我々は感謝してアニャローターバッハ（Lehrstuhl Biomaterialien）、ローレンツ大全（サンドラーAG）とアーミンベック（B / S / H / G）の技術的及び科学的サポートを認める。 SEM-イメージングは​​ヨハネスディール（Lehrstuhl Biomaterialien）により行った。資金は、BMBF（01RB0710）から派生した。

1。紡糸原液の調製<ol><li> eADF4（C16）のタンパク質を凍結乾燥させてください。 </li><li>高精度の尺度を用いて、1mlの反応容器内でeADF4（C16）を20mg秤量する。 </li><li>ヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP）を200μlを加え、パラフィルムで容器を密封する。 注： HFIPは非常に揮発性と有害である。それは慎重にピペット、安全フードの下で呼吸トラック、仕事に害を引き起こす、チューブキャップをすることができますように。 </li><li>ボルテックスは1分間サスペンションと、さらにソリューションをクリアするためにそれを振る。確実にするために、タンパク質の全体量が完全に溶解されていることを、一晩待つ。 </li></ol> 2。エレクトロスピニング<ol><li>場所対極と電極（-22.5キロボルト）と対極（+2.5 kVの）両方のプリセット電圧の上にフィルター材料：エレクトロデバイス（ 図1）を準備します。 315μL/時に体積流量を設定します。 注：Whileエレクトロ、毒性HFIPを蒸発されます。あなたのエレクトロデバイスがドラフトに接続されていることを確認してください。 </li><li>市販の20 G針を取り、30mmの残存長さにハンドグラインダーで鋭い先端を挽く。 、1mlのシリンジに針を接続します。 注：平面ニードルチップは、明確に定義されたテーラーコーンを生成するために必要とされる。 </li><li>シリンジに全体紡糸原液を（200μl）をロードします。完全な溶液が紡糸工程中に押し出すことができるようにするために、空気100μlのドープを重ねる。 注：針の目詰まりを避けるために、紡糸原液には粒子（集合体や不純物）がないことを確認してください。ヒュームフード下で働く！ </li><li>エレクトロデバイスのシリンジポンプにフィルドシリンジを接続し、液滴は、針の先端に表示されるまで、慎重に注射器にピストンを押してください。ピストンをロックします。 </li><li>距離を設定針の先端と8月20 cmまで対極との間。 </li><li>シリンジポンプを起動し、針の開口部から（通常は乾い）滴を削除します。直ちにエレクトロデバイスのすべての安全のインストールを有効にして、新たな液滴が現れるとすぐに高電圧源を開始します。紡糸原液のエレクトロと、続いて開始されます。回転持続時間を制御するためにストップウォッチを使用してください。 注：溶液の乾燥を回避するため、針の目詰まりするためには、それはすぐに乾燥させた液滴を除去した後、紡糸プロセスを開始する必要がある。 </li><li>組換えスパイダーシルクタンパク質のエレクトロは湿度と温度に依存するため、個々の研究室の状況に向けたプロセスパラメータの適応は（ 図2）必要があるかもしれません。 注：乾燥から滴を防ぐため（ 図2B）十分な流量を有効にします。低加湿がある場合TYは、周囲の雰囲気中で、相対湿度を調整するか、流量を引き上げる。適切なテイラーコーンが発生するまで電圧を下げます（ 図2A）。先端（ 図2C）全く解が存在しない場合、流速を高め、液滴が発生するまで電圧を低下させる。その後、定期的かつ安定したテイラーコーン（ 図2A）を確立するために、電圧を調整します。 </li><li> 30シリンジポンプオフスイッチをエレクトロスピニングの秒/ 60秒/ 90秒後。落下液滴を避けるために、シリンジ内の残圧を解放するために高圧電源を切る前に10秒待つ。 </li><li>ステップ6〜8は、比較のため、ポリアミド、ポリプロピレン、ポリエステル不織布メッシュと同様に、黒色の紙のようなフィルター材料、異なるタイプのを行うことができる。 </li><li>その後の安定性実験のための不織布のメッシュを生成するには、フィルター材料の代わりに黒い紙を使用し、ステップ5〜7を実行します。エレクトロの5分後、停止ステップ8で説明したようにプロセス。 </li></ol> 3。シルク不織布メッシュの後処理<ol><li> 60予熱オーブン℃まで</li><li> eADF4（C16）不織布メッシュを垂直にし、ロック可能なガラス容器に2cmの最小距離をもつフィルタ基板を置きます。容器は、続いてエタノールと水を導入するために使用される2つの開口部を有するべきである。 