我々は慎重に原稿を読み取るためのハンス·ライナー干拓、マーティン·フールマンとウォーカージャクソンに感謝します。 、神経変性疾患におけるセンター·オブ·エクセレンス（COEN、著者は、国家ノルト-ウェストファリア（SR）、計算論的神経科学におけるBMBF-ProjekträgerDLR米国ドイツコラボレーション（SR CRCNS）の研究MIWF省から提供された資金提供を受けた; SR）、およびボン大学学内資金調達プログラム（BONFOR; SR）。

1。システム要件<ol><li>顕微鏡システム：デンドライトの良い可視化は非常に重要です。可能であれば、二光子レーザー走査型顕微鏡システムを使用してください。サファイア超高速パルスレーザー（カメレオンウルトラII、コヒーレント）と高NA目的：我々の実験では、Tiを装備TRIM範囲II、LaVisionバイオ、ビーレフェルト、ドイツやウルティマIVシステム、プレーリー·テクノロジーズ、ミドルトン、ウィスコンシン州で使用（60X、0.9 NA、オリンパス）我々は、パッチピペットを介して蛍光色素に満ちていた樹状突起を可視化する。光損傷が2光子スキャンを使用してそれほど深刻であると考えられているが、レーザパワーを低減（組織における下8 mW）とし、滞留時間（以下1μ秒）又はできるだけ。 </li><li>第二の可能性は、可能な限り露光時間を短縮するために獲得と同期して広視野蛍光光源（LEDや蛍光灯）をトリガすることである。我々は、統合された光源（TILLPhoとモノクロを使用しているDodtコントラスト赤外線照明（TILLPhotonics、Grafelfingから、ドイツ）が装備されていたツァイスAxioskop 2 FS正立顕微鏡でトニック、Grafelfingから、ドイツ）。我々の実験において、露光時間は、通常、10ミリ秒から最大であった。 30ミリ秒。 </li><li> 例えば 2チャンネルマイクロイオントフォレーシスシステム高速キャパシタンス補償MVCS-C-02（NPI電子、タム、ドイツ）、高速マイクロイオン導入·アンプを使用してください。先の細いイオントフォレーシス微小電極は、25の抵抗がある - MΩ100（決定的にチップサイズやピペットの形状に応じて）、およびイオン導入アンプの容量補正を最適にチューニングされている場合、高速の立ち上がり時間にのみ達成することができます。この高速補償はイオン導入ピペットにサブミリ秒の範囲内で簡潔かつ迅速な開始と電流パルスを印加することにより、1ミクロン以下の13スポットサイズでの高空間分解能でトランスミッタを排出することが必要である。イオントフォレーシスアンプはアルです我々は我々の研究室でテストされていないいくつかの他の企業から入手できるそう。これらのデバイスは、静電容量補償回路を備えていない我々の知る限りである。 </li></ol> 2。ソリューションを準備<ol><li>人工脳脊髄液（ACSF）、それが実験的な設計のために必要とされるように内部溶液を調製。必要とされる内部のソリューションは、唯一の追加は、光学機器に応じて、赤または緑の蛍光色素（ 例えば 50〜200μMアレクサフルーア488または594ヒドラジド、Invitrogen社）である。 mm単位で、解剖のために使用することができますACSF スクロースはこちら例：60のNaCl、100スクロース、2.5のKCl、1.25のNaH 2 PO 4、26のNaHCO 3、1のCaCl 2、5のMgCl 2、20グルコース、および通常ACSF用mMの中でパッチクランプ実験のためのソリューション：125のNaCl、3のKCl、1.25のNaH 2 PO 4、26のNaHCO 3、2.6のCaCl 2、1.3のMgCl 2、15グルコース。 </li><li>すべての細胞外の溶液絶えず（95％O 2、5％CO 2）Carbogenize。 </li><li> mMのは、例えば、内部の溶液を調製：140 K-グルコン酸、7のKCl、5 HEPES酸、0.5のMgCl 2、5クレアチンリン酸、0.16 EGTA、50と- 200μMアレクサ488。 </li><li>グルタミン酸マイクロイオントフォレーシスは150mMのグルタミン酸で溶液を調製し、NaOHでpHを7.0に調整した。可視化のための50 -200μMアレクサフルーア488または594ヒドラジド（Invitrogen）を追加します。 </li><li> GABAのイオン導入は1 M GABA溶液を調製し、HCl 15を5にpHを調整する。このpH GABAが充電される時にのみ、それはイオントフォレーシスを用いて適用することができる。溶液中の低pHは細胞外空間に排出することに注意してくださいでは、GABA伝達自体16,17に影響を与える可能性があります。 年上の解決策は、その有効性を失うことができるので、光からGABAソリューションを保護し、頻繁に新鮮なGABAストック溶液を調製。 </li><li>それはGABA作動性イベント、ハイテクを参照することが困難である場合GH Cl -のドライビングフォース内部ソリューションは、塩化カリウムを除外するなどして、GABAトフォレーシスが機能しているかどうかを確認するGABA作動性のイベントを可視化するために役立つかもしれない、しかし、生理的な駆動力が推奨されることがありシナプス統合を検討する。小さ ​​なGABA作動性イベントの一般的な検出のために、 図8Cに示すプロトコルは助けることができます。 </li></ol> 3。