続断層撮影の設定を使用して達成することができる。 </li><li>スキャンごとに、 &quot;明視野&quot;と &quot;ダークフィールド&quot;の画像はcorrecteでなければなりませんD。明視野画像は、ビーム内のサンプルの無いイメージです。これらは多くの場合、水平方向のサンプルを変換することにより、サンプルのスキャンの前と後に収集されます。ダークフィールドが、これはシャッターカメラがないX線を示している信号の量を測定したX線閉鎖によって収集されます。 </li></ol> 6。データ処理<ol><li>収集コンピュータからファイルサーバーに、データ処理用コンピュータに輸出された &quot;生&quot;の2D。TIF画像を転送。コンピュータに十分なRAMがある場合、データは、いわゆる &quot;RAMドライブ&quot;（RAMの一部は、コンピュータ上のハードドライブとして表示されます）にコピーすることができます。このようにソフトウェアは、ソリッド·ステート·ドライブまたはフラッシュメモリに比べて比較的遅い回転のハードディスクドライブにアクセスする必要はありません。このステップでは、大幅にデータセットを処理するのに必要な時間の量を減らします。 </li><li>画像は、透過率のスケールに変換する必要があります。ビームライン8.3.2カスタムBAを持っているckground正規化プラグインは自由に利用可能なソフトウェアパッケージはImageJまたはフィジー（でダウンロードして使用することができ<a href="http://fiji.sc/" target="_blank">http://fiji.sc/</a> ）。これは、画像からダークカウントを減算し、透過率を示す画像を生成するために明るいフィールドで、サンプル画像を正規化します。タコのソフトウェアパッケージ（に正規化されたイメージをロード<a href="http://www.inct.be/en/software/octopus" target="_blank">http://www.inct.be/en/software/octopus</a> ）と指定された処理の手順を実行します（画像を正規化、リングの取り外し使用して、2D生。TIFファイルから3Dデータセットを&quot;再構築&quot; 、サイノグラムの作成、パラレルビーム再構成）。このプロセスは、その後。TIFを横（断面） &quot;ボクセル&quot;（体積画素要素）、X線線吸収係数を表すx、y、z座標と強度値を使用して各成る一連の画像が得られます。 </li></ol> 7。可視化<ol><li> Visualiソフトウェア·パッケージの様々な1の画像のスタックをzeを。フリーウェア（ 例えば Drishti、 <a href="http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtml" target="_blank">http://anusf.anu.edu.au/Vizlab/drishti/index.shtmlは</a> ）ボリュームまたは個々の、または画像のスタック（ 例えば ImageJのか、フィジー）を可視化するために使用することができます。他のソフトウェアパッケージは、3Dビジュアライゼーションに使用することができます。我々の研究グループでは、Avizoソフトウェアパッケージ（使用<a href="http://www.vsg3d.com/avizo/overview" target="_blank">http://www.vsg3d.com/avizo/overviewを</a> ）が、そのようなアミラ（などの他<a href="http://www.amira.com/ " target="_blank">http://www.amira.com/</a> ）とVGStudioMax（ <a href="http://www.volumegraphics.com/" target="_blank">のhttp://www。 volumegraphics.com /が</a> ）も一般的に使用されます。 </li><li>システムメモリにデータセットをロードし、仮想縦横、またはラジアルスライスの向きでサンプルを表示します。なぜなら、データセットの3D属性、samplを通じて仮想スライスeは、関心領域、従来のシリアル光顕微鏡（詳細な例については、1から3作品を参照）を超える大幅な改善と整合する任意の平面で回転させることができます。 </li><li> 3Dで必要に応じてサンプルを視覚化するために、 &quot;セグメント&quot;周囲の組織から血管内腔または他の構造を分離するためにAvizoで半自動とマニュアルした様々なルーチンを使用したサンプル。セグメンテーションは、このように別々の領域にそれらを分離またはセグメント化、興味のあるオブジェクト間の境界を定義することを指します。 3Dのレンダリングのボリュームが可視化ソフトウェアによって実行されます。排出量と吸収量と色は &quot;カラーマップ&quot;を使用して定義することができ、与えられた方向における投影結果であり、これを行う一つの方法は、ボリューム内の各ポイントが発すると光吸収するものと想定されている直接ボリュームレンダリングであり、画面に表示される。あるいは、セグメント化された境界を表すワイヤーフレームまたは3Dメッシュ面はトンの3Dモデルを表示するように構成されている興味のある彼は、構造。 3Dメッシュ、ポリゴンの要素で構成され、要素の総数は、構造再現の忠実度と関連するデータ·ファイルのサイズ（複数の要素、 すなわち 、より高い忠実度が、より大きなファイルサイズにつながる）の両方に影響を与えます。画像処理モジュールは、さまざまな可視化ボリュームレンダリング出力を制御するためのソフトウェアと同様に、画像の明るさ、コントラスト、透明度、ノイズリダクションなどのコントロールで使用可能である、 </li></ol> 8。定量化<ol><li>セグメンテーションが達成されたら、それは例えば、水、空気などのボリューム、長さ、幅、存在下または非存在下で標的植物構造や機能的変化を定量化することが可能である、Brodersen ら （2010）は、定量化するAvizoソフトウェアを使用人づて詰め替え容器内の水滴の体積変化。植物はラ時間を作る四から八時間を超える30分ごとにスキャンされた詰め替え容器のPSEのシーケンス。各スキャンはそのボリュームが増加するにつれて、個々の液滴を経時的に測定したAvizoへと再構築され、ロードされました。 </li></ol>

