この研究は、米国立衛生研究所（NIH）助成金R01 EB008268によってサポートされていました。

1。チップ製造12 <ol><li>ゼオネックス690Rペレットから2プラークを作る：5分間198℃で加熱したプレスで金属板、予熱の中心に均等に8〜9グラムゼオネックスペレットを配布し、その後、別の5分間2500 psiに徐々に圧力をかける。この手順を完了するために、我々はカーバーホットプレスを使用していました。 </li><li>エポキシモールドとプラーク中の微小流体チャネルをエンボス。金型製作についての詳細は、別の場所で12（ 図2bのチャネル設計）で概説されています：エポキシモールドに1歯垢を入れ、次に157で加熱プレスで予熱それら℃で10分間とは別の10分間ゆっくりで1,000 psiに圧力をかける。手で型から歯垢を除去するか、またはそれが冷える前にトングを使用しています。 （ 注：このステップの間に熱手袋を着用してください。） </li><li>エンボス加工された入口のチップ、廃棄ポート、および微小流体流路の出口に穴を開けます。私たちは、1.25ミリメートルの直径を使用三つの穴を作るためにドリルビットをeter。 </li><li>ボンド別のプラーク（一番上）をエンボス加工チップは：;もう、350 psiで押した後、10分間131℃で加熱したプレスで空気乾燥、予熱それらをとIPA、RNアーゼアウェイ、シーケンス内の脱イオン水を用いてチップを洗う10分。 </li><li>入口、廃棄物、別にJBウェルドエポキシを使用して出口ポートでNanoportsを取り付け、メーカーの指示に従って15から24時間で硬化。 </li><li> 100μlのヌクレアーゼフリー水で続くアウェイ50μlのRNaseを使用するSPEのチャネルを、すすいでください。 </li><li>接ぎ木溶液（3％（w / v）のベンゾフェノンとメチルメタクリレート）の4μlのSPEチャンネルをロードし、次に365nmのUV波長および2000 mJ / cm 2以下でUVオーブンで10分間インキュベートすることにより、メチルメタクリレートを架橋。真空の残留移植溶液を除去します。私たちは壁の真空を使用していました。最良の結果を得るには、新鮮な溶液を使用する必要があります。それは、保存するために、しかし、通常許容され最大一週間、4℃で調製した溶液。 </li><li> SPEカラム液（すべてのv / v％）で作る：16％エチレンジメタクリレート、24％ブチルメタクリレート、42％1 - ドデカノール、18％のシクロヘキサノール、1％2 - ジメチルアミノ-4 - （メチルアミノ） - フェノール追加光開始剤として。 </li><li> SPEカラム溶液（1:1混合物を作るために）としてシリカ微小液の同じボリュームを取り出し、完全に真空オーブン中で70℃で一晩でそれを乾燥させてください。蓋を閉じた状態でチューブをタップすることで、ペレットを破る。混ぜて乾燥させたシリカ微小球管と渦にSPEカラム溶液を加える。 </li><li>同じチャンネルに、SPE溶液4μlをロードしてから、2.5分間UV照射によってそれを架橋する。次に、上にチップを反転し、さらに2.5分間照射します。重合SPEカラムは不透明な白色の固体でなければならない。 </li><li>過剰反応物質を洗い流すために100％メタノール500μlのチャンネルを洗う。この洗浄はまたイントラポリマーpoを削除rogenic溶剤、周囲条件で乾燥したときに、それによってSPEカラムの開いた細孔構造を作成する。 </li><li>熱伝導テープでチップの底に2つの薄膜ヒーターを取り付けます。ヒーターの側面は別々に変性とアニーリングのための広いチャネル（ 図1を参照）のエッジに位置合わせする必要があります。 </li><li>死者を介してチップに5箇所の熱電対（ 図2bを参照）、各チップの開放側チャネルを終了しました。熱電対は、プレスフィットを介してこれらのチャネルでご利用いただけます。テープは、さらに熱電対の位置を固定するために使用された。 </li></ol> 2。固相抽出法<ol><li> DEPC処理及びオートクレーブ処理水（脱イオン水またはミリポア濾過された）での70％エタノールを96μlを準備します。 </li><li> 1チューブ内での70％エタノールを96μlにセキュア25X RNAの4μlを追加し、別々のチューブに100％エタノールで同じ混合物を複製します。 </li><li> 300を準備以下を混合することにより、チャンネルバッファの液：6 Mグアニジンチオシアネート（GuSCN）75μlの、2 - プロパノール、ヌクレアーゼフリー水63μL、およびSecure 25X RNAを12μlの150μlの。 </li><li> 6 M GuSCN、2 - プロパノールを200μl、12μlの25X RNAを100μlの安全性：混合による溶解緩衝液312μlを準備します。 </li><li> RNAのセキュアをアクティブにするには10〜20分間60℃での70％エタノールを加熱し、100％エタノール、チャネルバッファと溶解バッファー。 </li><li>マイクロ流体チャネルを平衡状態にし、0.8ミリリットル/ hrの流量で、SPEチャネルを通してチャネル·バッファを実行します。 </li><li>水浴中で37℃でVTMでテストサンプルを迅速に融解し、できるだけ早く、それが解凍されると水槽から直ちに試料を取り出す。 </li><li> 10分間、13,000 rpmで遠心し、溶解緩衝液300μlに100μlの上清を移す。 1μg/μLのキャリアRNAの6μlを添加して混合物を完了します。 </li><li>ミックスする渦、とのスピンの後5秒は、ルアーロック1ccのシリンジに全体ライセートをロードします。 </li><li> 0.8ミリリットル/ hrの流量で、SPEチャネルを通じてライセートを実行します。 </li><li> 1ミリリットル/ hrで100μlのof100％エタノールに続く70％エタノール100μlのSPEのチャネルを、洗ってください。 （押し出されないでしょうシリンジ先端で50μlのデッドボリュームがありますので、実際には50μlのは、チャネルを通過している。） </li><li> 0.5 mlのマークに空の注射器を置き、1ミリリットル/ hrでそれを乾燥させるためにチャネルを介して空気を押してください。 </li><li> 0.5ミリリットル/ hrで結合した核酸を溶出させ、廃港でnanoportから13.5μlを収集するためにチャネルを介しヌクレアーゼフリー水67.5μlを実行します。 （流体損失はシリンジの先端およびSPEチャネルで54μlのデッドボリュームによるものです。） </li></ol> 3。 