バクテリアの形質転換は自然界で起こっており、バクテリアが外来DNAを導入する現象のことです。さらにその後増幅又は複製を行います。研究では、高圧の電気パルスを利用し、バクテリアの細胞膜に穴を空け人為的に形質転換を誘発します。この穴を通ってプラスミドDNAが細胞内に取り込まれます。この手法はエレクトロポレーション法と呼ばれ、これからその原理、各工程、応用例を紹介していきます。
エレクトロポレーション法の前にまず、この実験で使用するDNAのタイプを知っておきましょう。それはプラスミドです。プラスミドは小さな環状の染色体外のDNAであり、特異的なDNA配列のべクター又は担体の役割を担います。
この配列がクラゲ蛍光タンパク質の遺伝子でも植物性の酵素でも、マルチクローニンングサイト、MCSを介してプラスミドに挿入することができます。この領域は制限エンドヌクレアーゼ、つまり制限酵素の認識部位を含んでいます。同じ制限酵素で挿入したい配列とプラスミドを切断することで、互いに相補的な配列をもつ末端ができあがります。
また、プラスミドには複製起点、ORIが含まれており、ここから複製が開始されます。そして形質転換の際に極めて重要となるのが抗生物質耐性遺伝子です。この遺伝子をもつバクテリアは抗生物質を無効化できるため、抗生物質を含む培地でも生存できるのです。
エレクトロポレーション法にはエレクトロポレーターと呼ばれる特別な装置を利用します。両側に電極のついたエレクトロポレーション用キュベットに細胞を入れ、装置にセットすることで電気接点ができあがります。
バクテリア細胞とDNAを混和し、エレクトロポレーション用キュベットにロードします。そして約1000から10,000ボルトの電場を数ミリ秒供給します。すると0.5から1ボルトの電流が細胞膜に到達することで、膜を構成するリン脂質二重膜の再配列が起こり穴が形成されるとされています。このときプラスミドDNAは細胞膜を通過することができ、パルス刺激をやめると膜は自己修復します。
プラスミドを導入したバクテリアは抗生物質を添加した寒天プレートで培養します。
ここまでプラスミドとエレクトロポレーション法のメカニズムについて学びました。ここからは実験手順を見ていきましょう。
DNAを簡単に導入できる細胞としてコンピテントセルがあります。分子生物学の研究で最もよく利用されるのは大腸菌のコンピテントセルです。 大腸菌は原核生物であり、あなたの腸管下部にも生息しています。特にエレクトロポレーション用の大腸菌はエレクトコンピテントセルと呼ばれます。
バクテリアを扱うときには、作業領域をできるだけクリーンな状態にしてください。
さらにバクテリアの取り扱いには無菌操作が必須となります。ブンゼンバーナーによる器具の滅菌、またその対流により作業領域の空気中浮遊物のコンタミネーションを防ぎます。
エレクトロポレーションの実施直前に、培地を室温に戻し、抗生物質を添加した寒天プレートを準備します。エレクトロポレーション用キュベットは氷で冷やしておきます。
次にエレクトロコンピテントセルを氷で融解します。
1-5μLの塩を含まない1ng/μLプラスミドをバクテリア細胞に加え、優しく撹拌し、氷冷しておいたキュベットに注入します。気泡が入らないように気をつけてください。
エレクトロポレーターを細胞に適した条件に設定します。ここでは、電圧1700ボルト、電場強度17kV/cmに設定しています。
キュベットの外側の水滴を拭き取り、装置にセットします。音が鳴るまでパルスをかけます。
電気パルスがうまくかかっていないと放電により火花が散りパンという音が聞こえます。これはアーク放電と呼ばれ、コンピテントセル又はDNA中の塩が多すぎる場合に起こります。
形質転換は時定数により成功したかどうか推測可能です。時定数とは、パルスをかけた後、電圧が低下するまでの時間のことです。もし溶液に塩が存在し、伝導性が非常に良いと、すぐに低下が始まるため、放電により多くの細胞が死んでしまいます。バクテリアの至適時定数は5-10ミリ秒です。