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我々は、開示することは何もない。

Synchotron HRCTは信じられないほど詳細に植物脈管構造の内部の仕組みを探求するための強力な、非破壊ツールで植物学者が用意されています。この接続性が大幅に広がる血管の病原体や塞栓の能力を変えることができる-この技術は差動で、様々なブドウの種（。マスコミでBrodersen ら 2012b）に木部のネットワーク接続を変更するブドウの木部に以前に記述されていない解剖学的構?...

相互接続された導管は、繊維、生活、代謝活性を有する細胞のネットワーク - 水は植物の根から木部と呼ばれる血管組織内の葉に輸送される。植物の木部の輸​​送機能は、光合成、成長し、最終的には生存のために葉に栄養分と水を供給するために維持されなければならない。木部ネットワークが病原性微生物によって感染されるとき木部導管内の水輸送が停止することがあります。このような感染症の植物への応答であることが多い（; 2010 例えば McElroneら2008）病原体の広がりを単離するための手段として、ゲル剤、ガム、およびチロースを生成します。干ばつストレスも木部の水輸送を制限することができます。植物が長引く​​干ばつ時の水を失うように、緊張が木部樹液で構築されています。緊張下に水が（ すなわち 、特定のしきい値にテンションが木部導管体に含まれる水分の列をキャビテーションのに十分大きくなる）準安定である。キャビテーションが発生した後、気泡（塞栓症）は、condを形成し、埋めることができますUIT、効果的にブロックして水の動き（タイリーとスペリー1989）、深海ダイバーにおける減圧症（ すなわち、 &quot;曲がる&quot;）に類似現象。 このトピックに関する歴史と現代文学（タイリー·ツィンマーマン、2002;ホルブルックら 、2005）の広大なボディにより実証されるように最適な植物関数の木部水輸送の重要性にもかかわらず、とらえどころのないまま木部ネットワークの局面がまだあります。いくつかの研究グループは、最近、細かい木材解剖学の詳細や血管組織（ 例えばメイヨーらを評価するために高分解能X線CTマイクロトモグラフィー（HRCT）を利用し始めて、2010年、2008;マネスら2010;。Brodersenら2010。 、2011、2012A、B;前田、三宅、2009;草原ら、2004）。 HRCTはソリッドオブジェクトの内部の特徴を可視化し、その3次元構造特性に関するデジタル情報を取得するために使用される非破壊法である。 HRCTでも高密度オブジェクトに対して、サイ​​ズがミクロンのような小さな細部を解決する能力に従来の医療のCATスキャンとは異なります。シンクロトロンHRCT技術における最近の進歩は、充分に植物の血管網とintervessel接続が可視化できること対雑音比が改善された画像の解像度と信号があり、割り当てられた3次元座標、油圧モデルシミュレーションのためにエクスポート。 Brodersen ら （2011）は最近、自動的に従来の解剖学的方法（シリアルすなわちミクロトームで切片とこれまで可能であったよりもはるかに高い解像度で木部ネットワークからデータを抽出し、FortranのモデルとシンクロHRCTによって生成された3D再構成を組み合わせることで、このテクニックを進め光学顕微鏡で、画像キャプチャ、 例えばツィンマーマン1971）。