RT-PCR法<ol><li>キアゲンワンステップRT-PCRキットの試薬を用いて、空気乾燥工程（2.12）の間に、RT-PCRマスターミックスを36.5μlを準備します。 </li><li> RT-PCをロードRは廃港でnanoportの試薬、およびRNAと混合以下50μlのRT-PCR反応を得るために：ヌクレアーゼフリー水、4μlを、RT-PCR酵素ミックスを、10μlのQの溶液、10μl1X1で13.5μlの溶出したRNAをステップバッファー、2μlの25 mMのMgCl 2、1μlの50μMのフォワードプライマー5&#39;-GAC CRA TCCは、TGT CACは、CTCのTGA C-3 &#39;、1μlの50μMのリバースプライマー5&#39;-AGG GCA TTY TGG ACA AAK CGT CTA-3 &#39;、2μlのdNTPを、0.75μlの1.0パーセントw / vのBSA、0.73μlのPEG8000と5.02μlのヌクレアーゼフリー水。 </li><li>穏やかな真空によってRTのチャネル（私たちは壁の真空を使用）に、RT-PCR混合物をロードして、閉じたフィッティングとNanoportを封印。 </li><li>ヒーター1から35 Vを印加します。ヒーター1は50℃で平衡化した後に30分間、RTチャネル内の試薬を保つ95℃でヒータ1平衡後15分℃の室温チャネル内の試薬を保つ</li><li>ヒーター1、ヒーター2から50 Vまで27 Vを印加し、60＆ドで約3分またはヒータ1平衡化するまでの待ちgであり、Cとヒーター95℃2℃の平衡</li><li> 0.5μl/分でPCRチャンネルに試薬を押し込みます。試薬が蛇行流路を通って流れることは約20分を取る必要があります。 </li><li>サンプルが蛇行流路の端に表示されるようになるように、適切な大きさのピペットチップを使用して出口でPCR産物を収集します。 </li></ol> 4。 PCR産物検出<ol><li>我々は製品を検出するために、Agilentの高感度DNAテストを使用しています。このテストを実行するには、テストの前に冷蔵庫で30分からAgilent高感度DNAキットを取り出します。 </li><li>バイオアナライザの電源をオンにして、2100エキスパートソフトウェアを開きます。 </li><li>テスト版（testing）へのPCR産物1μlをロードおよびAgilentプロトコル（フォロー<a href="http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent%20Manual.pdf" target="_blank">http://gcf.pbrc.edu/docs/Agilent/Agilent％の20Manual.pdfを</a> ）。 </li><li>データを分析し、記録します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Nicholls, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandemic+Influenza:+The+Inside+Story.">Pandemic Influenza: The Inside Story.</a> PLoS Biol. 4, (2006).</li><li>Wenzel, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+performance+determination+and+clinical+validation+of+the+novel+roche+realtime+ready+influenza+A/H1N1+detection+set.">Analytical performance determination and clinical validation of the novel roche realtime ready influenza A/H1N1 detection set.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48, 3088-3094 (2010).</li><li>Chan, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+sensitivity+of+rapid+influenza+antigen+detection+tests+for+swine-origin+influenza+virus+(H1N1.">Analytical sensitivity of rapid influenza antigen detection tests for swine-origin influenza virus (H1N1.</a> Journal of Clinical Virology: the. 45, 205-207 (2009).</li><li>Ginocchio, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+multiple+test+methods+for+the+detection+of+the+novel+2009+influenza+A+(H1N1)+during+the+New+York+City+outbreak.">Evaluation of multiple test methods for the detection of the novel 2009 influenza A (H1N1) during the New York City outbreak.</a> Journal of. 45, 191-195 (2009).</li><li>Aeron, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+influenza+rapid+point-of-care+tests+in+the+detection+of+swine+lineage+A(H1N1)+influenza+viruses.">Performance of influenza rapid point-of-care tests in the detection of swine lineage A(H1N1) influenza viruses.</a> Influenza and Other Respiratory Viruses. 3, 171-176 (2009).