注：フィルター材を固定する場合は、透水性実験のために必要な領域がクランプによって損傷されていないことを確認してください。 </li><li>後処理容器の内部底面（ 図3）にポインティングシリコーンチューブを60mlずつ2シリンジ、エタノールを充填した1、水で満たされたものを、接続する。 注：治療後の容器から液体を除去できるようにするために、できるだけ近い底部にパイプの開口部を配置する。 </li><li> OVで後処理容器を置きENとシリンジを押し出すことにより、エタノール60 mlを加える。治療期間を制御するためにストップウォッチを使用してください。 </li><li>エタノール蒸気処理の90分後、ガラスから注射器でエタノールを除去し、第2のシリンジから水60mlを加えます。 </li><li>別の90分間待ってから、水を除去し、オーブンのスイッチを切る。それが完全に冷えて凝縮して液滴を避けるために、炉容器を残す。 </li></ol> 4。スパイダーシルク不織布メッシュの分析<ol><li>黒い紙または他の取り外し可能な支持体上の安定性試験のための絹織メッシュを準備します。段ボールの2つのフレームを切り出し、両面粘着性粘着テープを調整します。黒い紙の上に堆積絹織メッシュに1つのフレームを押して、シルク繊維（その後のSEMイメージングのための過剰繊維を保つ）の過剰を遮断するメスを使用しています。丁寧に紙から不織布を切り離すために、フレームを削除します。二フレームを使用してこの手順を繰り返し（ 図4）。 </li><li>実用ディップテスト：各のピース（1 cm 2）を、後処理および非処理絹織メッシュをカットし、脱イオン水に浸す。治療不織メッシュ（ 図5）が安定になる一方、非処理絹織メッシュはすぐに、溶解します。浸漬した後、浸漬、試料を乾燥させ、SEMイメージングのための準備をします。 </li><li>フーリエ変換赤外分光法（FTIR）測定およびその後のフーリエ自己デコンボリューション（FSD）：不織布メッシュの後処理時の絹タンパク質の構造変化に関する情報を得るために、FTIR、パラメータを使用して適用することができる。透過率モード、60蓄積は、各スペクトルを測定し、平均しているcm -1の、一つの基準は、スペクトルごとに測定されます800から4,000にスキャンします。データの定量分析については、FSD（ 図6および図7）を用いることができる。これにより、データ曲線はARに低減される1590と1705センチメートル-1およびベースライン補正との間のEAが行われる。地元の最小二乗適合が22（1611 1619、1624、1630、1640、1650、1659、1666、1680、1691、1698センチメートル-1）これまでの研究から取らピーク位置に応じて算出される。 </li><li> SEM撮像：SEMは、繊維直径および異なるフィルタ基板上のシルク繊維の形態を調査するために、繊維の形態（ 図8）上の後処理の影響を分析するために適用することができる。十分に詳細な画像を得るために25,000 X〜5,000 Xの倍率を使用してください。 </li></ol> 5。通気性の決定<ol><li> Akustron空気透過性デバイスの測定領域にフィルター材料の適切な嵌合部を置きます。 注::あなたは空気透過装置の他のタイプを使用する場合は、DINの要件53 887、DIN 53 120、ISOを満たしていることを確認してください9237およびASTM D 737から96規格。 </li><li>Akustronの通気性·デバイス（または他の任意のよう5.1に示されている）を採用。必要はノルムのデータを計算すると[L /（M×2 秒）]。 </li><li>サンプルのさまざまな部分で、手順1と2は少なくとも10回繰り返し、算術ミドル（ 図9）を計算。 注：測定通気性は、デバイスの接触および不織布メッシュを必要とする。従って、試料の取り扱いに注意が繊細なシルク不織布メッシュの破壊を防止することが重要である。 </li></ol> 6。フィルター効率の決定<ol><li>このようなユニバーサルパーティクルサイザー（パラス社、カールスルーエ、GER）として、圧力制御やパーティクルカウンターで適切なマシンを使用してください。 </li><li>デバイスと測定粒子保持（ 図10）でフィルタのサンプルを置きます。エアゾール：DI-エチル-ヘキシルsebacat（DEHS）、粒径：0.3〜ミクロン、長さ：30秒;液体速度：2350センチメートル/秒;空気流量：3400メートル3 /時。 <br/&gt; 注：注意してサンプルを処理し、不織布メッシュの破壊を防ぎ、任意の汚染を避けるために、表面に触れないでください。パフォーマンス測定のために同等の品質の十分なサンプルを作成してください。 </li></ol>