この作品はまた、いくつかのVeの木部システムの油圧モデルと輸送の特定された固有の特性（ すなわち、逆の流れを最適化するために使用されているピーク蒸散の期間中ssels）（Lee ら 、レビューで）。 シンクロトロンHRCTは現在木部機能、キャビテーションに対する感受性、および塞栓導管を修復する植物の能力を視覚化するために使用することができます。塞栓導管内の再確立の流れに障害が発生すると、油圧能力、限界の光合成、極端な場合には植物の死の結果（マクダウェルら 2008）が軽減されます。植物は、隣接する機能導管を介して接続するピットの閉塞の周りの水を流用して、失われた油圧能力に代わる新しい木部を成長させることにより塞栓に対処することができます。いくつかの植物は水の列の切れ目を修復する能力を持っているが、緊張下の木部のこのプロセスの詳細は、何十年も不明であった。 Brodersen ら （2010）は最近、可視化とHRCTを使用してライブブドウの補充プロセスを定量化した。詰め替え成功した容器は、キシルを取り巻く生細胞からの水の流入に依存していたemの個々の水滴が時間の経過とともに拡大導管、いっぱい血管、閉じ込められた気体の溶解を余儀なくされた。さまざまな植物の能力が損なわ木部血管を修復すると、これらの修理を制御するメカニズムは、現在検討されている。 ALSのビームライン8.3.2施設の説明これまでの我々の仕事は、ローレンス·バークレー国立研究所（バークレー米国カリフォルニア州）での高度な光源で硬X線マイクロトモグラフィービームライン8.3.2で行われている。植物試料は11.5 keVの重要なエネルギーで高度な光源電子蓄積リングの運転中に双極子6テスラ超電導曲げ磁石によって生成され、X線源から20メートルの場所に位置し、鉛ライニングハッチ内に配置されます。エンドステーションの概略を図1に示します。 X線は40倍のビームサイズ〜4.6ミリメートルとハッチを入力し、電動回転ステージ上に載置された試料を通過します。ザ透過したX線画像収集用のCCDにレンズを介して中継される可視光にX線を変換結晶シンチレータ（一般的に使用される2つの材料がLuAGまたはCdWO 4アール ）に衝突。カメラ、シンチレータと光学系は、サンプル·ツー·シンチレータ距離が位相コントラストイメージングのために最適化することができますレールの上で光タイトボックスに含まれています。 すべてのサンプルは、順番に、試料の位置決めのための水平方向および垂直方向の変換ステージに搭載されている直径10cm回転ステージ上に搭載されている。カスタム構築された植物のポットホルダー、アクリル管に含まれる葉に搭載された根系を持つ生きた植物試料は、 図2で見ることができます。典型的な露光時間は、秒10から18 keVの使って0.1から1の範囲で指定でき、スキャンの持続時間は、特定のサンプルのために最適化した設定に応じて5から40分の範囲であろう。背の高いサンプル（植物の木部·ネットワークの典型的な例）、データスキャンができるため〜10cmの最大試料高さに沿ってシームレスな連続切片を可能にする、自動制御され、異なる高さでのサンプルで測定を繰り返すことで、タイル張り。 4.5μmの分解能でイメージングは​​、縦向きでほぼ完璧なサンプルについて〜1cmで最大サンプル幅。データの生成と処理は、以下に記載されているプロトコルを使用して完了します。なぜなら空気と水の間のX線減衰の違いのため、優れた画像コントラストは医療用CTシステムの典型的なコントラストのソリューションを使用せずに植物を得ることができる。空気で満たされた血管内腔は、水和した植物の周囲の水で満たされた組織から容易に区別される。