</li><li>Takahashi, H., Otsuka, Y., Patterson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+tests+for+influenza+and+other+respiratory+viruses:+determining+performance+specifications+based+on+clinical+setting.">Diagnostic tests for influenza and other respiratory viruses: determining performance specifications based on clinical setting.</a> Journal of Infection and Chemotherapy. 16, 155-161 (2010).</li><li>Selvaraju, S. B., Selvarangan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+Three+Influenza+A+and+B+Real-Time+Reverse+Transcription-PCR+Assays+and+a+New+2009+H1N1+Assay+for+Detection+of+Influenza+Viruses.">Evaluation of Three Influenza A and B Real-Time Reverse Transcription-PCR Assays and a New 2009 H1N1 Assay for Detection of Influenza Viruses.</a> Journal of Clinical Microbiology. 48, 3870-3875 (2009).</li><li>Northrup, M. A., Ching, M. T., White, R. M., Watson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Transducer'93, seventh international conference on solid state sensors and actuators. , 924-926 (1993).</li><li>Bhattacharyya, A., Klapperich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoplastic+microfluidic+device+for+on-chip+purification+of+nucleic+acids+for+disposable+diagnostics.">Thermoplastic microfluidic device for on-chip purification of nucleic acids for disposable diagnostics.</a> Analytical Chemistry. 78, 788-792 (2006).</li><li>Cao, Q., Kim, M. -. C., Klapperich, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plastic+microfluidic+chip+for+continuous-flow+polymerase+chain+reaction:+Simulations+and+experiments.">Plastic microfluidic chip for continuous-flow polymerase chain reaction: Simulations and experiments.</a> Biotechnology Journal. 6, 177-184 (1002).</li><li>Cao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Chip+for+Molecular+Amplification+of+Influenza+A+RNA+in+Human+Respiratory+Specimens.">Microfluidic Chip for Molecular Amplification of Influenza A RNA in Human Respiratory Specimens.</a> PLoS ONE. 7, e33176 (2012).</li><li>R&#229;dstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+Characterization+of+PCR-Inhibitory+Components+in+Blood+Cells.">Purification and Characterization of PCR-Inhibitory Components in Blood Cells.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 485-493 (2001).</li><li>Boddinghaus, B., Wichelhaus, T. A., Brade, V., Bittner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Removal+of+PCR+Inhibitors+by+Silica+Membranes:+Evaluating+the+Amplicor+Mycobacterium+tuberculosis+Kit.">Removal of PCR Inhibitors by Silica Membranes: Evaluating the Amplicor Mycobacterium tuberculosis Kit.</a> J. Clin. Microbiol. 39, 3750-3752 (2001).</li><li>Andreasen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+microRNA+quantification+in+total+RNA+from+clinical+samples.">Improved microRNA quantification in total RNA from clinical samples.</a> Methods. 50, S6-S9 (2010).</li></ol>