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我々は、開示することは何もありません。

新しいフィルタ装置は、一定以上のフィルター効率で空気ろ過の全体のエネルギー消費を下げるようにする必要があります。ここでは、そのようなデバイスは、クモの糸で作られた不織布を使用して作成された。その低表面張力と高揮発性のため、HFIPは電気紡糸のために適切な溶媒として選択されている。また、水性シルク溶液は以前の実験で試験されたが、まだ繊維が生成されなかった。ここで、表面張力を低下させ、それによって溶液の紡糸特性を改善するために添加物を使用することが重要であろう。最も重要な工程は、高電圧及び押出速度を回転させて、条件および使用される材料の濃度および紡糸溶液の溶媒を調整することである。演奏中に、先端の目詰まり例えば水蒸気の形での水分とニードルチップを供給することにより防止することができるが、エレクトロスピニングセットアップでの追加の任意の種類は、その後乱す可能性があります敏感なプロセスおよび電界。本質的なプロセスパラメータ（濃度、電圧、距離、湿度）は、単独で独立した実験的な系列（データは示さず）を行う決定した。考慮し、すべてのパラメータを取ること、それは、連続テイラーコーンと均一繊維を作成するために紡糸工程の世話をすることが重要です。 フィルタ効率は、フィルタ材料の最も重要なパラメータの一つである。このパラメータは、主にフィルター材料の構造によって影響される。織布は、均一な細孔サイズと、その後一貫し通気性を継承します。これは、毛穴を埋めるために、ゼロ欠陥フィルタを生成するために、これらのテンプレート素材で均質織メッシュを作成することが重要です。我々のフィルタにおいて、フィルタ効率は、不織布、メッシュ層の数、従って、紡糸時間（シルクタンパク質の）に直接依存性を示し、。単繊維間の空隙が一貫保持Oの有効化、満たされているfは小さい粒子。 本研究では、高いフィルター効率を示す、スパイダーシルク不織布メッシュを有する新規なフィルター材料を製造するための方法を導入しました。したがって、これらのフィルタは、空気ろ過システムにおける将来の使用のための有望な候補である。

強度および伸展それらの組み合わせにより、スパイダーシルク繊維は、他のほとんどの天然又は合成繊維の1以上の運動エネルギーを吸収することができる。さらに、ほとんどの合成高分子材料とは異なり、絹材料は無毒と生体適合性であり、2,3を組み込んだ全くアレルギー反応を起こさない。推定上の健康上のリスクは、スパイダーシルクを使用することにより防止することができる。これらの機能は、医療と技術の様々なアプリケーションのためのクモの糸は非常に魅力的です。スパイダーは、その共食い動作により、養殖することができないので、生物工学的方法の両方、コスト効率的かつ十分な量4には、スパイダーシルクタンパク質を生成するために開発されてきた。 組換えシルクプロテインeADF4（C16）はAraneusのdiadematusのフィブロイン4（ADF4）の自然な配列に基づいて設計されています。 eADF4は、（C16）5 48kDaの分子量を有し、種々の溶媒に可溶である（hexafluoroisopropanol（HFIP）6、ギ酸7、水性緩衝液）8。 eADF4（C16）は、このような膜9、カプセル8、粒子10、ヒドロゲル11、コーティング7、繊維12と不織布メッシュ6などの異なる形態に加工することができる。それらの化学的安定性のために、後者はフィルタ用途において高い電位を与える。 ここでは、エレクトロ換えスパイダーシルクタンパク質の不織布のメッシュを含むエアフィルターデバイスを製造するためのプロトコルを提示する。エレクトロスピニング又は静電紡糸は、典型的には既にフィルタ·アプリケーション14として研究されてきたが10nm程度13 -10、及び不織布のメッシュの範囲の直径を有するポリマー繊維を製造するために採用される技術である。過去には、エレクトロスピニングが正常でなく、組換え的に産生さ16クモの糸のように再生された15の処理のために適用されているタンパク質。典型的には、高電圧（kVの5-30）をシリンジと8月20 cmの距離に配置された対向電極（0-20キロボルト）に印加さ​​れる。強い静電場は、帯電したソリューション内の反発力を誘導する。表面張力を超えた場合、テーラーコーンが形成され、細いジェットは、先端部17,18から噴出される。形成後、曲げ不安定性は、さらに、溶媒が蒸発するように延伸させる噴流内で発生し、固体繊維が形成されている。最後に、繊維がランダムに不織布メッシュ19と対向電極上に堆積される。直径と表面トポロジー（多孔質、滑らかな）のような繊維の特性、濃度、粘度、表面自由エネルギーと溶媒との本質的な導電率と透磁率20などのソリューションパラメータに主に依存している。溶液中のタンパク質の濃度に応じて80-1,100程度から直径がスムーズファイバにおけるHFIP結果に溶解eADF4（C16）のエレクトロ。HFIPからeADF4（C16）エレクトロは、主にα-ヘリックス二次構造を表示し、繊維は水溶性6アール。シルク繊維を安定化させるためには、β-シート構造はエタノールでその後の処理によって誘導されなければならない。以前に確立された後処理方法21とは対照的に、本 ​​研究でeADF4（C16）不織布は、シルク繊維の形態を維持するために、エタノール蒸気で処理されている。二次構造解析は、文献22に記載されているように、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）およびその後のフーリエ自己デコンボリューション（FSD）を用いて行った。 FSDは、FTIRスペクトルの分解能は、いくつかのオーバーラップバンドから成ることができ、信号処理ツールである。これにより、I領域の中の不明瞭な広い帯域が改善されたピークの解像度でデコンボリューションしたスペクトルを受信するためにハイパスフィルタを用いて狭くすることができる。 effのを評価するために、シルク不織布メッシュを補完フィルタ基板のiciencyは、通気性試験は、標準的なプロトコルに従ってAkustron装置を用いて行った。堆積速度は、パラスユニバーサルパーティクルサイザーを用いて測定した。

