著者らは、プラットフォームの資金調達、およびサポートのためにゲノムカナダ、ゲノムブリティッシュ·コロンビア州を承認したいと思います。また、原稿と編集支援の重要なレビューのために博士はキャロルE.パーカーに感謝します。 CHLもサポートしてくれてありがとうブリティッシュコロンビア州プロテオミクス·ネットワーク。

1。組織セクショニング<ol><li>フラッシュフリーズ問題片を、（送料が必要な場合）を1回採取し、液体窒素を用いて、ドライアイスでそれらを出荷し、組織切片まで-80℃で保管してください。 （市販の試料が使用される場合、サンプルはこの方法で調製されることを保証する。） </li><li> MALDIターゲットに合​​わせて管理可能なサイズに臓器を切った。臓器の不要な部分を切り落とす。ここで説明する本研究のために、仔ウシレンズは、組織切片の前に前述の手順35を使用してカプセル化が解除された。 </li><li> -80℃の冷凍庫から、全体の臓器を取り出して、極低温組織切断ステージに固定します。子牛レンズを修正するには、クライオスタットの組織の切断、ステージ上の水の1〜2滴を配置します。それが凝固する前にすぐに水にレンズを配置します。あるいは、最適な切削温度（OCT）化合物はまた、切削ステージに組織を固定するために使用することができる。のOCT化合物が使用される場合、ミニ、OCTの発作量が適用されるべきであると注意を切断組織切片を分析物5,36,37のイオン化及び検出を妨害する可能性のOCT化合物で汚染されないように注意しなければならない。 </li><li>クライオスタット内の温度が-18℃に平衡化させる冷たいまたは暖かい温度はそれぞれ、軟らかい又は硬い組織に使用することができる。その後、厚さ20μmのスライスに赤道組織を切断。ほとんどの組織のために10から15ミクロンの厚さのスライスを使用します。しかし、ウシ水晶体組織の脆弱な性質のために、厚さ20μmのスライスを使用した。ウシ水晶体組織の場合は、最初の組織切片を破棄し、唯一に近いか、赤道面にあるスライスを使用しています。 </li><li>眼の水晶体組織を撮像した場合には、インジウムスズ酸化物（ITO）被覆ガラススライドの表面を濡らすためにギ酸（純度98％、LC-MSグレード）1.5μLを使用する。 </li><li>慎重にITO - コの表面に組織切片を転送するクライオスタット内部のガラスの顕微鏡スライドをated。組織切片を迅速に解凍し、スライド表面にしっかりと貼り付けられなろう。通常、複数の組織切片は、このように同一のITOコーティングされたスライド上に搭載することができる。 </li><li> MALDIマトリックスの適用の前に15分間、スライドを凍結乾燥する。 </li><li>マトリックステストのために、適切な溶媒中での個々の行列を溶かす。手動で組織切片上に、各マトリックス溶液1μLを発見。さらに、MALDI感度を検証するための組織上に小分子校正標準を見つける。 </li><li>修正流体ペンでITO被覆ガラススライドの非導電性の表面に書き込むことで、ITO被覆ガラススライドに3教授マークを追加。フラットベッドスキャナを使用して、組織スライドの光学像を取得し、TIFFやJPGなどの適切な形式で保存。 </li></ol> 2。マトリックスコーティング 2.1。自動化されたマトリックスコーティング<ol><li> AP自動的ブルカーImagePrep又は類似の電子マトリクス噴霧器を用いて組織切片の表面に、溶媒としてアセトニトリルまたは混合アセトニトリル/水を含有するプライマトリックス溶液。 </li><li>マトリックスはコートスライドのエッジをしないようにテープでITO被覆ガラススライドの表面の縁部を覆う。これは、反対側の面に教示マークが組織スライドアラインメントのために使用することができることを保証する。これらはITOでコーティングされたスライドの導電性を維持するために、接触点として使用されるようなマトリクスを有するスライドのエッジをカバーしない。 </li><li>コー​​トマトリックスコーティング（2秒の噴霧、30秒のインキュベーション、および各サイクル60秒の乾燥時間）の20サイクルを用いてガラススライド。 </li></ol> 2.2。手動マトリックスコーティング<ol><li>電子マトリックス噴霧器の製造材料と互換性のない有機溶媒（ 例えば 、クロロホルム、酢酸エチル）はrequiである場合赤、行列を適用するために、空気圧アシストエアブラシ噴霧器を使用しています。