私たちは、星状細胞培養の寛大な供給のための博士スティーブン·ロビンソンとMSハニアCzerwinska（モナッシュ大学）に感謝しています。

1。培養細胞における細胞内アスコルビン酸の決定<ol><li> 細胞培養および収穫 <ol><li>標準的な培養手順19-21,32,38を使用して懸濁液（例えば 、ヒト赤白血病、K562）または付着細胞（ 例えば 、一次星状膠細胞）を成長させる。注意：細胞はアスコルビン酸が含まれていることを確認するために、どちらかアスコルビン酸またはDHA 33,39などのアスコルビン酸で培養された細胞をロードします。 </li></ol></li><li> アスコルビン酸含有細胞抽出物を作成します。 <ol><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄懸濁液または氷のように冷たいセル透過処理バッファー[CPBの450μLと接着細胞の適切な数をインキュベートする; PBS中の0.1％（w / v）のサポニン; 4°C]。注：経験的にエンドユーザーが（下記参照）アッセイの直線範囲内で吸光度の値を得るために必要なセルの数を決定します。注：組織抽出物はまた、（さらなる詳細については、説明を参照）を使用することができる。 </li><li>胸焼け10分間氷上でTE細胞は、徹底した細胞の溶解を確実にする。 </li><li>冷蔵微量遠心（4℃）中で5分間16,000×gで粗溶解物の遠心分離により細胞破片を除去することによって、明確にアスコルビン酸含有細胞内抽出液を作成します。 </li><li>慎重に各試料から4×100μLずつを除去し、PBS（ &quot;-AO」）のみ、または25μL/ウェルの45.5 U25μlの/ウェルのいずれかを含む96ウェル平底プレート中のウェルの水平シーケンスに追加/ mlのPBS（「+ AO」）中のL-アスコルビン酸オキシダーゼ（AO）の原液。注：これは（下記参照）の規格の準備と並行して行う必要があります。 </li></ol></li><li> アスコルビン酸標準曲線の構築（各アッセイのために新たに構築しなければならない） <ol><li>氷冷PBS中の10mMアスコルビン酸の原液を準備します。注：1分光光度法で石英キュベットを用いアスコルビン酸の濃度を確認265 nmの（吸光係数= 14.5mmで-1 cm -1）で40時1cm経路長。 </li><li>慎重に0〜20μmのアスコルビン酸標準のシリーズを用意しております。 </li><li>ステップ1.2.4と並行して、慎重に各標準から4×100μlアリコートを除去し、PBS（ &quot;-AO」）または25μL/ウェルが含まれ、96ウェル平底プレートのウェルの水平シーケンスに追加PBS中のAOの45.5 U / mlの原液（「+ AO」）。 （注）上記のアスコルビン酸標準100μlのアスコルビン酸0-2ナノモルが含まれます。注意してください、AOの目的は、減少をフェリシアにする非アスコルビン酸還元の寄与のために制御することです。 </li></ol></li><li> 細胞内のアスコルビン酸を決定-ステップ1：選択的にアスコルビン酸を除去し、定量的にフェリシアンとアスコルビン酸を酸化 <ol><li>公転ホイルでプレートを覆うことにより、暗所で5分間室温で550rpmで96ウェルプレートを混合する。注：T彼のステップは、DHAに「+ AO」のウェルですべてのアスコルビン酸を酸化する必要があります。 「-AO」ウェルは影響を受けないはずです。 </li><li>すべてのウェルにPBS中で（ここでは「フェリシアン」という。）3.5 mMのフェリシアン化カリウムの50μlを加える。最終的な[フェリシアン] = 1 mMの。注意：マルチピペッターを使用してください。 </li><li>公転暗所でさらに5分間室温で550rpmでプレートを混合する。注：このステップは、酸化されたアスコルビン酸の1分子当たりに減少フェリシアンの2分子の化学量論比でアスコルビン酸によってフェロシアンするフェリシアンの減少をもたらすべきである。 </li><li>直ちに50％（v / v）酢酸および30％（w / v）トリクロロ酢酸（TCA）を含有する新たに構成された溶液の25μlを加える。注意：マルチピペッターを使用してください。 </li></ol></li><li> 細胞内のアスコルビン酸を決定-ステップ2：フェロシアン化物の量を定量37を形成し <ol><li> Eにフェロシアン決定液37を100μlを追加よくACH。