この研究は、著者らはS. DurryとC. Roderigo専門家の技術支援のために、とM.Dübbert（電子技術研究所、動物学研究所に感謝したいCRRするドイツ科学財団（DFG、Ro2327 / 6-1）の助成金によってサポートされていましたポッケルスセルコントローラとHFスイッチを実装する助けをケルン、大学、ドイツ）。

<ol>
	<li>Rose, C. R., Kovalchuk, Y., Eilers, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+Na++imaging+in+spines+and+fine+dendrites+of+central+neurons.">Two-photon Na+ imaging in spines and fine dendrites of central neurons.</a> Pflueg. Arch., Eur. J. Phy. 439, 201-207 (1999).</li><li>Rose, C. R., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+Na++signals+in+spines+and+dendrites.">NMDA receptor-mediated Na+ signals in spines and dendrites.</a> J. Neurosci. 21, 4207-4214 (2001).</li><li>Meier, S. D., Kovalchuk, Y., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+new+fluorescent+Na++indicator+CoroNa+Green:+comparison+with+SBFI+and+confocal+Na++imaging.">Properties of the new fluorescent Na+ indicator CoroNa Green: comparison with SBFI and confocal Na+ imaging.</a> J. Neurosci. Meth. 155, 251-259 (2006).</li><li>Lamy, C., Chatton, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+probing+of+sodium+dynamics+in+neurons+and+astrocytes.">Optical probing of sodium dynamics in neurons and astrocytes.</a> NeuroImage. 58, 572-578 (2011).</li><li>Lasser-Ross, N., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+voltage+and+synaptically+activated+sodium+transients+in+cerebellar+Purkinje+cells.">Imaging voltage and synaptically activated sodium transients in cerebellar Purkinje cells.</a> Proc. Roy. Soc. B-Biol. Sci. 247, 35-39 (1992).</li><li>Bennay, M., Langer, J., Meier, S. D., Kafitz, K. W., Rose, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sodium+signals+in+cerebellar+Purkinje+neurons+and+Bergmann+glial+cells+evoked+by+glutamatergic+synaptic+transmission.">Sodium signals in cerebellar Purkinje neurons and Bergmann glial cells evoked by glutamatergic synaptic transmission.</a> Glia. 56, 1138-1149 (2008).</li><li>Baranauskas, G., David, Y., Fleidervish, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+mismatch+between+the+Na++flux+and+spike+initiation+in+axon+initial+segment.">Spatial mismatch between the Na+ flux and spike initiation in axon initial segment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 110, 4051-4056 (2013).</li><li>Fleidervish, I., Lasser-Ross, N., Gutnick, M., Ross, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na++imaging+reveals+little+difference+in+action+potential-evoked+Na++influx+between+axon+and+soma.">Na+ imaging reveals little difference in action potential-evoked Na+ influx between axon and soma.</a> Nat. Neurosci. , 852-860 (2010).</li><li>Denk, W., Piston, D., Webb, W., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 445-458 (1995).</li><li>Jaffe, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+spread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">The spread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Boccaccio, A., Sagheddu, C., Menini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flash+photolysis+of+caged+compounds+in+the+cilia+of+olfactory+sensory+neurons.">Flash photolysis of caged compounds in the cilia of olfactory sensory neurons.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Ikrar, T., Olivas, N., Shi, Y., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+inhibitory+neuronal+circuits+by+laser+scanning+photostimulation.">Mapping inhibitory neuronal circuits by laser scanning photostimulation.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+acute+hippocampal+slices+from+rats+and+transgenic+mice+for+the+study+of+synaptic+alterations+during+aging+and+amyloid.">Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Pannasch, U., Sibille, J., Rouach, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+electrophysiological+recordings+of+synaptically-evoked+astroglial+and+neuronal+responses+in+acute+hippocampal+slices.">Dual electrophysiological recordings of synaptically-evoked astroglial and neuronal responses in acute hippocampal slices.</a> J. Vis. Exp. , (2012).</li><li>Minta, A., Tsien, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+indicators+for+cytosolic+sodium.">Fluorescent indicators for cytosolic sodium.</a> J. Biol. Chem. 264, 19449-19457 (1989).</li><li>Kuruma, A., Inoue, T., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Ca(2+)+and+Na(+)+in+the+dendrites+of+mouse+cerebellar+Purkinje+cells+evoked+by+parallel+fibre+stimulation.">Dynamics of Ca(2+) and Na(+) in the dendrites of mouse cerebellar Purkinje cells evoked by parallel fibre stimulation.</a> Eur. J. Neurosci. 18, 2677-2689 (2003).</li><li>Despa, S., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na/K+pump+current+and+[Na](i)+in+rabbit+ventricular+myocytes:+Local+[Na](i)+depletion+and+Na+buffering.">Na/K pump current and [Na](i) in rabbit ventricular myocytes: Local [Na](i) depletion and Na buffering.</a> Biophys. 84, 4157-4166 (2003).</li><li>Regehr, W., Tank, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+concentration+dynamics+produced+by+synaptic+activation+of+CA1+hippocampal+pyramidal+cells.">Calcium concentration dynamics produced by synaptic activation of CA1 hippocampal pyramidal cells.</a> J. Neurosci. 12, 4202-4223 (1992).</li><li>Kushmerick, M. J., Podolsky, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+mobility+in+muscle+cells.">Ionic mobility in muscle cells.</a> Science. 166, 1297-1298 (1969).</li><li>Palma-Cerda, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+caged+neurotransmitter+analogs+selective+for+glutamate+receptor+sub-types+based+on+methoxynitroindoline+and+nitrophenylethoxycarbonyl+caging+groups.">New caged neurotransmitter analogs selective for glutamate receptor sub-types based on methoxynitroindoline and nitrophenylethoxycarbonyl caging groups.</a> Neuropharmacology. 63, 624-634 (2012).</li><li>Trigo, F., Corrie, J., Ogden, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+photolysis+of+caged+compounds+at+405+nm:+photochemical+advantages,+localisation,+phototoxicity+and+methods+for+calibration.">Laser photolysis of caged compounds at 405 nm: photochemical advantages, localisation, phototoxicity and methods for calibration.</a> J. Neurosci. Meth. 180, 9-21 (2009).</li><li>Nikolenko, V., Peterka, D., Araya, R., Woodruff, A., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+light+modulator+microscopy.">Spatial light modulator microscopy.</a> Cold Spring Harbor protocols. , 1132-1141 (2013).</li></ol>