著者らは競合する経済的利益を宣言していない。

診断方法は、高い特異性と低い検出限界を持つ患者検体からインフルエンザRNAを増幅するための統合されたマイクロ流体プラスチックチップの能力を実証してここで紹介する13我々は、ケア検査の潜在的な点については、このチップを設計した：（a）温度と流体制御が簡素化された、（b）のチップは、低コストおよび射出成形を用いた高スループットの製造に適しており、（c）のチ...

数百万人の死者は、20世紀1の3つのインフルエンザのパンデミックの間に報告されている。また、最新のインフルエンザの大流行は2009年に世界保健機関（WHO）2によって宣言された、とのように2010年8月1日の、18449人の死亡がWHOの3によって報告されました。このパンデミックは再び感染症の高負荷、高速疾患の確認、適切な公衆衛生対応と効果的な治療4を有効にするには 、インフルエンザの迅速かつ正確な検出のための必要性を示した。 広くインフルエンザを診断するために使用されるいくつかの方法があり、これらは急速イムノアッセイ、直接蛍光抗原検査（DFA）とウイルス培養方法を挙げることができる。他の2つの方法は労働集約的で時間9消費している間に急速なイムノアッセイは劇的に、感度5-8を欠いている。分子テストは高いsensit、短いターンアラウンド時間を含む複数の利点を提供ivity、高い特異性。いくつかの商業団体は、感染症のための速い分子テスト（とも呼ばれる核酸テストやNAT）に向かって取り組んできており、いくつかは彼らのパイプラインでインフルエンザアッセイを持っています。しかしそれらのほとんどは、オフチップのサンプル調製を必要とします。分子テストはアッセイ用カートリッジまたはモジュールに試料調製を組み込む放棄臨床検査改善修正法（CLIA）のなし。 ラボオンチップ技術は、ポイント·オブ·ケア検査装置の開発に重要な役割を果たしている。 1993年10における第1のPCRチップの導入後、数々の努力が核酸テストチップの開発に置かれている。しかし、これらは数が限られて下流の増幅を伴う原油試料調製を統合した。 我々は以前プラスチックマイクロ流体チップ11に固相抽出カラム（SPE）の小型化を実証し、開発しました連続した流れのPCRチップ12のリーメントと最適化。ここでは、臨床診断のための単一のチップにRTおよびPCR手順でSPEを統合し、患者の鼻咽頭（NP）スワブおよび吸引液から核酸を増幅するために、その能力を実証するために前作を拡張します。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬/材料の名称 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td></tr><tr><td> 1 - ドデカノール</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州</td><td> 443816-500G </td></tr><tr><td> 2,2 - ジメトキシ-2 - フェニルアセトフェノン</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州</td><td> 196118-50G </td></tr><tr><td> 2100バイオアナライザ</td><td> Agilent Technologiesは、カリフォルニア州サンタクララ</td><td> G2943CA </td></tr><tr><td> 2 - プロパノール</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州</td><td> 19516 </td></tr><tr><td>ベンゾフェノン</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州</td><td> 239852-50G </td></tr><tr><td> BSA </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、pittsburge、ペンシルバニア</td><td> A7979-50ML </td></tr><tr><td>メタクリル酸ブチル</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州</td><td> 235865-100 ml </td></tr><tr><td>キャリアRNA </TD&gt; <td>キアゲン、バレンシア、カリフォルニア州</td><td> 1017647 </td></tr><tr><td>シクロヘキサノール</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州</td><td> 105899-1L </td></tr><tr><td>エタノール</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州</td><td> E7023 </td></tr><tr><td>エチレンジメタクリレート</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州</td><td> 335861 </td></tr><tr><td>エチレングリコールジメタクリレート</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州</td><td> 335681-100ML </td></tr><tr><td>ガラスシリンジを250μl </td><td>ハミルトン、リノ、ネバダ州</td><td> 81127 </td></tr><tr><td>チオシアン酸グアニジン</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州</td><td> 50981 </td></tr><tr><td>高感度DNAキット</td><td> Agilent Technologiesは、カリフォルニア州サンタクララ</td><td> 5067-4626 </td></tr><tr><td>ホットプレス</td><td>カーバー、ウォバシュ、IN </td><td> 4386 </td></tr><tr><td> JBウェルドエポキシ</td><td>マクマスター-Caのrrは、エルムハースト、イリノイ州</td><td> 7605A11 </td></tr><tr><td>ルアーロックシリンジ</td><td> BD-医療、フランクリンレイクス、ニュージャージー州</td><td> 309628 </td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、pittsburge、ペンシルバニア</td><td> AB-0359 </td></tr><tr><td>メタノール</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州</td><td> 494437 </td></tr><tr><td>メタクリル酸メチル</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州</td><td> M55909 </td></tr><tr><td> Nanoport </td><td>アップチャーチ·サイエンティフィック</td><td> N-333から01 </td></tr><tr><td> Nanoportフィッティング</td><td>アップチャーチ·サイエンティフィック</td><td> F-120倍</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、pittsburge、ペンシルバニア</td><td> PR-P1193 </td></tr><tr><td>ワンステップRT-PCRキット</td><td>キアゲン、バレンシア、カリフォルニア州</td><td> 210210 </td></tr><tr><td> PEG8000 </td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州</td><td> 41009 </td></tr&gt; <tr><td>パワーサプライ</td><td> VWR、ラドナー、ペンシルバニア</td><td> 300V </td></tr><tr><td>アウェイリボヌクレアーゼ</td><td> Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州</td><td> 83931-250ML </td></tr><tr><td> RNASecure </td><td>アプライドバイオシステムズ、フォスターシティ、カリフォルニア州</td><td> AM7005 </td></tr><tr><td>シリカ微小球</td><td> Polysciences社、ウォリントン、ペンシルバニア</td><td> 24324から15 </td></tr><tr><td>注射器ポンプ</td><td>ハーバード装置、ホリストン、マサチューセッツ州</td><td> HA2000P/10 </td></tr><tr><td>熱伝導性テープ</td><td>マクマスター - カー、エルムハースト、イリノイ州</td><td> 6838A11 </td></tr><tr><td>熱電対</td><td>オメガエンジニアリング、スタンフォード、コネチカット</td><td> 5SRTC-TT-J-40から36 </td></tr><tr><td>薄膜ヒーター</td><td> Minco、ミネソタ州ミネアポリス</td><td> HK5166R529L12A </td></tr><tr><td>紫外線架橋剤</td><td> UPV、アップランド、カリフォルニア州</td><td> CL-1000 </td></tr><tr><td>ゼオネックス</td> &lt;TD&gt;ゼオンケミカルズ、ルイビル、ケンタッキー州</td><td> 690R </td></tr></tbody></table>