air filter devices including nonwoven meshes of electrospun recombinant spider silk proteins

Araneusのdiadematusのフィブロイン4（ADF4）、組換えスパイダーシルクタンパク質eADF4の天然の配列に基づいて（C16）設計されています。この反復性の高いタンパク質は48kDaの分子量を有し、異なる溶媒（ヘキサフルオロイソプロパノール（HFIP）、ギ酸および水性緩衝液）に可溶性である。 eADF4（C16）は、フィルム、カプセル、粒子、ヒドロゲル、コーティング、繊維や不織布メッシュなどの形態に加工した様々な技術的なアプリケーションのための高い潜在性を提供します。それらの化学的安定性および制御された形態のために、後者は濾材を改善するために使用することができる。このプロトコルでは、電界紡糸、組換えスパイダーシルクタンパク質の不織メッシュの堆積によって、異なるエアフィルタデバイスの効率を高めるための手順を示す。スムーズ繊維中HFIP結果に溶解eADF4（C16）のエレクトロ。異なる繊維直径（80-1,100ナノメートル）およびタンパク質濃度の変動（5〜25％w / vのは）結果不織布メッシュのため、細孔径。 タンパク質が新たに紡いだ繊維で、主にα-ヘリックス二次構造を表示しますので、HFIPからeADF4（C16）エレクトロの後処理が必要であるため、繊維は水溶性である。エタノール蒸気とのその後の処理は、シルク繊維とメッシュの形態を維持し、耐水性、安定したβシート構造の形成を誘導する。二次構造解析は、フーリエ変換赤外分光法（FTIR）およびその後のフーリエ自己デコンボリューション（FSD）を用いて行った。 主な目的は、上にシルク不織布層を追加することで、既存のフィルタ基材のフィルタ効率を改善することであった。持続時間をエレクトロスピニングの影響及びフィルタ効率に従って、不織布層の厚さを評価するために、我々は、粒子堆積測定と組み合わせて通気性試験を行​​った。実験は標準に従って実施されたプロトコル。