著者らは、競合する利害を宣言しません。著者らは、ビデオの記事で使用した機器を生産ラップ光電子（ヴェーデル、ドイツ）でオープンアクセス出版を可能にする財政支援を受けた。同社は、実験でも、データの取り扱いにも、原稿執筆に関与でもなかった。

本研究は、SBFI、小さな細胞区画内の細胞内ナトリウム過渡の二光子イメージングのために適していることを示している。これは、SBFIの量子効率が15かなり低く、ナトリウム濃度の相対変化は、生理活性を有する非常に小さいことが、念頭に置かなければならない。このように、微細プロセス中のNa +トランジェントの高分解能測定は、比較的面倒な作業であり、いくつかの試験のビニングまたは平均化は満足なシグナルを得るために必要であり得る。また、ナトリウム過渡の動力学は長期間にわたって記録することが義務付けこと、驚くほど遅い。この観察結果は、ニューロンの樹状突起とアストロサイト中のナトリウム過渡の単一指数減衰を室温1,2,6で10秒の範囲で、大きな減衰時間定数を特徴とした以前の研究、のものに対応しています。ナトリウムは過渡は、このようにはるかに遅い時間の共同を発揮すると思われるURSEカルシウムトランジェント16と比較してはるかに大きい減衰時間定数。 これらの欠点を脇に置き、ナトリウムイメージングは​​、ニューロンのサブドメインの生理学的特性の調査のための貴重なツールであることが分かる。例えば、ナトリウムイメージングは​​大気圧または近いアクティブなシナプスの興奮性シナプス活性をモニターするために役立つことができる。ナトリウムは、本質的に8,17にバッファリングされていないので、活性誘発性ナトリウムトランジェントが直線的シナプスのグルタミン酸放出の広い範囲に関連するか、または外因的にグルタミン酸を適用する。彼らは、それゆえ、ニューロンのグルタミン酸作動性活性を直接かつ公平な指標を表す。また、ナトリウム指示色素は、高いK dをのを示す（SBFIのK dは 25 mMの1の範囲である）。 （ - 1mMの通常0.5）、高K d &#39; は sは、染料自体が複数のバッファとして作用しないことを意味するものであっても十分な明るさを達成するために使用される比較的高い細胞内の色素濃度で憎悪。その結果、彼らは常にカルシウム感受性色素が細胞18内に導入される懸念である、ナトリウムトランジェントの振幅も、時間経過を歪めていない。したがって、検出された信号が細胞内ナトリウムで「本当の」変化の良好な尺度を表すと仮定することができる。彼らの遅い時間のコースは、その後ニューロンにおけるナトリウムのための細胞内拡散に速度が以前に19を想定よりもはるかに小さいことを意味します。 スパインと樹状突起への興奮性シナプス伝達とナトリウム流入経路の性質に対処した実験の実行が成功するための重要な要件は、シナプス後の構造の迅速かつ高度に局在活性化の誘導である。これは背骨のすぐ近くやケージド化合物の閃光光分解によるデンドライトグルタミン酸またはグルタミン酸アゴニストの迅速かつ局所適用することによって得ることができる。フラッシュ光分解は、機械的にDAMAないGE組織は、モーションアーチファクトを含まず、同様に関連の質問の調査（ 例えば 、ローカルカルシウムシグナル伝達）のために確立されています。アンケージングスポットの直径は、xy平面で1.5μmであった。棘と親樹状突起の両方にナトリウム信号を誘起伊勢デンドライトに近いアンケージング。信号がアンケージングスポットに近い棘で最大の傾向にあったのに対し、親樹状突起での振幅と棘遠くにはまだアンケージングスポットのすぐ近くのものにかなり類似していた。アンケージングは​​、内向き電流の振幅が増大し、その間に300ミリ秒を行った。アンケージドグルタミン酸は、さらに離れアンケージングスポットから樹状突起領域および棘上イオンチャネル型グルタミン酸受容体およびナトリウム流入を活性化し、同じ期間中に組織内に拡散した可能性があります。 細胞入浴液を通して投与ケージド化合物の光分解のためのUVレーザーを使用したときに発生する本質的な問題「内側のフィルタリングは &#39;です。そのためケージの高吸収率の、UV光は刺激部位20,21対物から道に沿って強く減衰される。これを回避する実現可能な方法は、さらに最小限に必要なケージド化合物の量を減少させる刺激部位に制限されているケージを持つローカル灌流である。 UVレーザー走査媒介アンケージング、近赤外二光子アンケージング22と比較して、刺激の精度が、z軸が増加する主な理由は、空間的に、より正確である。による二光子励起に用いられるようなより長い波長のために一般的に使用されるケージの小さな断面と、一方、高ケージド化合物の濃度または非常に高いのいずれか、潜在的に毒性の光強度が必要とされる。また、二光子アンケージング機器はるかに高い投資が必要となる。とりわけ、追加のIRレーザーに加えて必要な光学部品は、必要とされている。 SBFIおよびMNI-グルタミン酸の両方が同一の波長範囲で励起可能である。これはアンケージングフラッシュ、および/またはIRビームによるグルタミン酸の連続アンケージングによってSBFIの漂白で、その結果、紫外線アンケージングレーザーおよびSBFIまたはIRイメージングレーザとMNI-グルタミン酸の意図しない相互依存性につながる可能性があります。 図6（c）に示すようにしかし、それだけで紫外線フラッシュも多光子イメージングどちらも私たちの実験条件下でそのような相互的な効果をもたらした。 ここに記載したものと同様のUVフラッシュシステムは、多くの他の研究室で日常的に使用され、比較的容易に既存の多光子イメージング顕微鏡に組み込むことができる。これは、光分解のためにレーザビームを視野内に自由に配置することができるという利点を提供する。さらに、システムは、実験中の視野内に、それぞれ、レーザビームと放出量の迅速かつ自動化された再配置を可能にする。王イメージングソフトウェアのフレームが合同イメージングとアンケージングフレームを調整するために役立つことができるように、r個の修飾は、アンケージングスポットの正確な位置決めを簡素化し、改善する。 まとめると、全細胞パッチクランプおよび中枢神経細胞の樹状突起と棘での多光子ナトリウムイメージング、グルタミン酸の紫外線光誘起アンケージングための修正された手順と組み合わせることで、組織内のグルタミン酸受容体の信頼性が高く、焦点の活性化を可能にします。従って、無傷組織におけるニューロンにおける興奮性シナプス伝達およびシナプス後ナトリウム信号の特性を分析するために役立つことができる。

