この作品は、BBSRC（BB/1006478/1）によって部分的に資金を供給された。 PRRは王立協会大学研究フェローシップ受賞。

1。戦略的な考慮事項<ol><li> microseeding実験のために使用するシード結晶の選択は、実験の目的に依存して変化する。プロジェクトの開始時に、結晶の最適化のための代替出発点を提供することができるいくつかの結晶化ヒットを見つけることは有用である。良好な品質の結晶が乱れ、すなわち以下または平衡システムに戻る核生成領域において、相図の準安定域で成長する可能性が高いため、リスク管理措置が大きく、結晶の最適化の必要性を低減する。そこで我々は、日常とすぐに最初の結晶が（とすぐに最初の結晶が成長を止めたように、より正確に、または）が得られるようにリスク管理措置を使用してお勧めします。 </li><li>リスク管理措置の最初のラウンドのため、シードストックは、可能な限り多くの結晶性の材料で作られるべきである。一つだけでなく、結晶が含まれて提供されていたり、結晶が小さい場合、それは、複数の繰り返しを設定するために役立つ可能性がある場合結晶の供給を増加させる（シーディングなし）オリジナ​​ルヒット。しかし、いくつかの異なるヒットが得られた場合、種結晶は、いくつかの条件から収集し、一緒に混合することができる。 </li><li>相分離を回避するために、高塩条件で成長した結晶は、高PEG条件において成長した結晶とは別個に収穫されるべきである。いくつかのウェルから結晶が混在している場合、塩の結晶を得にくくなるリザーバー溶液は、種子懸濁液のために選択されるべきである。例えば、リン酸塩、硫酸塩、カルシウムおよびマグネシウムの高濃度は避けるべきである。 </li><li>後でプロジェクト内には、回折を改善双晶を回避し、リガンドと結合するのに適した結晶を得るために、異なるユニットセルを有する結晶を探すために重要であり得る。この段階で（ 例えば最善を回折するもの）は、最も適した結晶は、種ストックを作るために使用されるべきである。 microseedingの時々繰り返さラウンドはここだけ &quot;最高の、必要とされる「結晶は、その後のラウンドのためのシードストックを作製するために使用される。可能な場合は、「例えばPEG 3000などの中性「沈殿剤は、新規な結晶接触を促進するために、高で不安定であり得る複合体を結晶化シード結晶を懸濁するために使用されるべき-塩溶液12。 </li><li>単結晶化条件が使用されている古典的なmicroseeding実験は、多くの場合、有望な状態のとその後の最適化中の識別以下の役に立ちます。これは、液滴当たりの結晶の所望の数を得るために、種ストックを希釈することがしばしば必要である。 （増加希釈のシードストックを一連の結晶化条件に追加される）「コンビナトリアル」microseeding実験は、シードストックの最適希釈を見つけるための迅速な方法である。このアプローチは、以下に説明する。 </li></ol> 2。シードストックの調製<ol><li>ブンゼン炎を用いたガラスパスツールピペットから丸みを帯びたガラスプローブを作る。 <ol><li>それが柔らかくなるまで中央付近ピペットを加熱し、その後すぐに炎からそれを削除して、端を離れて引っ張って、それを引き出す。ダウン0.25ミリメートル以下の直径にガラスを引っ張ることを目指しています。 </li><li>それは周りの0.25ミリメートルである点でガラスを割って簡単に炎に分割端を急落。 〜0.75ミリメートルの直径が端部に形成されたガラスの半球までこれを繰り返します。このプローブは、それが適切に0.01〜1.0ミリメートルスケールで固体物体に衝突するための大きさで、それを結晶化トレーサブウェルまたはカバースリップのプラスチック表面を損傷しないような結晶材料を粉砕するために有用である。