イオン導入ピペットを引いて、テスト<ol><li>一般的には、右のピペットを引っ張ると多分制御、神経伝達物質のイオン導入を達成するための最も重要なステップです。細胞培養においてイオントフォレーシスを使用する場合は、鋭い微小電極10と同様の非常に微細な電極をプルすることができる。それらは角度で組織に下降しているときに、急性スライスにおけるパッチクランプ実験では、しかしながら、これらの非常に薄いピペットは不可能深い樹状突起に到達すること、スライス面上に曲げる。 </li><li>したがって、そう、非常に小さなチップでピペットを引くこといいえNeurotransmitterは漏れることができますが、先端はまだ組織（ 図2）に侵入するのに十分な剛性でなければならない。またはP-97プーラー、サター器械の会社、例えば、150ギガバイトF 8Pクラスピペット（科学製品、ホフハイム、ドイツ）と水平プラー（例えばDMZ-ユニバーサルプーラー、ザイツ·インスツルメンツ社、マルティンス、ドイツ使用、急な角度（ 図2および表2）を用いて小開口ではなく、短いタッパを達成するために、いくつかの引上げ工程とノヴァト、カリフォルニア州）。 </li><li> 10イオン導入ピペットをプルする石英ガラスピペットを使用することも可能である。これらは、良好な機械的特性を有するように、より信頼できるものと想定しているが、特殊なレーザ引き手が必要である。しかし、それは通常、パッチピペットを引っ張るために使用される通常のガラスピペットで良好な結果を達成することも可能である。 </li><li>最初にのためにそれらを使用する前に、組織なしでチャンバー内ピペット性能と抵抗をテスト時間は、グルタミン酸の漏洩以来、組織に悪影響を及ぼす可能性がある。 </li><li>正しくイオントフォレーシスアンプを設定します。その後、神経伝達物質と染料を含む溶液をピペットを記入し、お風呂（ACSF）にそれを置きます。 </li><li>容量（ 図3）を補う。通常、非常に鋭いピペットは鈍いものより高い容量を持つことになります。 </li><li>ピペットの抵抗をチェックします：ここで使用マイクロイオントフォレシスアンプはピペットの抵抗を測定するためのビルドの機能があります。これは、標準的なオシロスコープまたは集録ソフトウェアを使ってコンピュータに接続されたA / Dボードで監視することができます簡単な長方形のテストパルスを、呼び起こす。形状とチップサイズに応じて、先端が25間の抵抗を持っている必要があります - MΩ90。 </li><li>ピペットチップの外に蛍光染料が漏れた場合は60Xまたは40X水浸対物レンズと蛍光イメージングへのスイッチで可能であれば先端に焦点を当て、ズームイン、（GLUの場合は小さな正を適用玉手）または負は（GABA、 図4の場合）（&lt;0.02μA）現在保持している。それが漏れをキャンセルするために役立つていない場合は、ピペットを変更してください。 </li><li>強力なステップ電流を適用するか、手動トリガを使用し、溶液をピペットの外に排出することができるかどうかを確認するために蛍光画像で先端を監視します。上述したように、パルス電流の極性が吐出されることになっている分子の電荷に依存している。グルタミン酸を取り出すには、それは負の電流とGABAのために正の電流（ 図4）である。 </li><li>染料と送信機のブロック吐出を、高い排出現在の数倍を適用することによってクリアすることができますことをピペット内の空気が泡。 </li><li>そこには目に見える漏れはありませんし、テスト排出が成功した場合、一緒になって、静電容量を補償し、実験を開始します。 </li><li>注意：容量補正は、フィードバック回路により達成されるので、それがovercompであれば、この回路はオーバーシュートや発振することができるensated。優しく容量補正のダイヤル設定を使用します。 </li><li>フィラメントのプロパティを変更しているかもしれないので、プーラー安定性に応じて、それは、時には随時プラー設定を調整する必要がある。一旦良好なピペットが設計されれば、それは数日間使用することができる。したがって、実験を終えた後、先端に損傷を与えることなく、密閉容器にイオン導入ピペットを格納します。 </li><li>次の実験では特性（ 例えば抵抗）が大幅に変更する場合は先端をクリアしてから、チェックするために、いくつかの強力なイジェクトパルスを印加する、神経伝達物質の溶液をピペットを埋める。その後、静電容量を補償して、再度ピペットを使用しています。別の神経伝達物質のソリューションを単一のピペットを使用しないでください。 </li></ol> 4。脳スライスを準備<ol><li>マイクロイオントフォレーシスが初めて使用される場合間違いなく確実に作業プーラープログラムを確立した後、スライスを調製。 </li> &lt;あなたの機関や地方自治体の動物ケアのガイドラインに従った李&gt;行う麻酔と断頭手続き。 </li><li>脳を除去した後、氷冷ACSF スクロース （プロトコル2.1を参照）に転送します。 </li><li>適切な厚さ（例えば300μm以下）のスライスに関心領域をカットします。 </li><li> 30分間35℃でACSF スクロース内のスライスをインキュベートする。その後、室温で通常のACSFを含む水没保持室に転送します。 </li><li>調製及び実験を通して95％O 2、5％CO 2でスライスを囲むACSFをcarbogenize。 </li></ol> 5。