このような多光子顕微鏡などの光顕微鏡技術における最近の改善は、高い空間および時間分解能で無傷の組織中の脳細胞の形態学的および生理学的パラメータの研究を可能にした。電気と組み合わされ、これらの技術は、現在広くすなわち微細な樹状突起と樹状突起棘に、小さい細胞内コンパートメントにおけるニューロン上の活動に関連する電気信号、ならびに付随するカルシウムシグナルを分析するために使用される。カルシウムトランジェントに加えて、シナプス活性はまた、樹状突起と棘ナトリウム信号を誘導する、の特性が大幅に未調査である。このような信号は、iが有意な色素漂白または光損傷1,2なし長期間トランジェント（ 私の[Na +]）の[Na +]のオンライン測定を可能にする細胞内ナトリウムの二光子イメージングにより分析することができる。 の[Na +] iの画像化のための</&gt;サブ、わずか化学指示色素には、 例えば 、コロナグリーンまたはアサンテナトリウム-グリーン3,4用意されています。のNa +イメージングのための最も一般的に使用される蛍光プローブは、ナトリウム-結合ベンゾフランイソフタレート（SBFI）である。これは、よく知られているカルシウム感受性色素のfura-2と同様のレシオメトリック、UV励起色素であり、多くの細胞型（ 例えば、5,6）従来のNa +イメージングのために使用されている。刺激的な色素およびその蛍光を収集する異なる可能性がある。高い時間分解能（ すなわち高い撮像フレームレート）、空間情報との組み合わせで必要とされる場合、SBFI、高速電荷検出キセノンアークランプ、または高出力発光ダイオード（LED）素子とその発光によって励起することができ共役型デバイス（CCD）カメラ7,8。深部組織の最大の空間分解能のために、多光子レーザー走査顕微鏡は、選択9の方法である。比較的低い量子efficie（ - 2mMの0.5）、そして鋭い微小電極10またはパッチピペット1を介してSBFIの膜不透過形の直接読み込みSBFIのNCYは、比較的高い染料濃度を必要とする。 SBFIを使用して、げっ歯類の海馬の急性組織切片で行わ以前の仕事は主に1,2受容体、イオンチャネル型NMDAを通してナトリウムの流入によって引き起こされるCA1錐体ニューロンの樹状突起と棘での活動に関連したナトリウムトランジェントを実証した。より詳細には、ローカルナトリウム信号の特性の研究のために、受容体アゴニストを適用することによって、シナプス後受容体の特異的活性化は、任意の適し方法である。シナプス前活動と伝達物質の放出を模倣するには、アプリケーションが比較的短いこと、地域的刺激を可能にするために集中しなければならない。しかし、これは、無傷の組織において非常に困難であることが分かる。先の細いピペットを用いて受容体アゴニストの局所加圧は非常に焦点のpを可能にひだが、（ 例えば、樹状突起、または樹状突起棘のような）関心構造の運動を生成するための潜在的なリスクをホストし、かつ、高分解能イメージングを妨げる。神経活性物質のイオントフォレーシスの適合性は、それらの電気的性質に依存し、高電流振幅は、同様に細胞のアーティファクトを生成することができる。 これらの障害を回避する一つの方法は、光活​​性化化合物およびそれらの閃光光分解の採用である。基本的には、二つの異なる原理ケージ物質の光活性化のために使用されている：私は）広い視野閃光光分解11およびII）レーザ12と組み合わせて、スキャンモジュールを採用し、焦点アンケージング。広視野閃光光分解が関心の大きな領域を活性化するために使用されているが、 例えば、セル全体は、焦点アンケージングは、特に小細胞区画を刺激するために使用される。本研究では、全細胞パッチクランプおよびマルチpに対する手順を実証組織内のグルタミン酸受容体の信頼性が高く、焦点活性化を可能にする、グルタミン酸の紫外線光誘導アンケージングのための修正された手順と組み合わせた中枢ニューロンの樹状突起と棘におけるhotonナトリウムイメージング、。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1138">
	<tbody>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;width:239px;">Hadrware/Software Component</td>
			<td style="width:231px;">Manufacturer</td>
			<td style="width:183px;">Type</td>
			<td style="width:487px;">Comment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Borosilicate-glass capillaries</td>
			<td>Hilgenberg</td>
			<td>1405059</td>
			<td>75 mm x 2 mm, wall thickness 0.3 mm</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Camera</td>
			<td>Jenoptik</td>
			<td>ProgRes MF</td>
			<td>IR-DIC compatible camera</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Deconvolution software</td>
			<td>SVI</td>
			<td>Huygens Pofessional X11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Fiber optic spectrometer</td>
			<td>Ocean Optics</td>
			<td>USB 4000</td>
			<td>Miniature fiber optic spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Filter tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>cenrifugal filter, 0.2 &#181;m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Imaging software</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>Flowview Ver 5.0c, Tiempo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR beam power controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td>Laser beam intensity control + fast switch to zero on flyback via pockels cell</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR laser</td>
			<td>SpectraPhysics</td>
			<td>Mai-Tai VF-N1S</td>