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Material Name/Equipment </td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td>See specifics listed above regarding equipment at the Advanced Light Source beamline 8.3.2</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

using high resolution computed tomography to visualize the three dimensional structure and function of plant vasculature

高分解能X線CT（HRCT）が（ 例えば Brodersen ら三次元（3D）で植物の木部ネットワークの構造と機能を評価するために使用されているサブミクロンの分解能を持つ非破壊画像診断法である、2010年、2011年、2012A、B）。 HRCTイメージングは​​医療用CTシステムと同じ原理に基づいていますが、より高い空間分解能で高輝度シンクロトロンX線源の結果と画像取得時間を減少させる。ここでは、Avizoソフトウェアとの組み合わせでHRCT（アドバンスト光源 - LBNLバークレー、カリフォルニア州、米国で実施）（VSG社、バーリントン、マサチューセッツ州、米国）が中の植物の木部を探索するためにどのくらい使われているシンクロトロンベースで詳細に実証切除した組織と生きた植物。この新しいイメージングツールは、ユーザーが従来の静的、2D光または任意の平面で仮想シリアルセクションを使用して電子顕微鏡写真および研究サンプルを越えて移動することができます。任意の方向cのスライスの数が無限同じサンプル、伝統的な顕微鏡法を用いて物理的に不可能である機能で行うこと。 結果はHRCTは草本と木本植物種、植物器官の範囲（ すなわち 、葉、葉柄、茎、幹、根）の両方に適用することができることを実証している。数値は代表プラント血管解剖や海岸レッドウッド（ セコイア ）、くるみ（ クルミ属属）、オーク（ コナラ属のもの）、メープルのためにスキャンを含むHRCTデータセットから抽出された細部の型の範囲の両方を実証する手助けここに提示され（ エイサー属）ヒマワリ（ ヒマワリ ）、ブドウ（ ヴィティス属）、シダ（ ワラビとコモチシダ属fimbriata）への苗木。木本種から摘出し、乾燥させたサンプルは、スキャンして、一般的に最良の画像を得ることが最も簡単である。しかし、最近の改善は（ つまり、より迅速なスキャンとサンプルの安定）それはPOSS作った緑色組織（ 例えば葉柄）にと生きた植物では、この可視化技術を使用してible。機会に水和した緑の植物組織のいくつかの収縮は画像がぼやけてしまいますと、これらの問題を回避するための方法が記載されている。 HRCTでこれらの最近の進歩は、プラント血管機能に有望な新しい洞察を提​​供します。

Synchotron HRCTスキャンが正常にビームライン8.3.2（ 図5）を用いて植物組織や種の多種多様な上に実装されており、3Dで前例のない解像度で植物の木部の構造と機能に新たな洞察を提供してきました。 3D再構成（、 図6-8に示す、そして作品1-3）が提供する可視化と探査能力は両方摘出試料上と生きた植物における木部ネットワークとの構造の位置と方向の?...

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Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature | Biology | Video

Using High Resolution Computed Tomography to Visualize the Three Dimensional Structure and Function of Plant Vasculature

高分解能X線CT（HRCT）が3Dで植物の血管系の構造と機能を研究するために使用することができる非破壊画像診断法である。我々は、HRCTは植物組織や種の広い範囲にわたって木部ネットワークの探索を容易にする方法を示しています。

プラントの脈管構造の三次元構造と機能を可視化するために、高分解能CTを用いた

High resolution x-ray computed tomography (HRCT) is a non-destructive diagnostic imaging technique with sub-micron resolution capability that is now being ...