HFIP〜10％w / vの濃度の組換えスパイダーシルク溶液のエレクトロスピニングは、不織布のメッシュの形成を可能にする、80〜120nmの範囲の直径を有する滑らかな繊維をもたらした。エタノール蒸気による後処理は、絹織後処理の適切な方法（ 図8）として設立され、それゆえ、だっ目立つ形態学的変化には ​​つながらなかった。構造変化は、FT-IR及びIバンドが単一寄与ピーク（ 図6）を分析するために行われた中での後続のFSDを用いて検出した。これは、α-ヘリックスundのランダムコイル構造の含有量が少なくなる（ 図7）が、後処理は、β-シート構造の増加をもたらすことを示すことができた。この結果は、実質的に水（ 図5）内に不織後処理を浸漬することによって証明することができる。でも、一週間後、不織布メッシュのない溶解が発生しません。 スピニング·デュ配給は、エレクトロ繊維の高密度化に基づいて圧力降下に起因するフィルター材料シルク不織布の適用に関する最も重要なパラメータである。こうして拡張回転期間のウント通気性の指数関数的な減少繊維層結果の上位数。この効果は、ポスト処理前と処理後の全ての異なるフィルタ基板材料（ 図9）を検出することができる。同様に、サブミクロン粒子が増加する（ 図10）のシルク含有濾材の濾過効率。短い回転期間（30秒）は、低フィルタ効率、より高い回転期間（90秒）高い効率のリードを獲得しながら。 <img alt="図1" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50492/50492fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig1.jpg" /> 図1の高電圧（0〜30キロボルト）は、i<html> sがシルク溶液を充填したシリンジに適用され、対向電極（0-20キロボルト）は8〜20センチメートルの距離に配置されている。このセットアップでは、帯電したソリューション内の反発力を誘発する、強い静電場につながる。表面張力を超えた場合、テーラーコーンが形成され、細いジェット先端から噴出される。形成後、曲げ不安定性は、さらに、溶媒が蒸発するように延伸させる噴流内で発生し、固体繊維が形成されている。最後に、繊維がランダムに不織布メッシュ状の対向電極上に堆積される。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig2.jpg" /> 図2の正規テイラーコーン（）、乾燥滴（B）、及び液滴（C）なしのセットアップの写真を。 iles/ftp_upload/50492/50492fig3highres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/50492/50492fig3.jpg &quot;/&gt; 蒸気後処理中に図3の回路図手順。最初のステップでは、チャンバはエタノールで充填されており、試料を90分間60℃で蒸している。以降の処理のために不織布メッシュを柔らかくするために、エタノールが除去され、繊維は60℃90分間水蒸気で蒸している℃で<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50492/50492fig3large.jpg" target="_blank">大きい図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig4.jpg" /> 後処理に使用する付属の絹織メッシュと段ボールのフレームの図4。写真。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig5.jpg" /> 図5。Electrosp国連とその後は後処理乾燥状態（A）に、水（B）の下で不織布。 <img alt="図6" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50492/50492fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig6.jpg" /> 図6。アミド（A）未処理および後処理（B）スパイダーシルク不織布メッシュの私はバンドのフーリエセルフデコンボリューションされた吸光度スペクトル。実線はデコンボリューション後派生のような単一の拠出ピーク（点線）に起因する吸光帯が表示されます。それぞれの曲線の割り当ては、文献22から以前に発行された値に基づいていました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50492/50492fig6large.jpg" target="_blank">大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図7" fo:conten<html> T-幅= &quot;5インチ&quot;のfo：srcが= SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50492/50492fig7.jpg&quot;を &quot;/ files/ftp_upload/50492/50492fig7highres.jpg&quot; /&gt; 図7非処理およびeADF4（C16）後処理織メッシュの二次構造含量。 <img alt="図8" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50492/50492fig8highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig8.jpg" /> 図8は 、異なるフィルタ基板上のエレクトロeADF4のSEM像（C16）繊維：ポリアミド（PA）、ポリエステル（PE）、ポリプロピレン（PP）、純eADF4（C16）繊維前（S1）と後（S2）、ポストエタノール蒸気を用いた治療。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50492/50492fig8large.jpg" target="_blank">より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 / ftp_upload/50492/50492fig9.jpg &quot;/&gt; 図9空気透過性試験の前（A）および後処理の後に（B）をエタノール蒸気で絹織布のメッシュの増大紡糸時次いで、空気透過性を低下させる多くの不織布層につながる。 <img alt="図10" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50492/50492fig10highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50492/50492fig10.jpg" /> 図10エタノールによる後処理後、シルク層量に影響を与える別の回転期間におけるポリアミドフィルタ材料に関するエレクトロスパイダーシルク不織布メッシュ、上のジ-エチル-ヘキシルsebacatエアロゾルのフィルター効率。

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Air Filter Devices Including Nonwoven Meshes of Electrospun Recombinant Spider Silk Proteins

クモの糸繊維は、臨時の機械的特性を表示します。エンジニアリング<em&gt; Araneusのdiadematusの</em&gt;フィブロイン4（eADF4）はエレクトロスピニングを用いた不織布メッシュに加工することができる。ここで、eADF4織メッシュは空気除菌装置の性能を改善するために使用される。