			<td>fs-pulsed Ti:Sa tunable laser (710-990 nm); CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">IR power monitor</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Micromanipulator</td>
			<td>Burleigh</td>
			<td>PCS 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Microscope/Imaging System</td>
			<td>Olympus Europe</td>
			<td>BX51WI/FV300</td>
			<td>Both, the microscope and the imaging systems were strongly modified</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">ND filter wheel</td>
			<td>Newport</td>
			<td>50Q04AV.2</td>
			<td>UV fused silica, optical density 0.05-2.0</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Objective</td>
			<td>Nikon Instruments Europe</td>
			<td>NIR Apo 60x/1.0w</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Patch clamp amplifier</td>
			<td>HEKA</td>
			<td>EPC-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pipette puller</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>Model PP-830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pneumatic drug ejection system</td>
			<td>NPI Electronic</td>
			<td>PDES-DXH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>350-80 LA-BK</td>
			<td>EOM, used as fast switch and for power adjustment</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Pockels cell driver</td>
			<td>Conoptics</td>
			<td>M302-RM</td>
			<td>High voltage differential amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>LS6ZM2</td>
			<td>ALMgF2-coated BeCu blades</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter controller</td>
			<td>Custom built</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Shutter driver</td>
			<td>Vincent Associates</td>
			<td>Uniblitz VCM D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Slicer / Vibratome</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Microm HM 650 V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Uncaging software</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA40 1.1.2.6 + NetCam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser&#160;</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>DL-355/10</td>
			<td>cw DPSSL Laser, 355 nm; 10 mW; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">UV laser scanning system</td>
			<td>Rapp OptoElectronic</td>
			<td>UGA 40</td>
			<td>Galvanometric scanning system</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">Name of Compound</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td></td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">CNQX</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-127</td>
			<td>AMPA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">DL-AP5</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J64210</td>
			<td>NMDA receptor antagonist; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">SBFI K+ Salt</td>
			<td>Teflabs</td>
			<td>OO32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">TTX</td>
			<td>Ascent Scientific</td>
			<td>Asc-055</td>
			<td>Inhibitor of voltage-dependent Na+ channels; CAUTION</td>
		</tr>
		<tr height="33">
			<td height="33" style="height:33px;">NMI-caged-L-Glutamate</td>
			<td>Torcis</td>
			<td>1490</td>
			<td>Caged glutamatereleased upon UV absobtion</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multi-photon intracellular sodium imaging combined with uv-mediated focal uncaging of glutamate in ca1 pyramidal neurons