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20.9K ビュー.  U.S. Department of Agriculture. 高分解能X線CT（HRCT）が3Dで植物の血管系の構造と機能を研究するために使用することができる非破壊画像診断法である。我々は、HRCTは植物組織や種の広い範囲にわたって木部ネットワークの探索を容易にする方法を示しています。

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Hi-C: A Method to Study the Three-dimensional Architecture of Genomes.

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, into close spatial proximity 2-6. Deciphering the relationship between chromosome organization and genome activity will aid in understanding genomic processes, like transcription and replication. However, little is known about how chromosomes fold. Microscopy is unable to distinguish large numbers of loci simultaneously or at high resolution. To date, the detection of chromosomal interactions using chromosome conformation capture (3C) and its subsequent adaptations required the choice of a set of target loci, making genome-wide studies impossible 7-10.
We developed Hi-C, an extension of 3C that is capable of identifying long range interactions in an unbiased, genome-wide fashion. In Hi-C, cells are fixed with formaldehyde, causing interacting loci to be bound to one another by means of covalent DNA-protein cross-links. When the DNA is subsequently fragmented with a restriction enzyme, these loci remain linked. A biotinylated residue is incorporated as the 5' overhangs are filled in. Next, blunt-end ligation is performed under dilute conditions that favor ligation events between cross-linked DNA fragments. This results in a genome-wide library of ligation products, corresponding to pairs of fragments that were originally in close proximity to each other in the nucleus. Each ligation product is marked with biotin at the site of the junction. The library is sheared, and the junctions are pulled-down with streptavidin beads. The purified junctions can subsequently be analyzed using a high-throughput sequencer, resulting in a catalog of interacting fragments.
Direct analysis of the resulting contact matrix reveals numerous features of genomic organization, such as the presence of chromosome territories and the preferential association of small gene-rich chromosomes. Correlation analysis can be applied to the contact matrix, demonstrating that the human genome is segregated into two compartments: a less densely packed compartment containing open, accessible, and active chromatin and a more dense compartment containing closed, inaccessible, and inactive chromatin regions. Finally, ensemble analysis of the contact matrix, coupled with theoretical derivations and computational simulations, revealed that at the megabase scale Hi-C reveals features consistent with a fractal globule conformation.

The Hi-C method allows unbiased, genome-wide identification of chromatin interactions (1). Hi-C couples proximity ligation and massively parallel sequencing. The resulting data can be used to study genomic architecture at multiple scales: initial results identified features such as chromosome territories, segregation of open and closed chromatin, and chromatin structure at the megabase scale.

ハイC：ゲノムの三次元構造を研究する方法。

The three-dimensional folding of chromosomes compartmentalizes the genome and and can bring distant functional elements, such as promoters and enhancers, ...

生物学

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

精製された野生型および変異型CFTRタンパク質の機能的再構成とチャネル活性の測定

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

結晶セルロース蓄積中の高解像度の定量化<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;ルーツは、組織特異的な細胞壁の変更を監視します

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

High-resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function in Permeabilized and Intact Cells

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in biological samples (intact and permeabilized cells, tissues or isolated mitochondria). The high-resolution oxygraph device is equipped with two chambers and uses polarographic oxygen sensors to measure oxygen concentration and calculate oxygen consumption within each chamber. Oxygen consumption rates are calculated using software and expressed as picomoles per second per number of cells. Each high-resolution oxygraph chamber contains a stopper with injection ports, which makes it ideal for substrate-uncoupler-inhibitor titrations or detergent titration protocols for determining effective and optimum concentrations for plasma membrane permeabilization. The technique can be applied to measure respiration in a wide range of cell types and also provides information on mitochondrial quality and integrity, and maximal mitochondrial respiratory electron transport system capacity.