ホールセル記録を確立する<ol><li>ホールセルモードを確立した後、長期的なポジショニングを回避するために、パッチを適用する前にセルをすでにスライス表面付近のイオントフォレーシスピペット（s）を配置します。 </li><li>低抵抗パッチピペット（3 - mΩの5）を引き、dでそれを埋めるあなたがたは、内部の溶液を含有し、ピペットに正圧（30 - 60ミリバール）を適用します。 </li><li>視覚的な指導の下、お風呂とアプローチセル（赤外線dodtコントラストまたは2つの光子のグラデーションのコントラスト画像）を入力します。 </li><li>電圧クランプモードでのテストパルス（ 例えば -10 mVで、20ミリ秒）とピペット抵抗を監視します。オフセット電位を修正する組織に触れたとき。 </li><li>セルに近づくと &quot;ディンプル&quot;ははっきりと見ることができるようになるまで静かにそこにピペットの先端を押してください。 60ミリバール負圧にし、-65 mVまで膜電位を切り替える - 直ちにピペットの圧力を解放し、40を適用します。 </li><li> 100 pAの下に現在の流域の値を保持する場合には、負圧を解放します。 </li><li>ギガシールを確立した後（抵抗&gt; 1GΩ）、ピペットまたはキャパシタンス補償回路の簡単な過補償に短い、強力な吸引と破裂膜。 </li><li>どのモードに応じて（電圧または電流クランプ）が必要です実験的なデザインのため、適切に補う。 </li><li>その最終的な位置にイオン導入ピペットを持って開始します。成功したパッチクランプ記録を実行する方法の詳細な説明が必要な場合は、18,19利用可能ないくつかの優れたガイドラインがあります。 </li></ol> 6。イオン導入ピペットを置き、シナプス後イオン導入の可能性を生成する<ol><li>一般的には、イオン導入イベントはGABAマイクロイオントフォレシス用ソーマや軸索イニシャルセグメント、樹状シャフトで、グルタミン酸マイクロトフォレーシス用のとげの樹状突起で、例えば、所望の実験に応じて定義されている場所で誘発することができます。 </li><li>それに触れずに1μm程度の距離にセルをアップアプローチ。興味のある位置に到達した後、それは神経伝達物質が漏れ出していないし、ピペット容量が正しく補正されていることをしていることが重要です。 </li><li>イオン導入pipettいっぱいグルタミン酸を細胞に近づいた場合eは膜電位の検出可能な脱分極を引き起こし、可能であれば現在の保持、またはピペットを変え調整します。 </li><li> 、短い負の電流パルスを印加ゼロから開始し（ 例えば 0.1から0.4ミリ、0.01から1μAパルス）系統的に電流を増加。これは、イオン導入、現在は、特定の実験のセットアップに必要な反応を呼び起こすどの範囲で調べるのに役立ちます。 </li><li>無応答検出がない場合は、ピペット数百μmを持ち上げ、先端をきれいにする（&gt; 0.1μA）強いイジェクト電流を適用する。 、静電容量を補正して、細胞に近づき、再度実行してください。 </li><li>応答がまだ存在しない場合、現在保持して減らす。この手順は、制御不能な神経伝達物質の放出を引き起こす可能性がありますので、ダイヤル設定と非常に注意してください。したがって、常に膜電位の各変化を検出するために記録を監視します。 </li><li>それはGABA作動性イベントを検出することは困難である場合には、人が使用することができるnの内部溶液組成は、高い塩素で降伏-駆動力を。ピペット溶液中の濃度（プロトコルセクション2.6を参照してください） -これを達成するために、塩素を減らす。これは、より高い駆動力によって静止膜電位で大きくGABA作動性イベントが発生します。 </li><li>また、-48 mVの（ 図8C）に-100 mVの膜電位からのチャンスをもたらし長時間電流ステップを注入。このプロトコルClで-駆動力が脱分極GABA応答を引き起こす過分極電位に上昇する。 </li><li>それは、イベントのGABA作動性を決定するのに役立ち誘発事象の逆転電位を決定する工程電流注入プロトコルを使用することも可能である。 GABAの漏れ、グルタミン酸の漏洩よりも検出が困難である。この場合には、入力抵抗の一定の監視がGABA充填されたピペットに近づくとき、助けることができる。入力抵抗が減少した場合、電流およびBを保持するeが増加又は異なるピペットを使用すべきである。 </li><li>グルタミン酸イオントフォレシス用対照実験として、我々は200μMOGB-1とグルタミン酸をリークが原因である可能性があり、ローカルカルシウム流入を可視化するピペット溶液のないEGTAを用いて、Ca 2 +のイメージング実験を示唆している。 </li><li>一般的に、安定した応答を達成するためには、経時的ドリフトを避けるために、機械的に安定なピペットを持っていることは非常に重要である。ドリフトは、温度変化が原因で発生することができ、したがって、それは、熱ドリフトを回避するための機器で測定する前に、少なくとも半時間を切り替えることをお勧めします。ピペットホルダーとチップで良いカートリッジシールを必ず使用して実際に固定されています。ホルダー自体はさらにテフロンテープで固定することができ、さらに、また、ドリフトの潜在的な源であるヘッドステージやマニピュレータ、からのケーブルには緊張感がないことを確認してください。 </li></ol>