結晶がガラスとプラスチックの間に閉じ込められているので、より大きなプローブ（〜1.0ミリメートル）がより効果的に小さな結晶を押しつぶすことがあります。 </li></ol></li><li>氷上のシードビーズを含む1.5 mlのマイクロチューブを配置します。 </li><li>双眼顕微鏡又は結晶イメージングシステムを用いて事前に確立された結晶化トレイを検査し、一つ以上のAPを選択する種ストックを生成するための結晶材料を収穫する、そこからトレイから井戸をpropriate。どのような材料は、微細な針、球晶、微結晶と不規則な、不完全に形成された結晶を含むことができます。結晶が成長を止めた後に古い資料は、このように播種実験における使用のためのその適合性を低下させる、部分的に架橋されやすくなるようにシードストックは、できるだけ早くなされるべきである。疑義を回収する結晶性物質が塩またはタンパク質であるかどうかについて存在しない場合だけでなく、従来の開口にUV蛍光顕微鏡または撮像システムを用いて視覚化することができる、または結晶材料は、 その場 X線回折分析に供され得るトレイに。 UV照射下で蛍光を発する前者のタンパク質結晶を使用する場合、塩結晶は、無色に見えるであろう。 </li><li>うまく選択された結晶化トレイを開きます。 96ウェルを中心に、上側プラスチック封止シートを切断ドロップトレイを座ってするためのUSIでなく、選択しメスの刃ngの。 24ウェルハンギングドロップトレイ用ピンセットを使用してカバースリップを削除します。カバースリップを反転させ、安定したクリーンな面に置きます。リザーバー溶液50μlを取り外し、チューブを通して氷の上に残っていることを確実にシードビーズを含むマイクロ遠心チューブにこの液体を移す。 </li><li>徹底的に、顕微鏡下での結果を見て、セクション2.1で作製したガラスプローブを使用して、subwell（96ウェルトレイ）やカバーガラス（24穴トレイ）滴結晶をつぶす。小さな結晶を徹底的に鎮圧するのに数分かかることがあります。このステップは、彼らは塩の結晶ではないことも実験者は結晶がつぶすのは簡単であるため、架橋されていないことをチェックすることを可能にし、。塩の結晶は、聞いたこと、それらが破砕されたとき感じることができる独特のクリックを生成します。結晶は、新鮮な材料を入手し、使用しようと潰すのは難しいが困難である場合。 </li><li>シードビーズ管からリザーバー溶液5μlを取り外し、T同等のサブウェルに順伝達（ドロップ実験を行っ座って）、またはカバースリップ（落下実験をぶら下げ）収穫される結晶性物質を含む。可能な限り、サブウェルまたはカバースリップの内容をできるだけ多く再懸濁するためにこの液体を上下に5〜6回ピペット。シードビーズチューブにサスペンションを返し、さらに2回、この手順を繰り返して、できるだけ多くの結晶性物質は可能な限り収穫されることを保証する。 </li><li>氷上でチューブを冷却するために、30秒毎に停止する、2分間のシードビーズをボルテックスする。 </li><li>各段階で4から10倍にリザーバー溶液中の種ストックを希釈、希釈系列を作る。典型的には、あまりにも多くの結晶が希釈されていないシードストックを用いたときに得られたので、ウェルあたりの結晶の数を制御するために希釈された種子ストックを使用することができる。種子の濃度よりも大きい結晶化ヒットが得られるため、リスク管理措置の最初のラウンドでは、シードストック溶液を希釈しないことが重要である。 </li><li>それは直ちに使用しない場合ately、ストレージのためのCの冷凍庫-20℃にシードストック懸濁液と希釈種ストックを転送、または-80。少量ずつ、 すなわち 10〜20μlの中で、この物質を保管、シードストックの有効性を低下させるかもしれない、凍結融解の繰り返しを防止します。凍結したら、必要になるまで、種子ストックは、無期限に保持することができる。 </li></ol> 3。結晶化トレイの設置<ol><li>結晶化設備、実験者の好みの可用性に応じて、リスク管理措置結晶化スクリーニングは、シッティングドロップ蒸気拡散法を用いたハンギングドロップ蒸気拡散法、または96ウェルトレイを用いた24ウェルトレーのいずれかを用いて行うことができる。リスク管理措置のための結晶化トレーは、ロボットディスペンサー液体処理、またはその2つの組み合わせを使用して、どちらの手によって確立することができる。 </li><li>手で設定され、典型的なリスク管理措置の実験は、タンパク質溶液、1.0μlの結晶化条件μL1.0を含むであろうし、0.5μLシードストック。結晶化ロボットを使用して設定典型的な実験では、0.3μlのタンパク質溶液、0.2μlの結晶化条件、および0.1μlの種ストックを含む。 </li><li> 24ウェルドロップトレイをぶら下げにリスク管理措置のスクリーニングを行うためには、まず、手動ピペットを用いて、4×24ウェルpregreased結晶の各ウェルに10ミリリットル単一チューブ形式で96ウェル条件晶画面から各条件を300μlを転送トレー。 <ol><li>前面と背面保護用バッキング·ストリップの両方が除去された、対応するプラスチックカバースリップの表面にそれぞれ300μLリザーバから各結晶化条件の転送1μL。 </li><li>各結晶化条件の1μlに結晶シードストックの0.5μLに続くタンパク質溶液1μlを加える。液体の滴が適切でなく、上記を下向きにし、位置になるように、各カバースリップを反転します。 </li><li>カバーガラス上で下方向に押して、sealiを圧縮グリースngの、安全なシールを形成する。一旦全て96滴が確立されて、トレイは通常、ストレージの範囲は4から18℃の中で、保育器や恒温室に転送する必要があります。 </li></ol></li><li> 96ウェルシッティングドロップトレイにリスク管理措置のスクリーニングを行うためには、まず、結晶化トレーの対応するウェルそれぞれに深いウェルブロックフォーマットの96ウェル条件晶画面から各条件の20から50μLを転送します。この転写工程は、8チャンネルピペットを用いて結晶化ロボット、または手動のいずれかにより転写を用いて行うことができる。 <ol><li>手または3.1に詳述されたボリュームを使用してロボットと滴の貯水池、タンパク質と種の原液を転送します。いくつかの市販結晶化ロボットがディスペンス接触しない、そのようなシステムを用いてシードストック転送を行うことにより分注チップの閉塞または関連する管類をもたらし得る。ディスペンシングの順序は可変である：いくつかのロボットが同時にすべてのソリューションを分注する。もしこれは不可能ですし、株式をシードし、貯水池、第一のタンパク質を分注する。 </li><li>ロボットを分配接触が鈍い針を装着し、低容量ガラス製注射器を用いて、種子利用でき、転送されていない場合。各ドロップに種ストックを分配リザーバー溶液を通過させることにより、針を洗浄します。 </li><li>透明封止シートを使用して、トレイを密封し、インキュベーターや保管のための恒温室に移す。 </li></ol></li></ol> 4。結晶化トレーの検査<ol><li>双眼顕微鏡や結晶イメージング·システムのいずれかを使用して、すべての結晶化実験を視覚化する。前者は一般的に、ビューの深さ以上のユーザーより詳細に制御し、後者よりも拡大率が得られるが、より多くの時間がかかります。 </li><li>シーケンス内の各sub-well/coverslipを検査し、結晶形成の証拠を記録します。実験は、設立後5日間に一度、24時間点検されるべきであるNその後に一度7日までの4週間。 </li><li>最適回折品質の結晶が生成される前に、リスク管理措置の複数のサイクルが頻繁に必要とされる。 </li></ol>