多光子蛍光顕微鏡は、高い空間および時間分解能で無傷組織における脳細胞の形態学的および生理学的パラメータの分析を可能にした。電気生理学と組み合わせることで、それは広く、樹状突起と樹状突起棘のような小さな細胞内コンパートメントでの活動に関連したカルシウムシグナルを研究するために使用されている。カルシウムトランジェントに加えて、シナプス活性はまた、シナプス後ナトリウム信号を誘導する、の特性がわずかに理解されている。ここでは、組み合わせたホールセルパッチクランプおよび中枢ニューロンの細胞ミクロドメインにおける多光子ナトリウムイメージングのための方法を記載する。さらに、私たちは組織内のグルタミン酸受容体の信頼性が高く、焦点活性化を可能にする、グルタミン酸の紫外線（UV）-LIGHT誘発性アンケージングのために変更された手順を紹介します。この目的のために、全細胞記録は、 アンモン角細分1（CA1）の急性組織切片における錐体ニューロンで行ったマウスの海馬。ニューロンは、パッチピペットを介してナトリウム感受性蛍光色素SBFIで満たされ、SBFIの多光子励起は樹状突起と隣接する棘の可視化を可能にしました。 UV誘発焦点アンケージングを確立するために、光強度、UVアンケージングビームの影響を受け、ボリューム、ビームの位置だけでなく、ケージド化合物の濃度を含むいくつかのパラメータがテストされ、最適化された。らの結果は、ケージドグルタミン酸（MNI-グルタミン酸）とそのローカル灌流及び樹状突起と棘内向き電流およびナトリウムトランジェントにおいてその焦点紫外線アンケージング結果を示す。時間経過と内向き電流およびナトリウム信号の両方の振幅はアンケージングパルスの持続時間と相関する。さらに、本発明者らの結果は、彼らがこの経路しかしナトリウム流入によって媒介されることを実証し、細胞内ナトリウム信号は、イオンチャネル型グルタミン酸受容体に対するブロッカーの存在下でブロックされていることを示している。要約すると、私たちの方法は、信頼性の高いツールを提供しています無傷の脳組織における焦点受容体活性化によって誘導される細胞内ナトリウム信号の調査。