パルス刺激後すぐにキュベットを取り出し、1mLの培地を直接細胞に加えます。培地を含んだ細胞はチューブに移し、37°Cで1時間震盪し、細胞を回復させます。
次に、無菌操作で20-200μLの細胞を抗生物質を添加した寒天プレートに播種します。凝縮液が細胞に入らないようプレートを反転させ寒天が上にくるようにし、一晩37°Cで培養します。
プラスミドにより形質転換されたバクテリアによりコロニーが形成されます。コロニーをカウントし、形質転換効率を算出します。これは形質転換に成功したコロニー数をDNAの総数で割った数値です。
バクテリアの栄養となる寒天と培養液は前もってオートクレーブで滅菌しておきます。使用前に培養液を室温まで冷まします。また寒天は50から55°Cに冷却し、抗生物質を加えてプレートに移します。そして固まるまで室温で待ちます。
冷凍庫に保管しておいたバクテリアをまず氷の上で融解させ、抗生物質を添加していない寒天プレートに播種し、一晩37°Cで培養します。
無菌操作で寒天プレートからバクテリアのコロニーを選別し、500mLの培養液に加え一晩37°Cでシェーカーを使って培養します。
細胞が増殖するまでの間に、蒸留水を用いて10%となるようにグリセロールを希釈します。
その溶液をオートクレーブにかけその後4°Cまで冷却します。
吸光度を測定しバクテリアが対数増殖期中つまりDNA採取の最適時であることを確認します。この期間に達したら細胞を氷の上に置き、その後の工程は氷の上で行います。
次に、細胞を大きな遠心チューブ2本に分割し4°Cで遠心分離します。上澄みを除去し、氷冷済み滅菌水100mLで懸濁させます。このステップを少なくともあと1回繰り返します。この目的は塩を取り除くためであり、その後のエレクトロポレーションの効率に大きく影響します。
50mLの10%グリセロールであと２回洗浄し、その後バクテリアを同じ溶液で再懸濁させます。
50mLの細胞 をマイクロチューブに分注します。これらを使い実験を開始できますが、常に4°Cに保つようにして下さい。もしくは急速冷凍し-80℃で保存します。
エレクトロポレーション法は多くのアプリケーションに役立ちます。
エレクトロポレーション法の代わりにヒートショックを用いた形質転換誘導法があります。塩化カルシウム処理後に熱を加えバクテリアにDNAを導入する方法です。
一般的にヒートショック法はエレクトロポレーション法に比べバクテリアへのダメージが少なく、低い塩濃度にする必要もありません。またプラスミドに目的遺伝子を挿入するライゲーション反応にも利用することができます。さらに、ヒートショック法は高価な装置やキュベットを必要とせず、低コストで実施することができます。その一方、ヒートショック法は、形質転換効率が悪く、時間もかかります。さらに、エレクトロポレーション法が哺乳類細胞にまで応用できるのに対し、その使用はバクテリア、酵母、植物プロトプラストに限られます。
ここではマウス胎児繊維芽細胞をエレクトロポレーション用キュベットにロードしています。エレクトロポレーション後にプラスミドにコードされたGFPを生成する細胞を観察することで形質転換効率を確認できます。トランスフェクションとは哺乳類細胞を形質転換する手法であり、バクテリア細胞のときよりも低い電界強度と高い時定数が要求されます。
エレクトロポレーション法は動物にも利用可能で、例えば発生中のニワトリの胚にも適用できます。プラスミドDNAをひな鳥の脳に注入し、エレクトロポレーションプルーブを使って脳組織に電場をかけます。一日二日で、プラスミドによりコードされた緑又は赤色蛍光タンパク質がニューロンで生成され、脳の発達段階における構造変化を観察することができます。
ここまでJoVEエレクトロポレーション法を利用したバクテリアの形質転換入門編をご覧いただきました。このビデオでは、形質転換に最も適したDNAであるプラスミドについて、エレクトロポレーション法の生物物理学的メカニズム、一般的な工程、そしてエレクトロポレーション法の哺乳類動物への適用を紹介しました。ご覧いただきありがとうございました。