エレクトロ組換えスパイダーシルクタンパク質の不織布メッシュを含むエアフィルターデバイス

Based on the natural sequence of Araneus diadematus Fibroin 4 (ADF4), the recombinant spider silk protein eADF4(C16) has been engineered. This highly ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.0K ビュー.  University of Bayreuth. クモの糸繊維は、臨時の機械的特性を表示します。エンジニアリング Araneusのdiadematusのフィブロイン4（eADF4）はエレクトロスピニングを用いた不織布メッシュに加工することができる。ここで、eADF4織メッシュは空気除菌装置の性能を改善するために使用される。

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Postproduction Processing of Electrospun Fibres for Tissue Engineering

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo undergo biaxial distension to varying extents such as skin, bladder, pelvic floor and even the hard palate as children grow. In producing scaffolds for these purposes there is a need to develop scaffolds of appropriate biomechanical properties (whether achieved without or with cells) and which are sterile for clinical use. The focus of this paper is not how to establish basic electrospinning parameters (as there is extensive literature on electrospinning) but on how to modify spun scaffolds post production to make them fit for tissue engineering purposes - here thickness, mechanical properties and sterilisation (required for clinical use) are considered and we also describe how cells can be cultured on scaffolds and subjected to biaxial strain to condition them for specific applications.
Electrospinning tends to produce thin sheets; as the electrospinning collector becomes coated with insulating fibres it becomes a poor conductor such that fibres no longer deposit on it. Hence we describe approaches to produce thicker structures by heat or vapour annealing increasing the strength of scaffolds but not necessarily the elasticity. Sequential spinning of scaffolds of different polymers to achieve complex scaffolds is also described. Sterilisation methodologies can adversely affect strength and elasticity of scaffolds. We compare three methods for their effects on the biomechanical properties on electrospun scaffolds of poly lactic-co-glycolic acid (PLGA).
Imaging of cells on scaffolds and assessment of production of extracellular matrix (ECM) proteins by cells on scaffolds is described. Culturing cells on scaffolds in vitro can improve scaffold strength and elasticity but the tissue engineering literature shows that cells often fail to produce appropriate ECM when cultured under static conditions. There are few commercial systems available that allow one to culture cells on scaffolds under dynamic conditioning regimes - one example is the Bose Electroforce 3100 which can be used to exert a conditioning programme on cells in scaffolds held using mechanical grips within a media filled chamber.4 An approach to a budget cell culture bioreactor for controlled distortion in 2 dimensions is described. We show that cells can be induced to produce elastin under these conditions. Finally assessment of the biomechanical properties of processed scaffolds cultured with or without cells is described.

Electrospun scaffolds can be processed post production for tissue engineering applications. Here we describe methods for spinning complex scaffolds (by consecutive spinning), for making thicker scaffolds (by multi-layering using heat or vapour annealing), for achieving sterility (aseptic production or sterilisation post production) and for achieving appropriate biomechanical properties.

組織工学のためのエレクトロ繊維のポスト処理

Electrospinning is a commonly used and versatile method to produce  scaffolds (often biodegradable) for 3D tissue engineering.1, 2, 3 Many tissues in vivo ...

生物工学

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation biomaterials with high performance properties. The development of these new structural materials must be rapid, cost-efficient and involve processing methodologies and products that are environmentally friendly and sustainable. Spiders spin a multitude of different fiber types with diverse mechanical properties, offering a rich source of next generation engineering materials for biomimicry that rival the best manmade and natural materials. Since the collection of large quantities of natural spider silk is impractical, synthetic silk production has the ability to provide scientists with access to an unlimited supply of threads. Therefore, if the spinning process can be streamlined and perfected, artificial spider fibers have the potential use for a broad range of applications ranging from body armor, surgical sutures, ropes and cables, tires, strings for musical instruments, and composites for aviation and aerospace technology. In order to advance the synthetic silk production process and to yield fibers that display low variance in their material properties from spin to spin, we developed a wet-spinning protocol that integrates expression of recombinant spider silk proteins in bacteria, purification and concentration of the proteins, followed by fiber extrusion and a mechanical post-spin treatment. This is the first visual representation that reveals a step-by-step process to spin and analyze artificial silk fibers on a laboratory scale. It also provides details to minimize the introduction of variability among fibers spun from the same spinning dope. Collectively, these methods will propel the process of artificial silk production, leading to higher quality fibers that surpass natural spider silks.