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著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

ここでは、樹状突起上のシナプス統合を調査するために、神経伝達物質の高速マイクロイオントフォレシスを適用する方法を説明します。この技術は、正常in vitroおよびin vivo 9,20-22 で異なる脳領域におけるグルタミン酸とGABA作動性シナプス伝達を調査するために使用されている。マイクロイオントフォレーシスは60年以上も使用されてきたが、初期の頃には主に、ロー?...

中枢神経系のニューロンは、その薄いと分岐した樹状プロセス1のシナプス入力の様を受け取る。そこに、興奮性樹入力の大部分は、グルタミン酸作動性シナプスによって媒介される。これらのシナプスは、興奮性シナプス後電位（EPSPを）のシナプス後線形統合で、その結果、空間的に分散した方法で起動することができます。シナプスが同時にと樹状突起上の空間的に近接して活性化される場合、これらの興奮性入力は上記非線形統合されており、樹状突起スパイク2-5を生成することができます。 さらに、興奮性入力の統合は、樹状ツリー上の入力の場所によって異なります。遠房地域に到着した信号は、はるかに減衰ケーブルフィルタ6のために近位の入力よりも。海馬では、尖タフト樹状突起への遠い入力は近dendri上のものとは異なる脳の領域によって生成されTES 7。刺激的な質問は、異なる樹状コンパートメントによって樹状統合は、さまざまな方法で神経発火でこれらの階層の入力の影響を調整した場合どのように処理されるかシナプス入力、ことである。 機能特性、樹状突起の形態的な特徴だけでなく、入力の場所とクラスタリングは決定的にグルタミン酸作動性シナプス8,9の有効性を決定することも興奮性入力が、GABA作動性の端末からの追加の抑制性入力の樹統合に影響を与えている。シナプス統合のこれらの様々な側面は、理想的には、樹状ドメインに別の神経伝達物質の空間的に定義されたアプリケーションを可能にする神経伝達物質のマイクロイオン導入を用いて調査することができます。我々は成功したニューロンに信号積分を調査するために、グルタミン酸とGABAのマイクロイオントフォレシスを確立する方法をここに示しています。 このアプリケーションでは、先の細い濃縮された神経伝達物質溶液を充填した高抵抗ピペットが使用される。これらのピペットは、神経伝達物質受容体が位置するセルの外膜に近接して配置されている。樹枝の良い可視化が必要である。これは、最良のパッチピペットを介して導入される蛍光色素を用いて達成される。その後、非常に短い（&lt;1ミリ秒）パルス電流（10の範囲内の - 100 nAの）を入れ、神経伝達物質の分子を取り出すために使用されます。これらの短いパルスと実効容量の補償と、シナプス後電位または電流は興奮性入力の位置が正確に分かっていることを意味する高い時間·空間的精度を誘発することができます。グルタミン酸マイクロイオン導入（ 図1 9）ここに示されているように6未満である定義された半径内にシナプスを活性化することができますが、それは、単一シナプス決議10-12を達成することも可能です。 ハイネ、M. ら </emは&gt;その空間分解能を示したの速いマイクロイオン導入であっても定期的にグルタミン酸13の二光子アンケージングで達成スポットサイズよりも小さい場合は0.5μm、以下のサイズを見つけるために調整することができます。高速のマイクロイオントフォレシスでは、2つまたはそれ以上のイオン泳動ピペットを使用して、樹状突起で異なる、さらに遠い箇所にそれらを配置することが容易に可能である。このように、異なる経路からのものを含む興奮性事象の統合を検討することができる。それは同時にグルタミン酸とGABA充填されたイオン導入ピペットを使用することも可能である。このようにして興奮入力（オンパス、オフ経路阻害）に対して異なる位置におけるGABA作動性抑制の効果を研究することができる。また、特定の神経細胞のドメインを標的とする介在による阻害の影響は、遠位樹状突起のように、ソーマまたは軸索14は 、GABAイオン導入を用いて検討することができます。培養神経細胞では、高速のマイクロイオントフォレシスはinveの機会を提供しています単一のシナプス分布とはるかに詳細10,11のニューロンにおけるシナプス伝達の基本側面をstigate。 この記事では、入力位置、入力強度、タイミング、単独または相互作用での依存性に興奮性と抑制性入力のシナプス統合を調査可能に急性脳スライス、で使用するためのグルタミン酸やGABAイオントフォレシスを確立する方法を詳細に示しています。私たちは、この技術の利点と限界を指摘し、どのように成功したトラブルシューティング方法になります。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon laser scanning microscope (TRIM Scope II), and Ultima IV, Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin)</td>
			<td>LaVision Biotec, Bielefeld, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two-photon laser scanning microscope Ultima IV</td>
			<td>Prairie Technologies, Middleton, Wisconsin, USA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ti:Sapphire ultrafast-pulsed laser</td>
			<td>Chameleon Ultra II, Coherent</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X Objective, NA 0.9</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Axioskop 2 FS upright microscope</td>
			<td>TILLPhotonics, Gr&auml;felfing, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monochromator</td>
			<td>TILLPhotonics, Gr&auml;felfing, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-iontophoresis system MVCS-02</td>
			<td>NPI Electronics, Tamm, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter puller P-97</td>
			<td>Sutter Instrument Company, Novato, CA</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass filaments (150 GB F 8P)</td>
			<td>Science Products, Hofheim, Germany</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>Reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 hydrazide</td>
			<td>Molecular Probes life technologies</td>
			<td>A-10436</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>Molecular Probes life technologies</td>
			<td>A-10438</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8282</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S6297</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G7528</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K-Gluconate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G4500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES-acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H4034</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphocreatin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>E3889</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8415</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GABA</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A5835</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09137.1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.09108.1000</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fast micro-iontophoresis of glutamate and gaba: a useful tool to investigate synaptic integration