エアブラシ銃の溶剤タンクに準備されたマトリックス溶液を追加し、プラ​​イムスプレーに加圧された窒素ガスの穏やかな流れを適用します。 </li><li>マトリックスはコートスライドのエッジをしないようにテープでITO被覆ガラススライドの表面の縁部を覆う。これは、反対側の面に教示マークが組織スライドアラインメントのために使用することができることを保証する。これらはITOでコーティングされたスライドの導電性を維持するために、接触点として使用されるようなマトリクスを有するスライドのエッジをカバーしない。 </li><li>安定であり、微細なスプレーは、組織切片、それを完全に被覆するようにマトリックスを手動スプレー、観察された後。かろうじて可能な分析物の非局在化を防止するために、各サイクル中に表面を濡らすために必要なマトリックス溶液の最小量を適用する。一般に、コーティングするために組織切片をマトリックススプレーの約10サイクルを使用し、サイクル数である組織型とマトリックス組成に依存。 </li></ol> 3。 MALDI MS <ol><li>水（最終混合物中の0.1％ギ酸を含む）：60:40イソプロパノール中1:200倍「ESチューニングミックス」標準液を希釈することにより、質量キャリブレーション溶液を調製する。 </li><li> 2μlの/デュアルモードエレクトロスプレーイオン化（ESI）ESI側からFTICR質量分析計の/ MALDIイオン源内へ希釈し「ESチューニングミックス」溶液の分を導入する。 </li><li>ブロードバンドの検出および1024キロバイト/秒のデータ収集サイズで、正イオンESIモードでFTICR機器を操作してください。典型的なESIパラメータは、キャピラリエレクトロスプレー電圧は、3,900 Vであり;シールド電圧3,600 Vスプレー、ネブライザーガス（N 2）フロー、2 L /分、乾燥ガス（N 2）の流れ、温度、4 L /分、200°C;飛行時間（TOF）、0.009秒;、衝突ガス（Ar）流量、0.4 L /秒;ソースイオン蓄積時間は0.1秒で1電圧、15 Vスキマー;衝突セルのイオン蓄積時間、0.2秒。良好な時間領域自由誘導減衰（FID）信号を維持しながら、のm / z 200〜1,400質量範囲にわたって分析感度を最大にするために同調FTICR動作パラメータ。一般的に、ICR動作パラメータが相棒電圧、8 Vである。相棒オフセット電圧、8 V、10の励起増幅;励起パルス時間、0.01から0.015秒、フロントトラッププレート電圧、1.5 V、背トラッププレート電圧、1.6 Vと分析器の入口電圧-4 FTICR動作パラメータのセットが決定された後V.、ESI質量スペクトルを取得し、「ESチューニングミックス」溶液中の標準化合物の質量基準を使用して機器を較正する。 </li><li>チューニングする楽器MALDI操作のため、各1μMの濃度でマトリックス溶液中で混合テルフェナジンとレセルピン標準溶液を数1μlを溶かしてTISSUの1に直接これらのソリューションを見つけるITOコーティングされたスライド上に搭載された電子部（ すなわち、試験組織切片）。組織スライドアダプタにITO被覆スライドを置きます（ つまり特別なMALDI標的）とデュアルESI / MALDIイオン源へのMALDI側からアダプタをロードします。各質量走査のためのMALDI信号の蓄積などのためのレーザパワーとレーザショット数に適したMALDI動作パラメータを最適化する典型的なMALDI動作パラメータは次のとおりです。レーザーショット、50、および300 VのMALDIプレート電圧</li><li> 、チューニング校正、およびMALDI-MSI実験のために測定器を最適化した後、画像処理ソフトウェア内での記録された光学像を撮像すべき組織切片の物理的な位置に合わせます。三点三角測量法を使用して、この位置合わせのために、以前にITOコーティングされたスライド面とは反対側に配置された三つの &quot;補正流体」マーク（ステップ1.9）を使用する。 </li><li>同時ESIおよびMALを行うDI動作各質量スペクトルは、ポスト取込み内部質量較正のための「ESチューニングミックス」溶液の基準質量ピークを含むようにする。これは、MALDI MSの中の最も正確な質量測定になります。 ESIの較正信号は依然として内部質量較正のために十分に高いながらMALDI信号がスペクトルを支配するまで、これを行うには、最初のキャピラリー電圧を減少させることによってESI信号を減衰させる。 </li><li>次に、レーザ照射のための自動化されたラスタ方式を設定します。撮像される組織領域を定義し、適切なレーザーラスタステップサイズを設定する。小さいラスタステップサイズは、より高い解像度の組織画像を提供することに留意されたいが、かなり長い質量スペクトルの取得時間とより多くのデータ·ストレージ·スペースを必要とする。画像のピクセル数を設定するには、レーザーラスターステップサイズおよび組織のサイズに依存している。 1cm 2の組織サイズを有する代表的なウシのレンズについては、組織像は、典型的には約構成されている。 </エム&gt; 5000画素200μmのレーザラスタステップサイズFTICR機器で使用されている場合。これは実験中の段階的な信号減衰による位置ベースのバイアスを防ぐように、「ランダムスポット」の分析を使用してください。 </li></ol> 4。データ解析<ol><li>最初の比較のために内部キャリブレーションを使用して、MALDI質量スペクトルを校正し、MS / MSのピークを選択する。デ同位体およびカスタマイズされたVBAスクリプト38を使用して、前述したようにモノアイソトピックピークを選択します。 </li><li>エクスポートモノアイソトピックピークリストとMETLIN 39および/ ​​またはライブラリエントリを持つマスマッチングのためHMDB 40メタボロームのデータベースへの入力で測定m / z値を生じた。 ±1ppmでの許容質量誤差で、データベース検索の際に（M + H）+、（M + Na）の+、および（M + K）+イオンを考えてみましょう。 </li><li> IMAGを使用して、全組織切片全体で検出された脂質のエンティティのすべてのためのMALDIの画像を生成するピーク頂点で1 ppmの質量フィルタ幅と電子解析ソフトウェア。 </li><li>画像は、データベースエントリに一致するすべてのm / z値のために生成されたら、後で調査することができるユニークな分布パターンを探すために、並びに、他のすべてのピークについての画像を生成する。 </li></ol> 5。イメージされ脂質の身元の確認<ol><li> MALDI-MS/MSにより、FTICR機器（リン脂質など 184.073）を用いて検出することができる特徴的なフラグメントイオンを有する高存在脂質のアイデンティティを確認してください。直接組織に衝突誘起解離（CID）を使用してMALDI-MS/MSを実行します。 </li><li>直接MALDI-MS/MSにより確認することができないそれらの脂質種に対しては、q-TOF質量分析計34に接続されたUPLCシステムを使用する。 <ol><li>手動で対象となる種がローカライズされた地域からの組織〜10 mgのアリコートを分析。 2に、これらの組織のアリコートを配置mlの遠心管。 </li><li> 2つの5のステンレス鋼金属ボールミキサーミルを用いて、水250μlの各組織アリコートを均質化する。 </li><li>クロロホルム - メタノール溶液（1:3、v / v）を、ボルテックスチューブを1ml加える。次に、10分間、12,000×gで微量遠心を用いてチューブを遠心する。 </li><li>上清を収集し、回転速度真空濃縮器でそれらを乾燥させます。 </li><li>水：30:70イソプロパノール100μlに残基を溶解する。勾配溶出を用いた分離のためのUPLCカラムに10μlのアリコートを注入する。 </li><li>以前に34公開されているオンラインの脂質LC-MS/MS用のクロマトグラフィー条件を使用してください。 </li><li>生成抽出イオン電流（XIC）は理論上の質量中心に±50ppmのウィンドウで、理論的なm / z値を使用して、クロマトグラム。 </li><li>これらの脂質の本物の化合物が利用可能である場合、対応のものと本物の化合物の保持時間と一致する組織サンプルからXICピークをsponding。化合物が同じである場合、保持時間およびMS / MSスペクトルが一致する必要があります。 </li></ol></li><li>本格的な化合物が使用できない場合は、このようなMETLINやHMDBなどメタボロームデータベースから標準のMS / MSスペクトルと一致するように検出された脂質の断片化パターンを使用しています。脂質の可能な構造を決定するために新たに質量スペクトルの解釈を使用してください。 </li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