Despite the outstanding mechanical and biochemical properties of spider silks, this material cannot be harvested in large quantities by conventional means. Here we describe an efficient strategy to spin artificial spider silk fibers, which is an important process for investigators studying spider silk production and their use as next-generation biomaterials.

実験室規模の合成クモの糸生産

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Biosensor for Detection of Antibiotic Resistant Staphylococcus Bacteria

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) antibody conjugated latex beads have been utilized to create a biosensor designed for discrimination of methicillin resistant (MRSA) and sensitive (MSSA) S. aureus species 1,2. The lytic phages have been converted into phage spheroids by contact with water-chloroform interface. Phage spheroid monolayers have been moved onto a biosensor surface by Langmuir-Blodgett (LB) technique 3. The created biosensors have been examined by a quartz crystal microbalance with dissipation tracking (QCM-D) to evaluate bacteria-phage interactions. Bacteria-spheroid interactions led to reduced resonance frequency and a rise in dissipation energy for both MRSA and MSSA strains. After the bacterial binding, these sensors have been further exposed to the penicillin-binding protein antibody latex beads. Sensors analyzed with MRSA responded to PBP 2a antibody beads; although sensors inspected with MSSA gave no response. This experimental distinction determines an unambiguous discrimination between methicillin resistant and sensitive S. aureus strains. Equally bound and unbound bacteriophages suppress bacterial growth on surfaces and in water suspensions. Once lytic phages are changed into spheroids, they retain their strong lytic activity and show high bacterial capture capability. The phage and phage spheroids can be utilized for testing and sterilization of antibiotic resistant microorganisms. Other applications may include use in bacteriophage therapy and antimicrobial surfaces.

Lytic phage biosensors and antibody beads are able to discriminate between methicillin resistant (MRSA) and sensitive staphylococcus bacteria. The phages were immobilized by a Langmuir-Blodgett method onto a surface of a quartz crystal microbalance sensor and worked as broad range staphylococcus probes. Antibody beads recognize MRSA.

抗生物質耐性ブドウ球菌の細菌の検出のためのバイオセンサー

A structurally transformed lytic bacteriophage having a broad host range of Staphylococcus aureus strains and a penicillin-binding protein (PBP 2a) ...

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, nanomedicine, tissue regeneration, and drug delivery. Designing materials based on the molecular-scale interactions between these proteins will help generate new multifunctional protein alloy biomaterials with tunable properties. Such alloy material systems also provide advantages in comparison to traditional synthetic polymers due to the materials biodegradability, biocompatibility, and tenability in the body. This article used the protein blends of wild tussah silk (Antheraea pernyi) and domestic mulberry silk (Bombyx mori) as an example to provide useful protocols regarding these topics, including how to predict protein-protein interactions by computational methods, how to produce protein alloy solutions, how to verify alloy systems by thermal analysis, and how to fabricate variable alloy materials including optical materials with diffraction gratings, electric materials with circuits coatings, and pharmaceutical materials for drug release and delivery. These methods can provide important information for designing the next generation multifunctional biomaterials based on different protein alloys.

Blending is an efficient approach to generate biomaterials with a broad range of properties and combined features. By predicting the molecular interactions between different natural silk proteins, new silk-silk protein alloy platforms with tunable mechanical resiliency, electrical response, optical transparency, chemical processability, biodegradability, or thermal stability can be designed.

バイオメディカル応用のためのシルクシルクプロテイン合金材料設計

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

マウス胚性幹細胞からの神経組織エンジニアリングのためのポリエレクトロ繊維状足場（グリセロール - ドデカン）

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell number. While researchers commonly reference their seeding density this does not necessarily indicate the actual number of cells that have adhered to the material in question. This is particularly the case for materials, or scaffolds, that do not cover the base of standard cell culture well plates. This study investigates the initial attachment of human mesenchymal stem cells seeded at a known number onto electrospun poly(&#949;-caprolactone) yarn after 4 hr in culture. Electrospun yarns were held within several different set-ups, including bioreactor vessels rotating at 9 rpm, cell culture inserts positioned in low binding well plates and polytetrafluoroethylene (PTFE) troughs placed within petri dishes. The latter two were subjected to either static conditions or positioned on a shaker plate (30 rpm). After 4 hr incubation at 37&#160;oC, 5% CO2, the location of seeded cells was determined by cell DNA assay. Scaffolds were removed from their containers and placed in lysis buffer. The media fraction was similarly removed and centrifuged &#8211; the supernatant discarded and pellet broken up with lysis buffer. Lysis buffer was added to each receptacle, or well, and scraped to free any cells that may be present. The cell DNA assay determined the percentage of cells present within the scaffold, media and well fractions. Cell attachment was low for all experimental set-ups, with greatest attachment (30%) for yarns held within cell culture inserts and subjected to shaking motion. This study raises awareness to the actual number of cells attaching to scaffolds irrespective of the stated cell seeding density.