神経科学の根本的利益の一つは、最終的には軸索における活動電位の神経出力につながる樹木、非常に複雑な構造に沿って興奮性と抑制性入力の統合を理解することです。ニューロンの出力上の特定のシナプス入力の多様な空間的および時間的パラメータの影響は、樹状入力の距離依存減衰、空間的に分離され、入力の場所に依存した相互作用、興奮統合、線形上GABAergig阻害の影響を、たとえば 、現在調査中ですと非線形統合モード、および多く。 グルタミン酸およびGABAの迅速なマイクロイオン導入で、それは正確にグルタミン酸作動性興奮及び抑制の空間的および時間的統合を調査することができる。重大な技術的要件は、トリガ蛍光灯、発光ダイオード（LED）、または2つの光子SCAある組織の有意な光損傷を導入することなく樹枝を可視化する顕微鏡nning。また、高抵抗ピペットの迅速な容量補正を可能にするマイクロイオントフォレーシス増幅器を有することが非常に重要である。もう一つの重要なポイントは、送信機が思わず実験中にピペットで放出されていないということです。 いったん確立された、この手法は、高い神経伝達物質と位置特異性で信頼性と再現性のあるシグナルを与える。グルタミン酸やGABAアンケージングに比べて、高速イオン導入は視野に限定することなく、同時に、非常に遠い場所で両方のトランスミッタを使用できます。軸索の焦点電気刺激と比較して利点もある。マイクロイオントフォレシス、入力部位の位置が明確に知られており、それが関心のある神経伝達物質のみが解除されていることを確認される。しかし、それだけで、マイクロイオントフォレシスであることを考慮する必要がありポストシナプスが活性化され、神経伝達物質の放出のシナプス前側面が解決されません。この記事では、脳スライス実験でマイクロイオントフォレシスを設定する方法を示します。

イオントフォレーシスの空間的な広がりを決定する簡単な方法は、排出されたグルタミン酸を一定に保ちながら、デンドライトから段階的にイオン導入ピペットを後退させることである。我々は、マイクロイオン導入刺激の空間的な範囲は約12ミクロン（ 図1半径を示す）の直径を持っていたことが分かった。どのように深部組織にイオン導入を使用することができるピペットの?...

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Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

この記事では、高い空間的および時間的な精度を持つシナプス信号の統合を調査するための技術として、神経伝達物質の高速マイクロイオン導入をご紹介します。

グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

fast-micro-iontophoresis-glutamate-gaba-useful-tool-to-investigate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.4K ビュー.  University of Bonn. この記事では、高い空間的および時間的な精度を持つシナプス信号の統合を調査するための技術として、神経伝達物質の高速マイクロイオン導入をご紹介します。

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Cut-loading: A Useful Tool for Examining the Extent of Gap Junction Tracer Coupling Between Retinal Neurons