microfluidic chip fabrication and method to detect influenza

迅速かつ効果的な診断は、効果的な患者の管理と治療を可能にすることによって、感染症の制御に重要な役割を果たしています。ここでは、患者の鼻咽頭（NP）スワブおよび吸引液中のインフルエンザウイルスを増幅する機能を持つ統合されたマイクロ流体チップの熱可塑性を提示する。患者サンプルのロード時に、マイクロ流体デバイスは、順次、オンチップ細胞溶解、RNA精製および固相抽出（SPE）、逆転写（RT）とRT-PCRチャンバー内のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）内の濃縮工程を実施それぞれ。終点検出は、オフチップバイオアナライザー（Agilent Technologies社、サンタクララ、CA）を使用して実行されます。 2薄膜ヒータは、RTおよびPCRチャンバー用の熱源として使用されていましたが周辺機器のために、私たちは、試薬やサンプルを駆動するために、単一のシリンジポンプを使用していました。チップはfabricatiを低減するために、高スループット製造のために、単層と適当になるように設計され時間とコストで。マイクロ流体チップは、関心のある新しい病原体を検出するために必要な試薬の設計変更によってのみ制限されるウイルスや細菌の多種多様な、分析するためのプラットフォームを提供します。

<html>典型的な結果は、インフルエンザに感染した鼻咽頭洗浄液検体については、 図3に示されている。各患者検体中のインフルエンザウイルスの量が異なるために、PCR産物の最終濃度は異なります。良い結果は、低ノイズ、2つの明確なラダーのピーク（35〜10380 bp）と正のサンプル用に設計された製品のサイズで単一の生成物のピーク（107 bp）を持っている必要があります。生成?...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza at JoVE.com

Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

統合されたマイクロ流体チップは、熱可塑性の分子診断として使用するために開発されました。チップは、核酸抽出、逆転写酵素、およびPCRを行います。チップを製造して実行するための方法が記載されている。

マイクロ流体チップの作製とインフルエンザを検出する方法

Fast  and effective diagnostics play an important role in controlling infectious  disease by enabling effective patient management and treatment. Here, we ...

microfluidic-chip-fabrication-and-method-to-detect-influenza

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.8K ビュー.  Boston University. 統合されたマイクロ流体チップは、熱可塑性の分子診断として使用するために開発されました。チップは、核酸抽出、逆転写酵素、およびPCRを行います。チップを製造して実行するための方法が記載されている。

ビデオ: Microfluidic Chip Fabrication and Method to Detect Influenza

Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

マイクロ流体液滴のプラットフォームのための蛍光検出法

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

生物工学

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described in detail. The PLBR can be utilized for the analysis of single bacteria and microcolonies to investigate biotechnological and microbiological related questions concerning, e.g.&#160;cell growth, morphology, stress response, and metabolite or protein production on single-cell level. The device features continuous media flow enabling constant environmental conditions for perturbation studies, but in addition allows fast medium changes as well as oscillating conditions to mimic any desired environmental situation. To fabricate the single use devices, a silicon wafer containing sub micrometer sized SU-8 structures served as the replication mold for rapid polydimethylsiloxane casting. Chips were cut, assembled, connected, and set up onto a high resolution and fully automated microscope suited for time-lapse imaging, a powerful tool for spatio-temporal cell analysis. Here, the biotechnological platform organism Corynebacterium glutamicum&#160;was seeded into the PLBR and cell growth and intracellular fluorescence were followed over several hours unraveling time dependent population heterogeneity on single-cell level, not possible with conventional analysis methods such as flow cytometry. Besides insights into device fabrication, furthermore, the preparation of the preculture, loading, trapping of bacteria, and the PLBR cultivation of single cells and colonies is demonstrated. These devices will add a new dimension in microbiological research to analyze time dependent phenomena of single bacteria under tight environmental control. Due to the simple and relatively short fabrication process the technology can be easily adapted at any microfluidics lab and simply tailored towards specific needs.

In this protocol the fabrication, setup and basic operation of a microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) for single-cell analysis of prokaryotic microorganisms is introduced. Industrially relevant microorganisms were analyzed as proof of principle allowing insights into growth rate, morphology, and phenotypic heterogeneity over certain time periods, hardly possible with conventional methods.

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

A Microfluidic Chip for the Versatile Chemical Analysis of Single Cells

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this purpose, the cells are passively trapped in the middle of a microchamber. Upon activation of the control layer, the cell is isolated from the surrounding volume in a small chamber. The surrounding volume can then be exchanged without affecting the isolated cell. However, upon short opening and closing of the chamber, the solution in the chamber can be replaced within a few hundred milliseconds. Due to the reversibility of the chambers, the cells can be exposed to different solutions sequentially in a highly controllable fashion, e.g. for incubation, washing, and finally, cell lysis. The tightly sealed microchambers enable the retention of the lysate, minimize and control the dilution after cell lysis. Since lysis and analysis occur at the same location, high sensitivity is retained because no further dilution or loss of the analytes occurs during transport. The microchamber design therefore enables the reliable and reproducible analysis of very small copy numbers of intracellular molecules (attomoles, zeptomoles) released from individual cells. Furthermore, many microchambers can be arranged in an array format, allowing the analysis of many cells at once, given that suitable optical instruments are used for monitoring. We have already used the platform for proof-of-concept studies to analyze intracellular proteins, enzymes, cofactors and second messengers in either relative or absolute quantifiable manner.