成功MALDI MSIのための最も重要な考慮事項は次のとおりである：1）組織調製、2）行列の選択、3）は、行列のアプリケーション、4）データの解釈と分析。試料とマトリックスを適切に調製する場合、MSデータの取得が自動化される。この種の実験からのデータ分析は、非常に労働集約的である。 適切な組織標本が成功し、MALDI MSIの実験のために非常に重要です。組織の供?...

質量分析イメージング（MSI）は、組織切片1,2の表面に化合物の空間的局在と分布パターンを決定するための分析技術である。ペプチドおよびタンパク質の分析のためのマトリックス支援レーザー脱離/イオン化（MALDI）MSIは、10年以上にわたって使用されており、試料調製、検出感度、空間分解能、再現性、およびデータ処理のための方法で3,4大きな改善があった。組織学的に染色した切片とMSIの実験からの情報を組み合わせることにより、病理医は、病態生理学的に興味深い機能5で特定の化合物の分布を相互に関連付けることができます。 外因性薬物及びそれらの代謝産物6,7 8-10を含む小分子の分布パターンはまた、MALDI-MSの組織画像11によって問い合わせされている。脂質は、おそらく最も広く研究されているCLA両方のMS 12月17日およ ​​びMS / MS 18のモードで、MALDIイメージングを有する化合物のSS、。小分子イメージングのためのMALDI MSIの使用は、いくつかの要因によって制限されてきた：1）MALDIマトリックスは、それ自体が豊富なイオンシグナルを発生する小分子（典型的には、M / Z &lt;500）である。これらの豊富な信号は、小分子分析物のイオン化を抑制し、その検知19,20を妨害する可能性がある。無溶剤型マトリックスコーティング21、マトリックス昇華22、およびMALDI MS 23プレコートマトリックスは、とりわけ、小分子のMSIを改善するために開発されてきた。 低MW化合物の分析を改善することができる新たなマトリックスは小分子MSIに大きな関心である。これらのマトリックスは減少し、マトリックス信号が増加した検体信号を提供すべきである。陽イオンモードでは、2,5 -ジヒドロキシ安息香酸（DHB）及びα-シアノ-4 -ヒドロキシ桂皮酸（CHCA）がMSI 24のための2つの一般的に使用されるMALDI MS行列である</SUP&gt;。分析物の空間的局在化を保持するように理想的なマトリックスは、小さな結晶を形成するであろう。 DHBしたがって昇華を使用して行列を適用することを部分的にこの問題を克服するために開発されており、リン脂質22,25の高感度画像化のためのこのマトリックスの使用を可能にした、より大きな結晶を形成する傾向がある。 9 -アミノアクリジンは、正イオンモード26におけるプロトン検体のMSIおよび負イオンモードで26-29のヌクレオチドおよびリン脂質のために使用されている。 2 -メルカプトベンゾチアゾール、脂質30の効率的なMALDI検出を与えることが見出されており、マウスの脳のガングリオシド31のイメージングのために使用されている。フーリエ変換の超高分解能は、イオンサイクロトロン共鳴（FTICR）質量分析計が多少行列信号32から検体信号を解決することによって、この問題を緩和することができる変換する。 FTICR-MSを使用することの別の利点は、準安定マトリックスクラスターの強度を削減していることであるまた、これらの干渉を27に減らし、ED 33、。 ジスラノール（DT、1,8 -ジヒドロキシ-9,10 -ジヒドロアントラセン-9 -オン）の使用は、組織のイメージングのためのMALDIマトリックスは、以前に報告34されているように。この現在の研究では、詳細なプロトコールは、正イオンモードでは、ウシのレンズ組織切片の表面上の内因性脂質​​のMSIのためのDTの使用のために提供される。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Liver</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>56023-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Calf Lens</td>
			<td>Pel-Freez Biologicals</td>
			<td>57114-2</td>
			<td>Sample should be decapsulated29 before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithranol (DT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10608</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-Cyano-4-hydroxy-cinnamic Acid (CHCA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>70990</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-Dihydroxybenzoic Acid (DHB)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85707</td>
			<td>MALDI Matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reserpine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>83580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Terfenadine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Formate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>14266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>320145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic Acid (TFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>39253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34967</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethyl Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34972</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>366927</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td></td>
			<td>95%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES Tuning Mix</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2431A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITO Coated Glass Slides</td>
			<td>Hudson Surface Technology</td>
			<td>PSI1207000</td>
			<td>Ensure that samples are placed on the electrically conductive side</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wite-Out Shake-N-Squeeze Correction Pen</td>
			<td>Bic</td>
			<td>WOSQP11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Airbrush Sprayer</td>
			<td>Iwata</td>
			<td>Eclipse HP-CS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImagePrep</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>249500-LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI adapter</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>235380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dithranol as a matrix for matrix assisted laser desorption/ionization imaging on a fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometer

質量分析イメージング（MSI）は、主にMALDI（マトリックス支援レーザー脱離/イオン化）ベースの分析技術を用いて、組織切片の表面上の化合物の空間的局在および分布パターンを決定する。低分子量（MW）の化合物の分析を向上させることができる小分子MSI用の新しい行列は、必要とされる。 MALDIバックグラウンドシグナルを減少させながら、これらのマトリックスが増大検体信号を提供すべきである。また、このようなフーリエとして超高解像度の器具の使用は、イオンサイクロトロン共鳴（FTICR）質量分析計を変換行列信号から検体信号を分解する能力を有し、これは、部分的に背景がMALDI由来に関連する多くの問題を克服することができる行列。 FTICR MSによる準安定マトリックスクラスターの強度の低下はまた、他の機器上にマトリックスピークに関連付けられた干渉のいくつかを克服するのを助けることができる。高解像度の依然として化学同定の信頼性を提供しながら、それらは、同時に多くの化合物の分布パターンを生成することができるようなFTICR質量分析計などの器具は有利である。ジスラノール（DTは、1,8 - ジヒドロキシ-9,10 - ジヒドロアントラセン-9 - オン）は、以前に組織イメージングのためのMALDIマトリックスとして報告されている。本研究では、哺乳類の組織切片の表面からの内因性脂質​​のMALDIイメージングのためにDTを使用するためのプロトコルは、正イオンMALDI-MSにより、超高解像度のハイブリッド四重極にFTICR機器が提供されている。

<html> ITO被覆ガラススライド上に切片化し、解凍が搭載された組織サンプルは、目に見える引き裂きせず、無傷であるべきである。多くの組織は、ITO被覆ガラススライド上に直接マウント組織融解は許容される。直接融解の装着が（図1a）が使用されるとき、ウシレンズなどのいくつかの特定の組織、組織の広範な引き裂きがしばしば見られる。エタノールまたはギ酸でITOガラス?...

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Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

ジスラノール（DT、1,8 - ジヒドロキシ-9,10 - ジヒドロアントラセン-9 - オン）は、以前に小分子の組織イメージングのためのMALDIマトリックスとして報告されている上に、内因性脂質​​のMALDIイメージングのためのDTの使用のためのプロトコル超高分解能四重極-FTICR機器上の正イオンMALDI-MSによる組織切片の表面は、ここで提供される。

変換にマトリックス支援レーザー脱離/イオンイメージングのためのマトリックスとしてジスラノールはイオンサイクロトロン共鳴質量分析計をフーリエ

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

dithranol-as-matrix-for-matrix-assisted-laser-desorptionionization

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K ビュー.  University of Victoria. ジスラノール（DT、1,8 - ジヒドロキシ-9,10 - ジヒドロアントラセン-9 - オン）は、以前に小分子の組織イメージングのためのMALDIマトリックスとして報告されている上に、内因性脂質​​のMALDIイメージングのためのDTの使用のためのプロトコル超高分解能四重極-FTICR機器上の正イオンMALDI-MSによる組織切片の表面は、ここで提供される。 

ビデオ: Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS) 1,2. The ultra-thin layer method involves the production of a substrate layer of matrix crystals (alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid) on the sample plate, which serves as a seeding ground for subsequent crystallization of a matrix/analyte mixture. Advantages of the ultra-thin layer method over other sample deposition approaches (e.g. dried droplet) are that it provides (i) greater tolerance to impurities such as salts and detergents, (ii) better resolution, and (iii) higher spatial uniformity. This method is especially useful for the accurate mass determination of proteins. The protocol was initially developed and optimized for the analysis of membrane proteins and used to successfully analyze ion channels, metabolite transporters, and receptors, containing between 2 and 12 transmembrane domains 2. Since the original publication, it has also shown to be equally useful for the analysis of soluble proteins. Indeed, we have used it for a large number of proteins having a wide range of properties, including those with molecular masses as high as 380 kDa 3. It is currently our method of choice for the molecular mass analysis of all proteins. The described procedure consistently produces high-quality spectra, and it is sensitive, robust, and easy to implement.