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic transmission. Increasing evidence indicates that gap junctions not only permit electrical current flow and synchronous activity between interconnected or coupled cells, but that the strength or effectiveness of electrical communication between coupled cells can be modulated to a great extent1,2. In addition, the large internal diameter (~1.2 nm) of many gap junction channels permits not only electric current flow, but also the diffusion of intracellular signaling molecules and small metabolites between interconnected cells, so that gap junctions may also mediate metabolic and chemical communication. The strength of gap junctional communication between neurons and its modulation by neurotransmitters and other factors can be studied by simultaneously electrically recording from coupled cells and by determining the extent of diffusion of tracer molecules, which are gap junction permeable, but not membrane permeable, following iontophoretic injection into single cells. However, these procedures can be extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural tissue.
Numerous studies on electrical synapses and the modulation of electrical communication have been conducted in the vertebrate retina, since each of the five retinal neuron types is electrically connected by gap junctions3,4. Increasing evidence has shown that the circadian (24-hour) clock in the retina and changes in light stimulation regulate gap junction coupling3-8. For example, recent work has demonstrated that the retinal circadian clock decreases gap junction coupling between rod and cone photoreceptor cells during the day by increasing dopamine D2 receptor activation, and dramatically increases rod-cone coupling at night by reducing D2 receptor activation7,8. However, not only are these studies extremely difficult to perform on neurons with small somata in intact neural retinal tissue, but it can be difficult to adequately control the illumination conditions during the electrophysiological study of single retinal neurons to avoid light-induced changes in gap junction conductance.
Here, we present a straightforward method of determining the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons under different illumination conditions and at different times of the day and night. This cut-loading technique is a modification of scrape loading9-12, which is based on dye loading and diffusion through open gap junction channels. Scrape loading works well in cultured cells, but not in thick slices such as intact retinas. The cut-loading technique has been used to study photoreceptor coupling in intact fish and mammalian retinas7, 8,13, and can be used to study coupling between other retinal neurons, as described here.

An easy and convenient method to determine the extent of gap junction tracer coupling between retinal neurons is described. This technique enables one to investigate the function of the electrical synapses between neurons in the intact retina under different illumination conditions and at different times of the day and night.

カットローディング：網膜ニューロン間ギャップ結合トレーサーカップリングの程度を調べるための便利なツール

In addition to chemical synaptic transmission, neurons that are connected by gap junctions can also communicate rapidly via electrical synaptic ...

神経科学

MPI CyberMotion Simulator: Implementation of a Novel Motion Simulator to Investigate Multisensory Path Integration in Three Dimensions

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. Humans can do path integration based exclusively on visual 2-3, auditory 4, or inertial cues 5. However, with multiple cues present, inertial cues - particularly kinaesthetic - seem to dominate 6-7. In the absence of vision, humans tend to overestimate short distances (&lt;5 m) and turning angles (&lt;30&deg;), but underestimate longer ones 5. Movement through physical space therefore does not seem to be accurately represented by the brain.
Extensive work has been done on evaluating path integration in the horizontal plane, but little is known about vertical movement (see 3 for virtual movement from vision alone). One reason for this is that traditional motion simulators have a small range of motion restricted mainly to the horizontal plane. Here we take advantage of a motion simulator 8-9 with a large range of motion to assess whether path integration is similar between horizontal and vertical planes. The relative contributions of inertial and visual cues for path navigation were also assessed.
16 observers sat upright in a seat mounted to the flange of a modified KUKA anthropomorphic robot arm. Sensory information was manipulated by providing visual (optic flow, limited lifetime star field), vestibular-kinaesthetic (passive self motion with eyes closed), or visual and vestibular-kinaesthetic motion cues. Movement trajectories in the horizontal, sagittal and frontal planes consisted of two segment lengths (1st: 0.4 m, 2nd: 1 m; &plusmn;0.24 m/s2 peak acceleration). The angle of the two segments was either 45&deg; or 90&deg;. Observers pointed back to their origin by moving an arrow that was superimposed on an avatar presented on the screen.
Observers were more likely to underestimate angle size for movement in the horizontal plane compared to the vertical planes. In the frontal plane observers were more likely to overestimate angle size while there was no such bias in the sagittal plane. Finally, observers responded slower when answering based on vestibular-kinaesthetic information alone. Human path integration based on vestibular-kinaesthetic information alone thus takes longer than when visual information is present. That pointing is consistent with underestimating and overestimating the angle one has moved through in the horizontal and vertical planes respectively, suggests that the neural representation of self-motion through space is non-symmetrical which may relate to the fact that humans experience movement mostly within the horizontal plane.

An efficient way to gain insight into how humans navigate themselves in three dimensions is described. The method takes advantage of a motion simulator capable of moving observers in ways unattainable by traditional simulators. Results confirm that movement in the horizontal plane is underestimated, while vertical movement is overestimated.

MPI Cyber​​Motionシミュレータ：三次元的に多感覚パスの統合を調査するための新しいモーションシミュレータの実装

Path integration is a process in which self-motion is integrated over time to obtain an estimate of one's current position relative to a starting point 1. ...