<ol>
	<li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+Crystallization.">Protein Crystallization.</a> IUL Biotechnology Series. , (2009).</li><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography: Priciples, Practice and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Babnigg, G., Joachimiak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+protein+crystallization+propensity+from+protein+sequence.">Predicting protein crystallization propensity from protein sequence.</a> J. Struct. Funct. Genomics. 11 (1), 71-80 (2010).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeds+to+crystals.">Seeds to crystals.</a> J. Struct. Biol. 142 (1), 66-76 (2003).</li><li>Ireton, G. C., Stoddard, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microseed+matrix+screening+to+improve+crystals+of+yeast+cytosine+deaminase.">Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60, 601-605 (2004).</li><li>Zhu, D. Y., Zhu, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+protein+crystal+growth+through+dynamic+seeding.">Optimizing protein crystal growth through dynamic seeding.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61 (Pt 6), 772-775 (2005).</li><li>Bergfors, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+optimization+methods+for+nonautomated+crystallization+laboratories.">Screening and optimization methods for nonautomated crystallization laboratories.</a> Methods Mol. Biol. 363, 131-151 (2007).</li><li>Xu, L., Butcher, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+and+preliminary+X-ray+analysis+of+receptor-binding+protein+P2+of+bacteriophage+PRD1.">Crystallization and preliminary X-ray analysis of receptor-binding protein P2 of bacteriophage PRD1.</a> J. Struct. Biol. 131 (2), 159-1563 (2000).</li><li>Rangarajan, E. S., Izard, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+diffraction+of+full-length+human+selenomethionyl+metavinculin+crystals+by+streak-seeding.">Improving the diffraction of full-length human selenomethionyl metavinculin crystals by streak-seeding.</a> Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. 66 (Pt 12), 1617-1620 (2010).</li><li>Kadirvelraj, R., Harris, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+optimization+of+crystals+of+rhamnogalacturonan+lyase+from+Aspergillus+aculeatus.">A stepwise optimization of crystals of rhamnogalacturonan lyase from Aspergillus aculeatus.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol . Crystallogr. 58 (Pt 8), 1346-1349 (2002).</li><li>D'Arcy, A., Villard, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+microseed+matrix-screening+method+for+protein+crystallization.">An automated microseed matrix-screening method for protein crystallization.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 63 (Pt 4), 550-554 (2007).</li><li>Shaw Stewart, P. D., Kolek, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+Microseeding:+A+Theoretical+and+Practical+Exploration+of+Seed+Stability+and+Seeding+Techniques+for+Successful+Protein+Crystallization.">Random Microseeding: A Theoretical and Practical Exploration of Seed Stability and Seeding Techniques for Successful Protein Crystallization.</a> Crystal Growth &amp; Design. 11 (8), 3432-3441 (2011).</li><li>Obmolova, G., Malia, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+crystallization+of+antibody-antigen+complexes+via+microseed+matrix+screening.">Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening.</a> Acta. Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66, 927-933 (2010).</li><li>Villasenor, A. G., Wong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acoustic+matrix+microseeding:+improving+protein+crystal+growth+with+minimal+chemical+bias.">Acoustic matrix microseeding: improving protein crystal growth with minimal chemical bias.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (Pt 5), 568-5676 (2010).</li><li>Strynadka, N. C., James, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme:+a+model+enzyme+in+protein+crystallography.">Lysozyme: a model enzyme in protein crystallography.</a> EXS. 75, 185-222 (1996).</li><li>Diaz, A., Loewen, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thirty+years+of+heme+catalases+structural+biology.">Thirty years of heme catalases structural biology.</a> Arch. Biochem. 525 (2), 102-110 (2012).</li></ol>