本研究では、急性マウス海馬組織切片のCA1錐体ニューロンにおけるナトリウム依存性蛍光色素SBFI付き携帯ナトリウムダイナミクスの多光子顕微鏡法のための手順を示す。また、私たちは神経活性化合物のレーザー走査系のアンケージング（ 例えばケージグルタミン酸）で、このイメージング技術を組み合わせて、携帯のマイクロドメインへのターゲティング、その正確な方法を示しています。 パッチピペットを通してSBFIでニューロンをロードすると、多光子励起（ 図6A、B、D及び図7A）を用いて微細な樹状突起と隣接する棘を含むセル全体の可視化を可能にした。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" width="500" /> 図6ナトリウム信号やケージグルタミン酸の閃光光分解により誘導されたシナプス電流（A）マキシムパッチピペット（PP）を介してSBFIを搭載したCA1錐体ニューロンのアル投影像。ボックスは、B、LPに拡大して示す領域がケージグルタミン酸のローカル灌流のためのピペットの位置と方向を示していることを示します。（B）は 、隣接する樹状突起棘と樹状突起の光学切片のスタックの高出力の最大投影。光学切片のスタックは、Zアライメントとデコンボリューションを受けた。赤い十字はアンケージングビームの標的領域を示している。オレンジ色の点線は、蛍光発光を記録し、そこから関心領域の輪郭を描く。 （黄色フラッシュで示される）ケージドグルタミン酸のフラッシュ光分解によって誘導される電流（ 下段 ）内向きナトリウム信号（ 上段 ）および体細胞：ボックスは左D.（C）に拡大して示す領域を示している。赤線は実験データのフィットを表す。灰色の領域は、内アンケージングフラッシュ（300期間を表しミリ秒）SBFI蛍光のイメージングを妨げ右：ケージグルタミン酸による事前灌流なしでは、同じUV-フラッシュがSBFI発光の変化、また内向き電流を誘発でもない（D）左 ：。ハイパワーデンドライトのイメージと隣接と並んでBに描写されるように、反転したグレー値と同じ画像をスパイン。点線は、蛍光発光が記録された関心領域を示している。赤い十字はアンケージングビームの局在を示している右：ケージグルタミン酸の紫外線フラッシュ光分解によって誘導されたナトリウムトランジェント。ブルートレース：樹状突起中のナトリウムシグナル;赤線：アンケージングスポットに隣接する3つのスパインからの応答を平均化し、緑のトレース：3遠い棘からの応答を平均した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig6highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版についてはこちらをご覧ください。</a> リテーナ入りローカル灌流した後、グルタミン酸、デンドライトに近い紫外線フラッシュを適用すると、細胞内のナトリウム濃度（ 図6C、Dおよび図7B）の増加を反映し、SBFIの蛍光発光の過渡的な減少をもたらした。同時に、内向き電流は、体細胞（ 図6Cおよび図7B）で記録した。 UVフラッシュの持続時間を増やすと、システムがよく、そのダイナミックレンジ内とアンケージングも細胞性いずれの応答が飽和したことであったことを示し、両方の電流およびナトリウム信号（データは示していない）内向きの誘発の振幅の増加をもたらした。ケージグルタミン酸で前灌流されていなかったスライスと同じ又はより長い持続時間の紫外線フラッシュの適用は、これらの信号は、グルタミン酸のアンケージング（ 図6C）によるものであることを示す、SBFI蛍光も内向き電流の変化を誘発したことはありません。さらに、これらの結果はimaging-とアンケージング成分のない相互依存性がuで観察されないことを示して私たちの実験条件ファインダー。ナトリウムは信号も樹状突起棘（ 図6D）で検出することができた。私たちが唯一のグルタミン酸アンケージングを持つ単一の背骨の刺激を達成しようとしなかったが、ピーク振幅は棘がさらに離れ、親樹状突起（ 図6D）とほぼ同一の蛍光変化を示したのに対し、アンケージングスポットに近い棘がやや高い傾向にあった。 最後に、グルタミン酸のアンケージングに応じて、樹状突起と棘にナトリウム流入のための経路を検討した。この目的のために、私たちはそれぞれAMPA-およびNMDAサブタイプのナトリウム透過性、イオンチャネル型グルタミン酸受容体に選択的なブロッカーであるCNQXとAPVを採用。本発明者らの結果は、グルタミン酸誘導性細胞内ナトリウム信号と誘発された体細胞電流は、これらのブロッカー（ 図7B）の存在下で省略されたことを示している。ブロッカーのウォッシュアウトすると、信号が回復している。これは股関節を実証グルタミン酸のTアンケージングは​​、細胞内のナトリウムの過渡現象と内向き電流で、その結果、樹状突起と棘へのナトリウムの流入を仲介するCA1錐体ニューロン、上のイオンチャネル型グルタミン酸受容体を活性化する。 <img alt="図7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" width="600" /> 誘発ナトリウム信号と内向き電流の図7の薬理学的プロファイル。 （A）細胞体に取り付けられたパッチピペット（PP）とのSBFIで満たされたCA1錐体ニューロン（B）左：樹状突起と棘添付でのケージのグルタミン酸の光活性化によって誘導されたナトリウムの過渡および体細胞の電流センター：灌流イオンチャネル型グルタミン酸受容体遮断薬CNQXとAPVは、ナトリウム信号とアンケージングによって誘発される内向き電流の両方を阻害する右：ブロッカーのウォッシュアウトすると、信号が復元されます。赤いラインrepresen実験データの適合のts。灰色の領域は、アンケージングフラッシュ（300ミリ秒）がSBFI蛍光のイメージングを妨げている期間を表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52038/52038fig7highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版についてはこちらをご覧ください。</a>

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Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

私たちは、全細胞パッチクランプおよびマウス脳の急性組織切片における樹状突起および海馬ニューロンのスパインにおける細胞内ナトリウム過渡の多光子イメージングによる神経活性化合物の焦点UV誘導光活性化の組合せを記載。

CA1錐体ニューロンにおけるグルタミン酸のUV媒介焦点アンケージングと組み合わせることで、多光子細胞内ナトリウムイメージング

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.9K ビュー.  Heinrich Heine University Düsseldorf. 私たちは、全細胞パッチクランプおよびマウス脳の急性組織切片における樹状突起および海馬ニューロンのスパインにおける細胞内ナトリウム過渡の多光子イメージングによる神経活性化合物の焦点UV誘導光活性化の組合せを記載。 