In this article we present a microfluidic chip for single cell analysis. It allows the quantification of intracellular proteins, enzymes, cofactors, and second messengers by means of fluorescent assays or immunoassays.&#160;

単一細胞の多彩な化学分析マイクロ流体チップ

We present a microfluidic device that enables the quantitative determination of intracellular biomolecules in multiple single cells in parallel. For this ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

あらかじめ設計されたサイズと形状を用いるポリマー繊維およびバイオハイブリッド繊維のマイクロ流体製造

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

A Microfluidic Chip for ICPMS Sample Introduction

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). The chip produces monodisperse aqueous sample droplets in perfluorohexane (PFH). Size and frequency of the aqueous droplets can be varied in the range of 40 to 60 &#181;m and from 90 to 7,000&#160;Hz, respectively. The droplets are ejected from the chip with a second flow of PFH and remain intact during the ejection. A custom-built desolvation system removes the PFH and transports the droplets into the ICPMS. Here, very stable signals with a narrow intensity distribution can be measured, showing the monodispersity of the droplets. We show that the introduction system can be used to quantitatively determine iron in single bovine red blood cells. In the future, the capabilities of the introduction device can easily be extended by the integration of additional microfluidic modules.

We present a discrete droplet sample introduction system for inductively coupled plasma mass spectrometry (ICPMS). It is based on a cheap and disposable microfluidic chip that generates highly monodisperse droplets in a size range of 40&#8722;60 &#181;m at frequencies from 90 to 7,000 Hz.

ICPMSサンプル導入のためのマイクロ流体チップ

This protocol discusses the fabrication and usage of a disposable low cost microfluidic chip as sample introduction system for inductively coupled plasma ...

Image-guided, Laser-based Fabrication of Vascular-derived Microfluidic Networks

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic networks embedded in PEGDA hydrogels. Here, we describe the creation of virtual masks that allow for image-guided laser control; the photopolymerization of a micromolded PEGDA hydrogel, suitable for microfluidic network fabrication and pressure head-driven flow; the setup and use of a commercially available laser scanning confocal microscope paired with a femtosecond pulsed Ti:S laser to induce hydrogel degradation; and the imaging of fabricated microfluidic networks using fluorescent species and confocal microscopy. Much of the protocol is focused on the proper setup and implementation of the microscope software and microscope macro, as these are crucial steps in using a commercial microscope for microfluidic fabrication purposes that contain a number of intricacies. The image-guided component of this technique allows for the implementation of 3D image stacks or user-generated 3D models, thereby allowing for creative microfluidic design and for the fabrication of complex microfluidic systems of virtually any configuration. With an expected impact in tissue engineering, the methods outlined in this protocol could aid in the fabrication of advanced biomimetic microtissue constructs for organ- and human-on-a-chip devices. By mimicking the complex architecture, tortuosity, size, and density of in vivo vasculature, essential biological transport processes can be replicated in these constructs, leading to more accurate in vitro modeling of drug pharmacokinetics and disease.

This protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation to fabricate vascular-derived, biomimetic microfluidic networks embedded in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) hydrogels. These biomimetic microfluidic systems may be useful for tissue engineering applications, generation of in vitro disease models, and fabrication of advanced "on-a-chip" devices.

血管由来のマイクロ流体ネットワークの画像誘導、レーザーベースの試作

This detailed protocol outlines the implementation of image-guided, laser-based hydrogel degradation for the fabrication of vascular-derived microfluidic ...

Fabrication of Three-dimensional Paper-based Microfluidic Devices for Immunoassays

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and directed within a layer of paper. Moreover, stacking multiple layers of patterned paper creates sophisticated three-dimensional microfluidic networks that can support the development of analytical and bioanalytical assays. Paper-based microfluidic devices are inexpensive, portable, easy to use, and require no external equipment to operate. As a result, they hold great promise as a platform for point-of-care diagnostics. In order to properly evaluate the utility and analytical performance of paper-based devices, suitable methods must be developed to ensure their manufacture is reproducible and at a scale that is appropriate for laboratory settings. In this manuscript, a method to fabricate a general device architecture that can be used for paper-based immunoassays is described. We use a form of additive manufacturing (multi-layer lamination) to prepare devices that comprise multiple layers of patterned paper and patterned adhesive. In addition to demonstrating the proper use of these three-dimensional paper-based microfluidic devices with an immunoassay for human chorionic gonadotropin (hCG), errors in the manufacturing process that may result in device failures are discussed. We expect this approach to manufacturing paper-based devices will find broad utility in the development of analytical applications designed specifically for limited-resource settings.