High-resolution respirometry is used to determine mitochondrial oxygen consumption. This is a straightforward technique to determine mitochondrial respiratory chain complexes&#39; (I-IV) respiratory rates, maximal mitochondrial electron transport system capacity, and mitochondrial outer membrane integrity.

透過処理と無傷の細胞でミトコンドリア機能を評価するために高解像度呼吸計測

A high-resolution oxygraph is a device for measuring cellular oxygen consumption in a closed-chamber system with very high resolution and sensitivity in ...

High-resolution Respirometry to Measure Mitochondrial Function of Intact Beta Cells in the Presence of Natural Compounds

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role in the body by controlling blood glucose levels through insulin secretion in response to elevated glucose concentrations. Insulin secretion is controlled by glucose metabolism and mitochondrial respiration. Therefore, measuring intact beta cell respiration is essential to be able to improve beta cell function as a treatment for diabetes. Using intact 832/13 INS-1 derived beta cells we can measure the effect of increasing glucose concentration on cellular respiration. This protocol allows us to measure beta cell respiration in the presence or absence of various compounds, allowing one to determine the effect of given compounds on intact cell respiration. Here we demonstrate the effect of two naturally occurring compounds, monomeric epicatechin and curcumin, on beta cell respiration under the presence of low (2.5 mM) or high glucose (16.7 mM) conditions. This technique can be used to determine the effect of various compounds on intact beta cell respiration in the presence of differing glucose concentrations.

The goal of this protocol is to measure the effect of glucose-mediated changes to mitochondrial respiration in the presence of natural compounds on intact 832/13 beta cells using high-resolution respirometry.

天然化合物の存在下でそのまま β 細胞のミトコンドリア機能を測定するための高解像度の呼吸

High-resolution respirometry allows for the measurement of oxygen consumption of isolated mitochondria, cells and tissues. Beta cells play a critical role ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

ゼブラフィッシュ ランゲルハンス島における単一セルの解像度カルシウム イメージングを用いた β-細胞機能の解析

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

インタクトオルガノイドの単一細胞分解能3次元イメージング

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography (Micro-CT) Imaging Method

Reports show that prolonged exposure to a spaceflight environment produces morphologic and functional ophthalmic changes in astronauts during and after an International Space Station (ISS) mission. However, the underlying mechanisms of these spaceflight-induced changes are currently unknown. The purpose of the present study was to determine the impact of the spaceflight environment on ocular structures by evaluating the thickness of the mouse retina, the retinal pigment epithelium (RPE), the choroid and the sclera layer using micro-CT imaging. Ten-week-old C57BL/6 male mice were housed aboard the ISS for a 35-day mission and then returned to Earth alive for tissue analysis. For comparison, ground control (GC) mice on Earth were maintained in identical environmental conditions and hardware. Ocular tissue samples were collected for micro-CT analysis within 38(&#177;4) hours after splashdown. The images of the cross-section of the retina, the RPE, the choroid, and the sclera layer of the fixed eye was recorded in an axial and sagittal view using a micro-CT imaging acquisition method. The micro-CT analysis showed that the cross-section areas of the retina, RPE, and choroid layer thickness were changed in spaceflight samples compared to GC, with spaceflight samples showing significantly thinner cross-sections and layers compared to controls. The findings from this study indicate that micro-CT evaluation is a sensitive and reliable method to characterize ocular structure changes. These results are expected to improve the understanding of the impact of environmental stress on global ocular structures.

Assessment of Global Ocular Structure Following Spaceflight Using a Micro-Computed Tomography Micro-CT Imaging Method

We present a protocol using high-resolution micro-computed tomography imaging to determine whether spaceflight induced damage on ocular structures. The protocol shows the micro-CT-derived measurement of ex vivo rodent ocular structures. We demonstrate the ability to assess ocular morphological changes following spaceflight using a non-destructive tridimensional technique to evaluate ocular damage.