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Optical Imaging of Neurons in the Crab Stomatogastric Ganglion with Voltage-sensitive Dyes

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous activity of participating neurons leads to the emergence of the integral functionality of the network. Here we present the methodology of application of this technique to identified pattern generating neurons in the crab stomatogastric ganglion. We demonstrate the loading of these neurons with the fluorescent voltage-sensitive dye Di-8-ANEPPQ and we show how to image the activity of dye loaded neurons using the MiCAM02 high speed and high resolution CCD camera imaging system. We demonstrate the analysis of the recorded imaging data using the BVAna imaging software associated with the MiCAM02 imaging system. The simultaneous voltage-sensitive dye imaging of the detailed activity of multiple neurons in the crab stomatogastric ganglion applied together with traditional electrophysiology techniques (intracellular and extracellular recordings) opens radically new opportunities for the understanding of how central pattern generator neural networks work.

Here we present the methodology for fast and high resolution fluorescent voltage-sensitive dye imaging of detailed activity of neurons in the crab stomatogastric ganglion.

電位感受性色素を持つカニ口と胃の神経節における神経細胞の光学的イメージング

Voltage-sensitive dye imaging of neurons is a key methodology for the understanding of how neuronal networks are organised and how the simultaneous ...

神経科学

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

Optogenetic methods have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity underlying a diverse set of behaviors across a broad range of species. Optogenetic tools of microbial origin consist of light-sensitive membrane proteins that are able to activate (e.g., channelrhodopsin-2, ChR2) or silence (e.g., halorhodopsin, NpHR) neural activity ingenetically-defined cell types over behaviorally-relevant timescales. We first demonstrate a simple approach for adeno-associated virus-mediated delivery of ChR2 and NpHR transgenes to the dorsal subiculum and prelimbic region of the prefrontal cortex in rat. Because ChR2 and NpHR are genetically targetable, we describe the use of this technology to control the electrical activity of specific populations of neurons (i.e., pyramidal neurons) embedded in heterogeneous tissue with high temporal precision. We describe herein the hardware, custom software user interface, and procedures that allow for simultaneous light delivery and electrical recording from transduced pyramidal neurons in an anesthetized in vivo preparation. These light-responsive tools provide the opportunity for identifying the causal contributions of different cell types to information processing and behavior.

A Method for High Fidelity Optogenetic Control of Individual Pyramidal Neurons In vivo

The recent development of neuroscience tools that combine genetics and optics, termed "optogenetics", enables control over neural circuit activity with an unprecedented level of spatial and temporal resolution. Here we provide a protocol for integrating in vivo recording with optogenetic manipulation of genetically-defined subsets of prefrontal cortical and subicular pyramidal neurons.

個々の錐体細胞のハイフィデリティOptogenetic制御法<em&gt;インビボ</em

Optogenetic methods  have emerged as a powerful tool for elucidating neural circuit activity  underlying a diverse set of behaviors across a broad range ...

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of neurophysiology, neuroethology, and developmental biology. The goal of this report is to consolidate experimental techniques from the leech system into a single article that will be of use to physiologists with expertise in other nervous system preparations, or to biology students with little or no electrophysiology experience. We demonstrate how to dissect the leech for recording intracellularly from identified neural circuits in the ganglion. Next we show how individual cells of known function can be removed from the ganglion to be cultured in a Petri dish, and how to record from those neurons in culture. Then we demonstrate how to prepare a patch of innervated skin to be used for mapping sensory or motor fields. These leech preparations are still widely used to address basic electrical properties of neural networks, behavior, synaptogenesis, and development. They are also an appropriate training module for neuroscience or physiology teaching laboratories.

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

This article describes three nervous system preparations using leeches: intracellular recording from neurons in ventral ganglia, culturing neurons from ventral ganglia, and recording from a patch of innervated skin to map sensory fields.

細胞内記録、感覚野のマッピング、および培養は、リーチのニューロンを同定しヒルドmedicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

グルタミン酸とGABAの高速マイクロイオン導入：シナプス統合を調査するために便利なツール

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

アストロサイトトランスポーター電流のデコンボリューション解析グルタミン酸クリアランスの時間経過の導出

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

焦点放射線阻害と大人の視床下部ニューロン新生の機能的な尋問

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Olfactory Neurons Obtained through Nasal Biopsy Combined with Laser-Capture Microdissection: A Potential Approach to Study Treatment Response in Mental Disorders