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry (MALDI-MS).

MALDIサンプル調製：超薄層法

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

生物学

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture. This work involves mixing two viscous liquid streams using an in-line static mixer. The mixer is a split-and-recombine design that employs shear and extensional flow to increase the interfacial contact between the components. A prototype split-and-recombine (SAR) mixer was constructed by aligning a series of thin laser-cut Poly (methyl methacrylate) (PMMA) plates held in place in a PVC pipe. Mixing in this device is illustrated in the photograph in Fig. 1. Red dye was added to a portion of the test fluid and used as the minor component being mixed into the major (undyed) component. At the inlet of the mixer, the injected layer of tracer fluid is split into two layers as it flows through the mixing section. On each subsequent mixing section, the number of horizontal layers is duplicated. Ultimately, the single stream of dye is uniformly dispersed throughout the cross section of the device.
 Using a non-Newtonian test fluid of 0.2% Carbopol and a doped tracer fluid of similar composition, mixing in the unit is visualized using magnetic resonance imaging (MRI). MRI is a very powerful experimental probe of molecular chemical and physical environment as well as sample structure on the length scales from microns to centimeters. This sensitivity has resulted in broad application of these techniques to characterize physical, chemical and/or biological properties of materials ranging from humans to foods to porous media 1, 2. The equipment and conditions used here are suitable for imaging liquids containing substantial amounts of NMR mobile 1H such as ordinary water and organic liquids including oils. Traditionally MRI has utilized super conducting magnets which are not suitable for industrial environments and not portable within a laboratory (Fig. 2). Recent advances in magnet technology have permitted the construction of large volume industrially compatible magnets suitable for imaging process flows. Here, MRI provides spatially resolved component concentrations at different axial locations during the mixing process. This work documents real-time mixing of highly viscous fluids via distributive mixing with an application to personal care products.

Magnetic resonance imaging (MRI) provides a powerful tool to evaluate the effectiveness of process equipment during operation. We discuss the use of MRI to visualize mixing in a static mixer. The application is relevant to personal care products, but can be applied to a broad range of food, chemical, biomass and biological fluids.

磁気共鳴イメージングを使用してミキシング定量化

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

Quantitative Measurement of Invadopodia-mediated Extracellular Matrix Proteolysis in Single and Multicellular Contexts

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis. Malregulated invasion and subsequent cell movement is characteristic of multiple pathological processes, including inflammation, cardiovascular disease and tumor cell metastasis1. Focalized proteolytic degradation of extracellular matrix (ECM) components in the epithelial or endothelial basement membrane is a critical step in initiating cellular invasion. In tumor cells, extensive in vitro analysis has determined that ECM degradation is accomplished by ventral actin-rich membrane protrusive structures termed invadopodia2,3. Invadopodia form in close apposition to the ECM, where they moderate ECM breakdown through the action of matrix metalloproteinases (MMPs). The ability of tumor cells to form invadopodia directly correlates with the ability to invade into local stroma and associated vascular components3. 
Visualization of invadopodia-mediated ECM degradation of cells by fluorescent microscopy using dye-labeled matrix proteins coated onto glass coverslips has emerged as the most prevalent technique for evaluating the degree of matrix proteolysis and cellular invasive potential4,5. Here we describe a version of the standard method for generating fluorescently-labeled glass coverslips utilizing a commercially available Oregon Green-488 gelatin conjugate. This method is easily scaled to rapidly produce large numbers of coated coverslips. We show some of the common microscopic artifacts that are often encountered during this procedure and how these can be avoided. Finally, we describe standardized methods using readily available computer software to allow quantification of labeled gelatin matrix degradation mediated by individual cells and by entire cellular populations. The described procedures provide the ability to accurately and reproducibly monitor invadopodia activity, and can also serve as a platform for evaluating the efficacy of modulating protein expression or testing of anti-invasive compounds on extracellular matrix degradation in single and multicellular settings.