マイクロコンピュータ断層撮影法による宇宙飛行後の全球眼構造の評価

Reports show that prolonged exposure to a spaceflight environment produces morphologic and functional ophthalmic changes in astronauts during and after an ...

Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory's High Flux Isotope Reactor

Neutrons have historically been used for a broad range of biological applications employing techniques such as small-angle neutron scattering, neutron spin echo, diffraction, and inelastic scattering. Unlike neutron scattering techniques that obtain information in reciprocal space, attenuation-based neutron imaging measures a signal in real space that is resolved on the order of tens of micrometers. The principle of neutron imaging follows the Beer-Lambert law and is based on the measurement of the bulk neutron attenuation through a sample. Greater attenuation is exhibited by some light elements (most notably, hydrogen), which are major components of biological samples. Contrast agents such as deuterium, gadolinium, or lithium compounds can be used to enhance contrast in a similar fashion as it is done in medical imaging, including techniques such as optical imaging, magnetic resonance imaging, X-ray, and positron emission tomography. For biological systems, neutron radiography and computed tomography have increasingly been used to investigate the complexity of the underground plant root network, its interaction with soils, and the dynamics of water flux in situ. Moreover, efforts to understand contrast details in animal samples, such as soft tissues and bones, have been explored. This manuscript focuses on the advances in neutron bioimaging such as sample preparation, instrumentation, data acquisition strategy, and data analysis using the High Flux Isotope Reactor CG-1D neutron imaging beamline. The aforementioned capabilities will be illustrated using a selection of examples in plant physiology&#160;(herbaceous plant/root/soil system)&#160;and biomedical applications&#160;(rat femur and mouse lung).

Neutron Radiography and Computed Tomography of Biological Systems at the Oak Ridge National Laboratory&#039;s High Flux Isotope Reactor

This manuscript describes a protocol for neutron radiography and computed tomography of biological samples using a High Flux Isotope Reactor (HFIR) CG-1D beamline to measure a metal implant in a rat femur, a mouse lung, and an herbaceous plant root/soil system.

オークリッジ国立研究所の高フラックス同位体原子炉における中性子ラジオグラフィーと生体システムのコンピューター断層撮影

Neutrons have historically been used for a broad range of biological applications employing techniques such as small-angle neutron scattering, neutron ...

Construction of a Realistic, Whole-Body, Three-Dimensional Equine Skeletal Model using Computed Tomography Data

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches have rarely been used to study equine athletic injury. Degenerative osteoarthritis caused by mechanical stress can originate from chronic postural dysfunction, which, because the primary dysfunction is often distant from the site of tissue injury, is best identified through modeling whole-body biomechanics. To characterize whole-body equine kinematics, a realistic skeletal model of a horse was created from equine computed tomography (CT) data that can be used for functional anatomical and biomechanical modeling. Equine CT data were reconstructed into individual three-dimensional (3D) data sets (i.e., bones) using 3D visualization software and assembled into a complete 3D skeletal model. The model was then rigged and animated using 3D animation and modeling software. The resulting 3D skeletal model can be used to characterize equine postures associated with degenerative tissue changes as well as to identify postures that reduce mechanical stress at the sites of tissue injury. In addition, when animated into 4D, the model can be used to demonstrate unhealthy and healthy skeletal movements and can be used to develop preventative and rehabilitative individualized therapies for horses with degenerative lamenesses. Although the model will soon be available for download, it is currently in a format that requires access to the 3D animation and modeling software, which has quite a learning curve for new users. This protocol will guide users in (1) developing such a model for any organism of interest and (2) using this specific equine model for their own research questions.

The purpose of this protocol is to describe the method of creation of a realistic, whole-body, skeletal model of a horse that can be used for functional anatomical and biomechanical modeling to characterize whole-body mechanics.

コンピュータ断層撮影データを用いたリアルな全身3次元馬骨格モデルの構築

Therapies based upon whole-body biomechanical assessments are successful for injury prevention and rehabilitation in human athletes. Similar approaches ...