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium carbonate. Animal studies as well as human genetic studies indicate that lithium affects molecular targets that are involved in neuronal growth, survival and maturation, and notably molecules involved in Wnt signaling. Given the ethical challenge to obtaining brain biopsies for investigating dynamic molecular changes associated with lithium-response in the central nervous system (CNS), one may consider the use of neurons obtained from olfactory tissues to achieve this goal.The olfactory epithelium contains olfactory receptor neurons at different stages of development and glial-like supporting cells. This provides a unique opportunity to study dynamic changes in the CNS of patients with neuropsychiatric diseases, using olfactory tissue safely obtained from nasal biopsies. To overcome the drawback posed by substantial contamination of biopsied olfactory tissue with non-neuronal cells, a novel approach to obtain enriched neuronal cell populations was developed by combining nasal biopsies with laser-capture microdissection. In this study, a system for investigating treatment-associated dynamic molecular changes in neuronal tissue was developed and validated, using a small pilot sample of BD patients recruited for the study of the molecular mechanisms of lithium treatment response.

In this study, a novel platform to investigate intraneuronal molecular signatures of treatment response in bipolar disorder (BD) was developed and validated. Olfactory epithelium from BD patients was obtained through nasal biopsies. Then laser-capture microdissection was combined with Real Time RT PCR to investigate the molecular signature of lithium response in BD.

レーザーキャプチャーマイクロダイセクションで鼻生検併用して得られた嗅覚ニューロン：精神疾患における治療応答を研究するために潜在的なアプローチ

Bipolar disorder (BD) is a severe neuropsychiatric disorder with poorly understood pathophysiology and typically treated with the mood stabilizer, lithium ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

感染ニューロンの3-Dイメージングと分析<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;トキソプラズマ</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

Combined Optogenetic and Freeze-fracture Replica Immunolabeling to Examine Input-specific Arrangement of Glutamate Receptors in the Mouse Amygdala

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to study the molecular composition of membranes produced a significant decline in its use. Recently, there has been a major revival in freeze-fracture electron microscopy thanks to the development of effective ways to reveal integral membrane proteins by immunogold labeling. One of these methods is known as detergent-solubilized Freeze-fracture Replica Immunolabeling (FRIL).
The combination of the FRIL technique with optogenetics allows a correlated analysis of the structural and functional properties of central synapses. Using this approach it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their respective expression of a tagged channelrhodopsin and specific molecular markers. The distinctive appearance of the postsynaptic membrane specialization of glutamatergic synapses further allows, upon labeling of ionotropic glutamate receptors, to quantify and analyze the intrasynaptic distribution of these receptors. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to prepare paired replicas and how to immunolabel them. We will also discuss the caveats and limitations of the FRIL technique, in particular those associated with potential sampling biases. The high reproducibility and versatility of the FRIL technique, when combined with optogenetics, offers a very powerful approach for the characterization of different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.
Here, we provide an example how this approach was used to gain insights into structure-function relationships of excitatory synapses at neurons of the intercalated cell masses of the mouse amygdala. In particular, we have investigated the expression of ionotropic glutamate receptors at identified inputs originated from the thalamic posterior intralaminar and medial geniculate nuclei. These synapses were shown to relay sensory information relevant for fear learning and to undergo plastic changes upon fear conditioning.

This article illustrates how the expression of neurotransmitter receptors can be quantified and the pattern analyzed at synapses with identified pre and postsynaptic elements using a combination of viral transduction of optogenetic tools and the freeze-fracture replica immunolabeling technique.

複合光遺伝学および凍結破砕レプリカ免疫標識をマウス扁桃体におけるグルタミン酸受容体の入力固有の配置を検討すること

Freeze-fracture electron microscopy has been a major technique in ultrastructural research for over 40 years. However, the lack of effective means to ...

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of pyramidal neurons and dendritic spines, a ballistic labeling technique can be utilized. In the present protocol, pyramidal neurons are labeled with DilC18(3) dye and analyzed using neuronal reconstruction software to assess neuronal morphology and dendritic spines. To investigate neuronal structure, dendritic branching analysis and Sholl analysis are performed, allowing researchers to draw inferences about dendritic branching complexity and neuronal arbor complexity, respectively. The evaluation of dendritic spines is conducted using an automatic assisted classification algorithm integral to the reconstruction software, which classifies spines into four categories (i.e., thin, mushroom, stubby, filopodia). Furthermore, an additional three parameters (i.e., length, head diameter, and volume) are also chosen to assess alterations in dendritic spine morphology. To validate the potential of wide application of the ballistic labeling technique, pyramidal neurons from in vitro cell culture were successfully labeled. Overall, the ballistic labeling method is unique and useful for visualizing neurons in different brain regions in rats, which in combination with sophisticated reconstruction software, allows researchers to elucidate the possible mechanisms underlying neurocognitive dysfunction.

We present a protocol to label and analyze pyramidal neurons, which is critical for evaluating potential morphological alterations in neurons and dendritic spines that may underlie neurochemical and behavioral abnormalities.

脳スライスと一次細胞培養における錐体ニューロンの弾道標識

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...