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall neural circuit function. Synapse strength critically depends on the abundance of neurotransmitter receptors clustered at synaptic sites on the postsynaptic membrane. Receptor levels are established developmentally, and can be altered by receptor trafficking between surface-localized, subsynaptic, and intracellular pools, representing important mechanisms of synaptic plasticity and neuromodulation. Rigorous methods to quantify synaptically-localized neurotransmitter receptor abundance are essential to study synaptic development and plasticity. Fluorescence microscopy is an optimal approach because it preserves spatial information, distinguishing synaptic from non-synaptic pools, and discriminating among receptor populations localized to different types of synapses. The genetic model organism Caenorhabditis elegans is particularly well suited for these studies due to the small size and relative simplicity of its nervous system, its transparency, and the availability of powerful genetic techniques, allowing examination of native synapses in intact animals.
Here we present a method for quantifying fluorescently-labeled synaptic neurotransmitter receptors in C. elegans. Its key feature is the automated identification and analysis of individual synapses in three dimensions in multi-plane confocal microscope output files, tabulating position, volume, fluorescence intensity, and total fluorescence for each synapse. This approach has two principal advantages over manual analysis of z-plane projections of confocal data. First, because every plane of the confocal data set is included, no data are lost through z-plane projection, typically based on pixel intensity averages or maxima. Second, identification of synapses is automated, but can be inspected by the experimenter as the data analysis proceeds, allowing fast and accurate extraction of data from large numbers of synapses. Hundreds to thousands of synapses per sample can easily be obtained, producing large data sets to maximize statistical power. Considerations for preparing C. elegans for analysis, and performing confocal imaging to minimize variability between animals within treatment groups are also discussed. Although developed to analyze C. elegans postsynaptic receptors, this method is generally useful for any type of synaptically-localized protein, or indeed, any fluorescence signal that is localized to discrete clusters, puncta, or organelles.
The procedure is performed in three steps: 1) preparation of samples, 2) confocal imaging, and 3) image analysis. Steps 1 and 2 are specific to C. elegans, while step 3 is generally applicable to any punctate fluorescence signal in confocal micrographs.

Automated Quantification of Synaptic Fluorescence in C. elegans

The abundance of neurotransmitter receptors clustered at synapses strongly influences synaptic strength. This method quantifies fluorescently-labeled neurotransmitter receptors in three dimensions with single-synapse resolution in C. elegans, allowing hundreds of synapses to be rapidly characterized within a single sample without distortions introduced by z-plane projection.

シナプス蛍光の自動定量<em&gt; C.エレガンス</em

Synapse strength refers to the amplitude of postsynaptic responses to presynaptic neurotransmitter release events, and has a major impact on overall ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

アストロサイトトランスポーター電流のデコンボリューション解析グルタミン酸クリアランスの時間経過の導出

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Using an &#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell surface mobility1-7. To study receptor cell surface localization and endocytosis, the technique described here combines the use of fluorescent &#945;-bungarotoxin with cells expressing constructs containing an &#945;-bungarotoxin (Bgt) binding site (BBS). The BBS (WRYYESSLEPYPD) is based on the &#945; subunit of the muscle nicotinic acetylcholine receptor, which binds Bgt with high affinity8,9. Incorporation of the BBS site allows surface localization and measurements of receptor insertion or removal with application of exogenous fluorescent Bgt, as previously described in the tracking of GABAA and metabotropic GABAB receptors2,10. In addition to the BBS site, we inserted a pH-sensitive GFP (pHGFP11) between amino acids 4 and 5 of the mature GABAAR subunit by standard molecular biology and PCR cloning strategies (see Figure 1)12. The BBS is 3&#39; of the pH-sensitive GFP reporter, separated by a 13-amino acid alanine/proline linker. For trafficking studies described in this publication that are based on fixed samples, the pHGFP serves as a reporter of total tagged GABAAR subunit protein levels, allowing normalization of the Bgt labeled receptor population to total receptor population. This minimizes cell to cell Bgt staining signal variability resulting from higher or lower baseline expression of the tagged GABAAR subunits. Furthermore the pHGFP tag enables easy identification of construct expressing cells for live or fixed imaging experiments.

Using an &amp;#945;-Bungarotoxin Binding Site Tag to Study GABA A Receptor Membrane Localization and Trafficking

Here we demonstrate the use of fluorescent Alexa dye coupled to &#945;-bungarotoxin to measure GABA A receptor surface localization and endocytosis in hippocampal neurons. Through the use of constructs bearing a short extracellular tag that binds &#945;-bungarotoxin, analysis of plasma membrane protein endocytic trafficking can be achieved.

GABA A受容体の膜局在化および輸送を研究するために、α-ブンガロトキシン結合部位タグを使用して

It is increasingly evident that neurotransmitter receptors, including ionotropic GABA A receptors (GABAAR), exhibit highly dynamic trafficking and cell ...