我々は、開示することは何もありません。

本論文では、リスク管理措置のタンパク質結晶化スクリーニングのための一般的な方法を記載している。我々は、このメソッドを使用して、2つの試験タンパク質の結晶化の成功率の著しい増強を用いて実証した。リスク管理措置及び非リスク管理措置法を用いて作製した結晶のサブセットの放射光を用いた回折分析は、以前の著者らは良質の結晶がRMMS実験11で増殖する可能?...

ヘモグロビンやミオグロビンの構造を決定する上でペールツ、ケンドルーとその共同研究者によって、その最初の適用から、構造ゲノムコンソーシアムのパイプラインを自動化された現代的なハイスループットに、巨大分子のX線結晶学は私たちに、タンパク質の世界に前例のない構造的な姿を与えている。この技術では、原子、または原子レベルの分解能（ すなわち、1〜3Åの範囲）付近のタンパク質構造の直接的な可視化を可能にする最も広く適用できる実験方法のままである。タンパク質に適用されるX線回折の前提条件は、それが最初に結晶化されなければならないことであり、それは回折法1、2による構造決定における唯一最大の律速段階のままプロセスのこの段階である。タンパク質結晶化の過程の理解が大幅に進歩し、結晶化スクリーンの品質と可用性の大幅な改善にもかかわらず、トレイ、および関連技術は、確実に、結晶化の成功3の可能性を予測することは不可能のままである。生化学的および生物物理学的方法は、対象ディスプレイのタンパク質が結晶核生成と成長のための良好な特性、 すなわち、それがうまく折り、均質な単分散などであるかどうかを評価するために適用することができる、しかし、決して、これらの知見は、結晶化の決定的な予測を提供傾向。 播種は、既存の長い結晶または結晶性物質4-7の数、サイズ、及び品質を向上させるための実行可能な方法であることが主張されている。このアプローチは、結晶核形成を支持する状態が続く結晶成長およびその逆のために最適ではないかもしれないことを前提としている。別の状態から核物質を転送することによって、人はまだ未踏の結晶空間として、このように新たにアクセスを与え、効果的にこれらのプロセスを分離しようとする場合があり、その結果、スクリーニング実験の全体​​的な成功率を増加させる。確立された方法は、（i）マクロシーディング、別の8 1つの状態から、その全体が単結晶の転写、一般に、例えばした指向性圧力を加えることによって得られた（ii）のストリークシーディング、核物質の移動のために文書化されている猫の新しい結晶化ドロップ9を介してウィスカの後続の通過に続いて、既存の結晶の表面にウィスカ、および（iii）「古典的な」microseedingは、収穫することによって生成された結晶を「シード」の移動は、結晶（または結晶を砕いシード10をもたらしたものと同様の条件への材料）、。注目すべきことに、これらの方法の3つのすべては、確かに近代的な液体処理結晶化ロボットを用いて達成可能であるものと比較して、時間がかかり、不十分スケーラブルです。これらの要因は、その種子知覚に、少なくともいくつかのレベルで、貢献してきましたINGは他のアプローチが実を結ぶことができなかった場合にのみ訪問する方法である。 ランダム行列microseeding（リスク管理措置）は、ハイスループットスクリーニングとスケーラビリティ11月13日のものと伝統的なmicroseedingの利点を組み合わせた最新の方法論的革新です。このアプローチは、標準的な96の条件結晶化画面内の各sub-well/coverslip /上に分注しことが有核結晶質材料から製造シードストックの生成に依存している。この方法は、手動で、または24ウェルまたは96ウェルトレイ形式の液体取り扱いロボットを用いて、いずれかの確立されたドロップ蒸気拡散実験を、座ったりハングの両方に適用可能である。リスク管理措置が大幅に結晶化の成功率を高め、より大きな回折品質および量11、13、14の結晶を生成するために実験的に証明、およびoにおけるアプローチの結晶学者&#39;武器の中で革新的なツールを表すされている結晶化の成功に向けて努力をngoing。ここでは、リスク管理措置のための一般的な方法を説明し、この技術の有効性を示すサンプルデータを提供する。

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC 96 well crystallization trays</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD11-00-100</td>
			<td>Non-UV compatible, for screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ClearView sealing sheets</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD6-01S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hen egg white lyzozyme</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L6876</td>
			<td>~95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine liver catylase</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C9322</td>
			<td>&gt;95% purity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylanase</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR7-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thaumatin from Thaumatococcus daniellii</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermolysin from Bacillus thermoproteolyticus rokko</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-40</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-36</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus HT-96 screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-47</td>
			<td>For screens established by robot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal Phoenix liquid handling system</td>
			<td>Art Robbins Instruments</td>
			<td>602-0001-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seed bead kit</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR2-320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular stereo microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>M165C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blades</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2646-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 0.1-2.5 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 2-20 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ErgoOne 100-1000 &mu;l pipette</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S7100-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JCSG-plus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-37</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PACT premier screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-29</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Morpheus screen</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD1-46</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tweezers</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5415-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CrystalClene coverslips 18 mm</td>
			<td>Molecular Dimensions Ltd</td>
			<td>MD4-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml glass Pasteur pipettes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z722669</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-215-360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well XRL crystallization tray</td>
			<td>Molecular Dimensions Limited</td>
			<td>MD3-11</td>
			<td>For screens established by hand</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% (w/v) PEG 8000, 0.2 M ammonium sulfate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 8000, 0.2 M magnesium acetate, 0.1 M sodium cacodylate pH 6.5</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% (w/v) PEG 6000, 100 mM citric acid pH 5.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening

ランダムmicroseedマトリックススクリーニング（リスク管理措置）は、種結晶をランダム画面に付加されたタンパク質結晶化技術である。結晶は、タンパク質の相図の準安定域で成長し、余分な結晶化リードがしばしば得られる可能性を増加させることにより、製造された結晶の品質を向上させることができ、データ収集および浸漬実験のために、結晶の十分な供給が提供される。ここでは、手または96ウェルまたは24ウェルトレイ形式で、液体ハンドリングロボットを用いてのいずれか確立シッティングドロップまたはハンギングドロップ蒸気拡散実験のいずれかに適用することができるリスク管理措置のための一般的な方法を記載している。

RMMS実験の（A）実施例リスク管理措置のスクリーニングの有効性を実証するために、我々はニワトリ卵白リゾチーム（HEWL）およびウシ肝臓カタラーゼ（BLC）の結晶化にこの方法を適用する。これらの酵素は極めて結晶性であり、構造的によくターゲット15,16の両方を特徴とする。このような両方のリスク管理措置で達成可能な強化された結晶化の成功率を説明する?...