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&amp;#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

ポリ（εカプロラクトン）エレクトロ糸にヒト間葉系幹細胞の添付ファイルの最適化

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

繊維組織における階調の電界紡糸ナノファイバー足場

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a deeper comprehension of the neural system scientists aim to simplistically reconstruct the tissue by assembling it in vitro from basic building blocks using a tissue engineering approach. Our group developed a tissue-engineered silk and collagen-based 3D brain-like model resembling the white and gray matter of the cortex. The model consists of silk porous sponge, which is pre-seeded with rat brain-derived neurons, immersed in soft collagen matrix. Polarized neuronal outgrowth and network formation is observed with separate axonal and cell body localization. This compartmental architecture allows for the unique development of niches mimicking native neural tissue, thus enabling research on neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell and cell-matrix interactions and electrical functions.

Insight into the complex actions of the brain requires advanced research tools. Here we demonstrate a novel silk-collagen-based 3D engineered model of neural tissue resembling brain-like architecture. The model can be used to study neuronal network assembly, axonal guidance, cell-cell interactions and electrical activity.

偏神経組織のエンジニア3Dシルクコラーゲンベースモデル

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

Fabricating Cotton Analytical Devices

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and provide information for follow-up treatment. Here, we demonstrate the development of a cotton-based urinalysis (i.e., nitrite, total protein, and urobilinogen assays) analytical device that employs a lateral flow-based format, and is inexpensive, easily fabricated, rapid, and can be used to conduct multiple tests without cross-contamination worries. Cotton is composed of cellulose fibers with natural absorptive properties that can be leveraged for flow-based analysis. The simple but elegant fabrication process of our cotton-based analytical device is described in this study. The arrangement of the cotton structure and test pad takes advantage of the hydrophobicity and absorptive strength of each material. Because of these physical characteristics, colorimetric results can persistently adhere to the test pad. This device enables physicians to receive clinical information in a timely manner and shows great potential as a tool for early intervention.

To investigate simple fabrication approaches for multiple assay needs, we created a fluid-absorbing channel system made of cotton material. This device was used to establish a multiple detection platform, and solve contamination issues that commonly affect lateral flow-based biomedical devices, for clinical urinalysis of nitrite, total protein, and urobilinogen.

コットン分析デバイスを製造します

A robust, low-cost analytical device should be user-friendly, rapid, and affordable. Such devices should also be able to operate with scarce samples and ...

Manufacture and Drug Delivery Applications of Silk Nanoparticles

Silk is a promising biopolymer for biomedical and pharmaceutical applications due to its outstanding mechanical properties, biocompatibility and biodegradability, as well its ability to protect and subsequently release its payload in response to a trigger. While silk can be formulated into various material formats, silk nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems. Therefore, this article covers the procedures for reverse engineering silk cocoons to yield a regenerated silk solution that can be used to generate stable silk nanoparticles. These nanoparticles are subsequently characterized, drug loaded and explored as a potential anticancer drug delivery system. Briefly, silk cocoons are reverse engineered first by degumming the cocoons, followed by silk dissolution and clean up, to yield an aqueous silk solution. Next, the regenerated silk solution is subjected to nanoprecipitation to yield silk nanoparticles &#8211; a simple but powerful method that generates uniform nanoparticles. The silk nanoparticles are characterized according to their size, zeta potential, morphology and stability in aqueous media, as well as their ability to entrap a chemotherapeutic payload and kill human breast cancer cells. Overall, the described methodology yields uniform silk nanoparticles that can be readily explored for a myriad of applications, including their use as a potential nanomedicine.

Nanoparticles are emerging as promising drug delivery systems for a broad range of indications. Here, we describe a simple yet powerful method to manufacture silk nanoparticles using reverse engineered Bombyx mori silk. These silk nanoparticles can be readily loaded with a therapeutic payload and subsequently explored for drug delivery applications.