We describe the prototypical method for producing microscope coverslips coated with fluorescent gelatin for visualizing invadopodia-mediated matrix degradation. Computational techniques using available software are presented for quantifying the resultant levels of matrix proteolysis by single cells within a mixed population and for multicellular groups encompassing entire microscopic fields.

シングルおよび多細胞コンテキストでInvadopodia媒介細胞外マトリックスタンパク分解の定量測定

Cellular invasion into local tissues is a process important in development and homeostasis.  Malregulated invasion and subsequent cell movement is ...

Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Random microseed matrix screening (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added to random screens. By increasing the likelihood that crystals will grow in the metastable zone of a protein's phase diagram, extra crystallization leads are often obtained, the quality of crystals produced may be increased, and a good supply of crystals for data collection and soaking experiments is provided. Here we describe a general method for rMMS that may be applied to either sitting drop or hanging drop vapor diffusion experiments, established either by hand or using liquid handling robotics, in 96-well or 24-well tray format.

Here we describe a general method for random microseed matrix screening. This technique is shown to significantly increase the success rate of protein crystallization screening experiments, reduce the need for optimization, and provide a reliable supply of crystals for data collection and ligand-soaking experiments.

ランダムMicroseedマトリックススクリーニングによってタンパク質結晶化の成功率を向上させる

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of cell proliferation, survival, migration, etc. The ECM plays important roles in development and in diverse pathologies including cardio-vascular and musculo-skeletal diseases, fibrosis, and cancer. Thus, characterizing the composition of ECMs of normal and diseased tissues could lead to the identification of novel prognostic and diagnostic biomarkers and potential novel therapeutic targets. However, the very nature of ECM proteins (large in size, cross-linked and covalently bound, heavily glycosylated) has rendered biochemical analyses of ECMs challenging. To overcome this challenge, we developed a method to enrich ECMs from fresh or frozen tissues and tumors that takes advantage of the insolubility of ECM proteins. We describe here in detail the decellularization procedure that consists of sequential incubations in buffers of different pH and salt and detergent concentrations and that results in 1) the extraction of intracellular (cytosolic, nuclear, membrane and cytoskeletal) proteins and 2) the enrichment of ECM proteins. We then describe how to deglycosylate and digest ECM-enriched protein preparations into peptides for subsequent analysis by mass spectrometry.

This protocol describes a procedure for enriching ECM proteins from tissues or tumors and deglycosylating and digesting the ECM-enriched preparations into peptides to analyze their protein composition by mass spectrometry.

質量分析のためのペプチドに組織および消化から細胞外マトリックスタンパク質の濃縮

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Laser-assisted Microdissection (LAM) as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Laser-assisted Microdissection LAM as a Tool for Transcriptional Profiling of Individual Cell Types

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

個々の細胞タイプの転写プロファイリングのためのツールと​​してのレーザ支援顕微解剖（LAM）

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the ...

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering (CARS) System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become available for biologists. These systems are primarily designed for multi-channel two-photon fluorescence microscopy. However, without any modification, complementary non-linear optical microscopy such as second-harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can also be performed with this set-up, allowing label-free imaging of structured molecules or aqueous medium-lipid interfaces. These techniques are well suited for in-vivo observation, but are limited in chemical specificity. Chemically selective imaging can be obtained from inherent vibration signals based on Raman scattering. Confocal Raman microscopy provides 3D spatial resolution, but it requires high average power and long acquisition time. To overcome these difficulties, recent advances in laser technology have permitted the development of nonlinear optical vibrational microscopy, in particular coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS). CARS microscopy has therefore emerged as a powerful tool for biological and live cell imaging, by chemically mapping lipids (via C-H stretch vibration), water (via O-H stretch vibrations), proteins or DNA. In this work, we describe the implementation of the CARS technique on a standard OPO-coupled multiphoton laser scanning microscope. It is based on the in-time synchronization of the two laser lines by adjusting the length of one of the laser beam path. We present a step-by-step implementation of this technique on an existing multiphoton system. A basic background in experimental optics is helpful and the presented system does not require expensive supplementary equipment. We also illustrate CARS imaging obtained on myelin sheaths of sciatic nerve of rodent, and we show that this imaging can be performed simultaneously with other nonlinear optical imaging, such as standard two-photon fluorescence technique and second-harmonic generation.