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Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

ここでは、ランダムmicroseedマトリックススクリーニングのための一般的方法を記載する。この技術は、有意に、タンパク質結晶化スクリーニング実験の成功率を高める最適化の必要性を低減し、データ収集およびリガンド浸漬実験の結晶の安定供給を提供することが示されている。

ランダムMicroseedマトリックススクリーニングによってタンパク質結晶化の成功率を向上させる

Random microseed matrix screening  (rMMS) is a protein crystallization technique in which seed crystals are added  to random screens. By increasing the ...

improving-success-rate-protein-crystallization-random-microseed

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17.7K ビュー.  University of Bristol. ここでは、ランダムmicroseedマトリックススクリーニングのための一般的方法を記載する。この技術は、有意に、タンパク質結晶化スクリーニング実験の成功率を高める最適化の必要性を低減し、データ収集およびリガンド浸漬実験の結晶の安定供給を提供することが示されている。 

ビデオ: Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

液相の回復と分子量ベース画用GELFREE 8100分別システムの使用

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

生物学

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

電子線結晶学による構造生物学研究用小型膜タンパク質の二次元結晶化トライアルの評価

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

X -線結晶構造のためのタンパク質の結晶化

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Detection of Functional Matrix Metalloproteinases by Zymography

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.

This protocol describes an activity-based assay for detecting matrix metalloproteinases in culture supernatants or body fluids.

ザイモグラフィーによる機能マトリックスメタロプロテイナーゼの検出

Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

脂質中間相における膜タンパク質の結晶化

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

Single Particle Electron Microscopy Reconstruction of the Exosome Complex Using the Random Conical Tilt Method

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large macromolecular complexes. Compared to X-ray crystallography, it has some unique advantages. First, single particle EM reconstruction does not need to crystallize the protein sample, which is the bottleneck in X-ray crystallography, especially for large macromolecular complexes. Secondly, it does not need large amounts of protein samples. Compared with milligrams of proteins necessary for crystallization, single particle EM reconstruction only needs several micro-liters of protein solution at nano-molar concentrations, using the negative staining EM method. However, despite a few macromolecular assemblies with high symmetry, single particle EM is limited at relatively low resolution (lower than 1 nm resolution) for many specimens especially those without symmetry. This technique is also limited by the size of the molecules under study, i.e. 100 kDa for negatively stained specimens and 300 kDa for frozen-hydrated specimens in general.
For a new sample of unknown structure, we generally use a heavy metal solution to embed the molecules by negative staining. The specimen is then examined in a transmission electron microscope to take two-dimensional (2D) micrographs of the molecules. Ideally, the protein molecules have a homogeneous 3D structure but exhibit different orientations in the micrographs. These micrographs are digitized and processed in computers as "single particles". Using two-dimensional alignment and classification techniques, homogenous molecules in the same views are clustered into classes. Their averages enhance the signal of the molecule's 2D shapes. After we assign the particles with the proper relative orientation (Euler angles), we will be able to reconstruct the 2D particle images into a 3D virtual volume.
In single particle 3D reconstruction, an essential step is to correctly assign the proper orientation of each single particle. There are several methods to assign the view for each particle, including the angular reconstitution1 and random conical tilt (RCT) method2. In this protocol, we describe our practice in getting the 3D reconstruction of yeast exosome complex using negative staining EM and RCT. It should be noted that our protocol of electron microscopy and image processing follows the basic principle of RCT but is not the only way to perform the method. We first describe how to embed the protein sample into a layer of Uranyl-Formate with a thickness comparable to the protein size, using a holey carbon grid covered with a layer of continuous thin carbon film. Then the specimen is inserted into a transmission electron microscope to collect untilted (0-degree) and tilted (55-degree) pairs of micrographs that will be used later for processing and obtaining an initial 3D model of the yeast exosome. To this end, we perform RCT and then refine the initial 3D model by using the projection matching refinement method3.