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In particular, endogenously-generated network activity, which strongly varies as a function of the state of vigilance, significantly modulates neuronal computation. To investigate how different spontaneous cerebral dynamics impact single neurons&#39; integrative properties, we developed a new experimental strategy in the rat consisting in suppressing in vivo all cerebral activity by means of a systemic injection of a high dose of sodium pentobarbital. Cortical activities, continuously monitored by combined electrocorticogram (ECoG) and intracellular recordings are progressively slowed down, leading to a steady isoelectric profile. This extreme brain state, putting the rat into a deep comatose, was carefully monitored by measuring the physiological constants of the animal throughout the experiments. Intracellular recordings allowed us to characterize and compare the integrative properties of the same neuron embedded into physiologically relevant cortical dynamics, such as those encountered in the sleep-wake cycle, and when the brain was fully silent.

Induction of an Isoelectric Brain State to Investigate the Impact of Endogenous Synaptic Activity on Neuronal Excitability In Vivo

This procedure performs long-lasting in vivo intracellular recordings from single neurons during physiologically relevant cerebral states and after complete abolition of ongoing electrical activities, resulting in an isoelectric brain state. The physiological constants of the animal are carefully monitored during the transition to the artificial comatose condition.

等電点電気泳動脳の状態の誘導は、神経細胞の興奮に内因性シナプス活性の影響を調査するために、<em&gt;インビボ</em

The way neurons process information depends both on their intrinsic membrane properties and on the dynamics of the afferent synaptic network. In ...

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer's Mouse Models

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying Alzheimer's disease, Parkinson's disease, depression, and anxiety. Traditionally, microdialysis has been the most common (lauded) technique to examine neurotransmitter changes that occur in these disorders. But because microdialysis has the ability to measure slow 1-20 minute changes across large areas of tissue, it has the disadvantage of invasiveness, potentially destroying intrinsic connections within the brain and a slow sampling capability. A relatively newer technique, the microelectrode array (MEA), has numerous advantages for measuring specific neurotransmitter changes within discrete brain regions as they occur, making for a spatially and temporally precise approach. In addition, using MEAs is minimally invasive, allowing for measurement of neurotransmitter alterations in vivo. In our laboratory, we have been specifically interested in changes in the neurotransmitter, glutamate, related to Alzheimer's disease pathology. As such, the method described here has been used to assess potential hippocampal disruptions in glutamate in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Briefly, the method used involves coating a multi-site microelectrode with an enzyme very selective for the neurotransmitter of interest and using self-referencing sites to subtract out background noise and interferents. After plating and calibration, the MEA can be constructed with a micropipette and lowered into the brain region of interest using a stereotaxic device. Here, the method described involves anesthetizing rTg(TauP301L)4510 mice and using a stereotaxic device to precisely target sub-regions (DG, CA1, and CA3) of the hippocampus.

Using Enzyme-based Biosensors to Measure Tonic and Phasic Glutamate in Alzheimer&#039;s Mouse Models

Here, we describe the setup, software navigation, and data analysis for a spatially and temporally precise method of measuring tonic and phasic extracellular glutamate changes in vivo using enzyme-linked microelectrode arrays (MEA).

アルツハイマー病のマウスモデルにおけるトニックと相性グルタミン酸を測定するための酵素ベースのバイオセンサーを使用して

Neurotransmitter disruption is often a key component of diseases of the central nervous system (CNS), playing a role in the pathology underlying ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

生体内培養-高速、シンプルで、安価な AWESAM プロトコルを使用してマウスのアストロ サイトのように

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Combining Optogenetics with Artificial microRNAs to Characterize the Effects of Gene Knockdown on Presynaptic Function within Intact Neuronal Circuits

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a workflow on how to combine artificial microRNA (miR)-mediated RNA interference with optogenetics to achieve selective stimulation of manipulated presynaptic boutons in acute brain slices. The experimental approach involves the use of a single viral construct and a single neuron-specific promoter to drive the expression of both an optogenetic probe and artificial miR(s) against presynaptic gene(s). When stereotactically injected in the brain region of interest, the expressed construct makes it possible to stimulate with light exclusively the neurons with reduced expression of the gene(s) under investigation. This strategy does not require the development and maintenance of genetically modified mouse lines and can in principle be applied to other organisms and to any neuronal gene of choice. We have recently applied it to investigate how the knockdown of alternative splice isoforms of presynaptic P/Q-type voltage-gated calcium channels (VGCCs) regulates short-term synaptic plasticity at CA3 to CA1 excitatory synapses in acute hippocampal slices. A similar approach could also be used to manipulate and probe the neuronal circuitry in vivo.

This protocol provides a workflow on how to combine artificial microRNA-mediated RNA interference with optogenetics to stimulate specifically presynaptic boutons with reduced expression of selective gene(s) within intact neuronal circuits.

オプトジェネティクスを組み合わせてそのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子ノックダウンの効果を特徴付ける人工マイクロ Rna

The purpose of this protocol is to characterize the effect of gene knockdown on presynaptic function within intact neuronal circuits. We describe a ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

感受性グリシン/D-セリン、グルタミン酸と NMDA 受容体を研究する高スループット カルシウム変化分析

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...