We detail a method to fabricate three-dimensional paper-based microfluidic devices for use in the development of immunoassays. Our approach to device assembly is a type of multilayer, additive manufacturing. We demonstrate a sandwich immunoassay to provide representative results for these types of paper-based devices.

イムノアッセイのための3次元紙ベースのマイクロ流体デバイスの作製

Paper wicks fluids autonomously due to capillary action. By patterning paper with hydrophobic barriers, the transport of fluids can be controlled and ...

Dry Film Photoresist-based Electrochemical Microfluidic Biosensor Platform: Device Fabrication, On-chip Assay Preparation, and System Operation

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An easy-to-use and low-cost sensor platform is highly desired to measure various types of analytes (e.g., biomarkers, hormones, and drugs) quantitatively and specifically. For this reason, dry film photoresist technology - enabling cheap, facile, and high-throughput fabrication - was used to manufacture the microfluidic biosensor presented here. Depending on the bioassay used afterwards, the versatile platform is capable of detecting various types of biomolecules. For the fabrication of the device, platinum electrodes are structured on a flexible polyimide (PI) foil in the only clean-room process step. The PI foil serves as a substrate for the electrodes, which are insulated with an epoxy-based photoresist. The microfluidic channel is subsequently generated by the development and lamination of dry film photoresist (DFR) foils onto the PI wafer. By using a hydrophobic stopping barrier in the channel, the channel is separated into two specific areas: an immobilization section for the enzyme-linked assay and an electrochemical measurement cell for the amperometric signal readout.
The on-chip bioassay immobilization is performed by the adsorption of the biomolecules to the channel surface. The glucose oxidase enzyme is used as a transducer for electrochemical signal generation. In the presence of the substrate, glucose, hydrogen peroxide is produced, which is detected at the platinum working electrode. The stop-flow technique is applied to obtain signal amplification along with rapid detection. Different biomolecules can quantitatively be measured by means of the introduced microfluidic system, giving an indication of different types of diseases, or, in regard to therapeutic drug monitoring, facilitating a personalized therapy.

A microfluidic biosensor platform was designed and fabricated using low-cost dry film photoresist technology for the rapid and sensitive quantification of various analytes. This single-use system allows for the electrochemical readout of on-chip-immobilized enzyme-linked assays by means of the stop-flow technique.

ドライ フィルムのレジストを用いた電気化学マイクロ流体バイオ プラットフォーム: デバイス作製、チップの試金の準備、およびシステム操作

In recent years, biomarker diagnostics became an indispensable tool for the diagnosis of human disease, especially for the point-of-care diagnostics. An ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

作製と内皮下電気抵抗を直接定量化する統合型電極を用いたオンチップ器官システムの検証

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human patients. Human Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic cell culture devices, which provide an experimental in vitro platform to assess efficacy, toxicity, and pharmacokinetic (PK) profiles in humans, may be better predictors of therapeutic efficacy and safety in the clinic compared to animal studies. These devices may be used to model the function of virtually any organ type and can be fluidically linked through common endothelium-lined microchannels to perform in vitro studies on human organ-level and whole body-level physiology without having to conduct experiments on people. These Organ Chips consist of two perfused microfluidic channels separated by a permeable elastomeric membrane with organ-specific parenchymal cells on one side and microvascular endothelium on the other, which can be cyclically stretched to provide organ-specific mechanical cues (e.g., breathing motions in lung). This protocol details the fabrication of flexible, dual channel, Organ Chips through casting of parts using 3D printed molds, enabling combination of multiple casting and post-processing steps. Porous poly (dimethyl siloxane) (PDMS) membranes are cast with micrometer sized through-holes using silicon pillar arrays under compression. Fabrication and assembly of Organ Chips involves equipment and steps that can be implemented outside of a traditional cleanroom. This protocol provides researchers with access to Organ Chip technology for in vitro organ- and body-level studies in drug discovery, safety and efficacy testing, as well as mechanistic studies of fundamental biological processes.

Here, we present a protocol that describes the fabrication of stretchable, dual channel, organ chip microfluidic cell culture devices for recapitulating organ-level functionality in vitro.

伸縮性、デュアル チャネル、オルガン マイクロ流体チップのスケーラブルな作製

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...