This article describes a standard method to get a three-dimensional (3D) reconstruction of biological macromolecules using negative staining electron microscopy (EM). In this protocol, we explain how to get the 3D structure of the Saccharomyces cerevisiae exosome complex at medium resolution using the random conical tilt reconstruction method (RCT).

ランダムコニカルチルト方式を使用したエキソソーム複合体の単粒子の電子顕微鏡再構成

Single particle electron microscopy (EM) reconstruction has recently become a popular tool to get the three-dimensional (3D) structure of large ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

脂質Bicelle法を用いた膜タンパク質のハイスループット結晶化

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Preparation of the Mgm101 Recombination Protein by MBP-based Tagging Strategy

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the Mgm101 protein is involved in the recombinational repair of mitochondrial DNA. Recent investigations have indicated that Mgm101 is related to the Rad52-type recombination protein family. These proteins form large oligomeric rings and promote the annealing of homologous single stranded DNA molecules. However, the characterization of Mgm101 has been hindered by the difficulty in producing the recombinant protein. Here, a reliable procedure for the preparation of recombinant Mgm101 is described. Maltose Binding Protein (MBP)-tagged Mgm101 is first expressed in Escherichia coli. The fusion protein is initially purified by amylose affinity chromatography. After being released by proteolytic cleavage, Mgm101 is separated from MBP by cationic exchange chromatography. Monodispersed Mgm101 is then obtained by size exclusion chromatography. A yield of ~0.87 mg of Mgm101 per liter of bacterial culture can be routinely obtained. The recombinant Mgm101 has minimal contamination of DNA. The prepared samples are successfully used for biochemical, structural and single particle image analyses of Mgm101. This protocol may also be used for the preparation of other large oligomeric DNA-binding proteins that may be misfolded and toxic to bacterial cells.

The yeast mitochondrial nucleoid protein, Mgm101, is a Rad52-type recombination protein that forms large oligomeric rings. A protocol is described to prepare soluble recombinant Mgm101 using the Maltose Binding Protein (MBP)-tagging strategy coupled with cation exchange and size exclusion chromatography.

MBPベースタギング戦略によってMgm101組換えタンパク質の調製

The MGM101 gene was identified 20 years ago for its role in the maintenance of mitochondrial DNA. Studies from several groups have suggested that the ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

培養哺乳動物細胞内の生物学的経路のユビキチンおよびユビキチン様システムレギュレータを識別するために、siRNAのスクリーニング

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay (PCA) in Living Cells

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often depend on its interactions with other proteins. Here, we describe a protocol for the yeast protein-fragment complementation assay (PCA), a powerful method to detect direct and proximal associations between proteins in living cells. The interaction between two proteins, each fused to a dihydrofolate reductase (DHFR) protein fragment, translates into growth of yeast strains in presence of the drug methotrexate (MTX). Differential fitness, resulting from different amounts of reconstituted DHFR enzyme, can be quantified on high-density colony arrays, allowing to differentiate interacting from non-interacting bait-prey pairs. The high-throughput protocol presented here is performed using a robotic platform that parallelizes mating of bait and prey strains carrying complementary DHFR-fragment fusion proteins and the survival assay on MTX. This protocol allows to systematically test for thousands of protein-protein interactions (PPIs) involving bait proteins of interest and offers several advantages over other PPI detection assays, including the study of proteins expressed from their endogenous promoters without the need for modifying protein localization and for the assembly of complex reporter constructs.

Genome-wide Protein-protein Interaction Screening by Protein-fragment Complementation Assay PCA in Living Cells

Proteins interact with each other and these interactions determine in a large part their functions. Protein interaction partners can be identified at high-throughput in vivo using a yeast fitness assay based on the dihydrofolate reductase protein-fragment complementation assay (DHFR-PCA).

生細胞内のタンパク質断片相補アッセイ（PCA）によるゲノムワイドなタンパク質間相互作用のスクリーニング

Proteins are the building blocks, effectors and signal mediators of cellular processes. A protein&#8217;s function, regulation and localization often ...