Implementation of a Coherent Anti-Stokes Raman Scattering CARS System on a Ti:Sapphire and OPO Laser Based Standard Laser Scanning Microscope

Coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscopy based on inherent vibration of molecule bonds permits label-free chemically selective live cell imaging. This work presents the implementation of a complementary microscopy technique on a standard multiphoton laser scanning microscope based on a femtosecond Ti:sapphire laser and an OPO laser.

サファイアとOPOレーザー基づく標準レーザー走査顕微鏡：Tiの上のコヒーレントアンチストークスラマン散乱（CARS）システムの実装

Laser scanning microscopes combining a femtosecond Ti:sapphire laser and an optical parametric oscillator (OPO) to duplicate the laser line have become ...

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological samples, designed for high-resolution magnetic resonance imaging (MRI), also referred to as MR microscopy (MRM). It may be used at pre-clinical MRI spectrometers, demonstrated on Medicago truncatula root samples. Microcoils increase sensitivity by matching the size of the RF resonator to the size of the sample of interest, thereby enabling higher image resolutions in a given data acquisition time. Due to the relatively simple design, solenoidal microcoils are straightforward and cheap to construct and can be easily adapted to the sample requirements. Systematically, we explain how to calibrate new or home-built microcoils, using a reference solution. The calibration steps include: pulse power determination using a nutation curve; estimation of RF-field homogeneity; and calculating a volume-normalized signal-to-noise ratio (SNR) using standard pulse sequences. Important steps in sample preparation for small biological samples are discussed, as well as possible mitigating factors such as magnetic susceptibility differences. The applications of an optimized solenoid coil are demonstrated by high-resolution (13 x 13 x 13 &#956;m3, 2.2 pL) 3D imaging of a root sample.

MRM Microcoil Performance Calibration and Usage Demonstrated on Medicago truncatula Roots at 22 T

A protocol to study biological tissue at high spatial resolution using ultra-high field magnetic resonance microscopy (MRM) using microcoils is presented. Step-by-step instructions are provided for characterizing the microcoils. Finally, optimization of imaging is demonstrated on plant roots.

22 Tで 医薬トランカチュラ ルーツで実証MRMマイクロコイル性能キャリブレーションと使用

This protocol describes a signal-to-noise ratio (SNR) calibration and sample preparation method for solenoidal microcoils combined with biological ...

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. These sensitivity gains increase as temperatures decrease and are large enough to enable the study of molecules at very low concentrations at the operating temperatures (~100 K) of most commercial DNP-equipped NMR spectrometers. This leads to the possibility of in-cell structural biology on cryopreserved cells for macromolecules at their endogenous levels in their native environments. However, the freezing rates required for cellular cryopreservation are exceeded during typical sample handling for DNP MAS NMR and this results in loss of cellular integrity and viability. This article describes a detailed protocol for the preparation and cryogenic transfer of a frozen sample of mammalian cells into a MAS NMR spectrometer.

Presented here is a protocol for cryogenic transfer of frozen samples into the dynamic nuclear polarization (DNP) magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) probe. The protocol includes directions for rotor storage prior to the experiment and directions for viability measurements before and after the experiment.

細胞生存率を維持するマジックアングル回転核磁気共鳴分光計への低温サンプルローディング

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

Lipid profiling, or lipidomics, is a well-established technique used to study the entire lipid content of a cell or tissue. Information acquired from&#160;lipidomics is valuable in studying the pathways involved in development, disease, and cellular metabolism. Many tools and instrumentations have aided lipidomics projects, most notably various combinations of mass spectrometry and liquid chromatography techniques. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has recently emerged as a powerful imaging technique that complements conventional approaches. This novel technique provides unique information on the spatial distribution of lipids within tissue compartments, which was previously unattainable without the use of excessive modifications. The sample preparation of the MALDI MSI approach is critical and, therefore, is the focus of this paper. This paper presents a rapid lipid analysis of a large number of Drosophila brains embedded in optimal cutting temperature compound (OCT) to provide a detailed protocol for the preparation of small tissues for lipid analysis or metabolite and small molecule analysis through MALDI MSI.

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

The aim of this protocol is to provide detailed guidance on the proper sample preparation for lipid and metabolite analysis in small tissues, such as the Drosophila brain, using matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) mass spectrometry imaging.