注：作業溶液は、使用直前になされるべきである：3 M酢酸ナトリウムの2ミリリットル液（pH 6.0）;氷酢酸（〜17.4 M酢酸）を0.5ml; 0.2 Mクエン酸を2ml; 0.1 M酢酸3.3ミリモルのFeCl 3の2ミリリットル; 30 mMのferene-Sの1ミリリットル。この作業溶液の最終容量は7.5ミリリットルにする必要があります。 </li><li>公転室温で30分間、550rpmで、暗所でプレートを混合する。 </li><li> 593 nmでのウェルの吸光度値を読み取る（ すなわち鉄（II）（ferene-S）3錯体の吸収極大）。 </li><li>最初に対応するから「+ AO」井戸のA 593 nmの値を減算して百万個の細胞あたりのナノモル、アスコルビン酸などの細胞内アスコルビン酸の量を計算する-各サンプルの「AO」井戸とし、アスコルビン酸の標準曲線から補間する（ステップ1.3を参照してください。 ）。標準曲線を構築する場合、ascorb量に対する各標準のために、この「差分値」をプロットするウェルあたり食べた。 </li></ol></li></ol>培養細胞からのアスコルビン酸流出の2。決定<ol><li> 細胞培養および収穫 <ol><li> （ステップ1.1を参照）、上記のように、サスペンションや接着細胞を増殖させる。注：最良の結果を得るために、サスペンションや接着細胞で24ウェルプラットフォーム形式で、以下の分析を実施しています。 </li><li>再懸 ​​濁浮遊細胞、または、またはカルシウムおよびマグネシウムなしで、予め温めたHEPES-緩衝生理食塩溶液400μlで、接着細胞をオーバーレイし、5mMのD-グルコース含有、ウェル中（HBS / D pH7.3の、37℃） 24ウェルプレート。検査される各24ウェルプレート上の指定された無細胞ウェルにHBS / Dの同じボリュームを追加します。注：後者は（以下を参照）は、ベースライン反応のための無細胞対照として役立つ。 </li></ol></li></ol> 3。リリースアスコルビン酸の量を決定します<ol><li>以下の原液を予め用意する必要があります。120HBS / D中のU / mlのAO（新鮮な準備）; 2.4 mMのFerene-S HBS / Dでは; HBS / Dでは120μMのFeCl 3及び600μMのクエン酸Na（より高濃度のストック溶液からすぐにご用意）。 </li><li> ferrireduction反応（ウェルあたり最終容量は600μLであるべき）を開始するには、すでにHBS / Dが400μLを含む個々のウェルに試薬を次のボリュームを追加します。 <ol><li>三連のウェルをペアリングするには、AO（120 U / ml）またはHBS / Dが50を添加する。最終AO濃度は10単位/ mlである必要があります。注：ラベルとして井戸を対になった」 - AO &quot;と&quot; + AO」。 </li><li> 37℃で5分間穏やか軌道に混合しながらプレートを混ぜる</li><li>すべてのウェルに2.4 mMのferene-Sの50μlを加える。最終ferene-S濃度は200μMである必要があります。 37℃で5分間、上記のようにプレートを混合</li><li>新たに調製された120μMのクエン酸第二鉄の50μlを加える。最終的な鉄とクエン酸の濃度は、10μMの鉄および50μMクエン酸である必要があります。よく混ぜる。 </li></OL&gt; </li><li> 3連のコントロールウェルでは、上にあるメディアを吸引し、0.1％サポニンを含む600μlのHBS / Dを追加します。注：これらは、（下記参照）並行して行われるべき乳酸脱水素酵素（LDH）放出アッセイのために「100％の細胞溶解」対照として役立つ。 </li><li> 37℃の暗所で60分間インキュベート</li><li>アスコルビン酸流出アッセイの終了時に、急速に各ウェルから500μLを吸引し、適切に24ウェルプレートのウェルをラベルに追加します。注：懸濁細胞を、最初に4℃での遠心分離により細胞を除去</li><li> 96ウェルプレートに上清の300μlのアリコートを追加してから、593で読み取っ。 </li></ol>細胞外アスコルビン酸4。決定<ol><li> 593 nmでのウェルの吸光度値をお読みください。 </li><li>細胞内のアスコルビン酸の測定のために記載したようmgタンパク質（または細胞百万個あたり）当たりのナノモルアスコルビン酸として細胞外アスコルビン酸の量を計算するステップ1.5.4中。注：アスコルビン酸放出は、細胞内アスコルビン酸によって制限されないように、エンドユーザが条件を最適化すべきである。 </li></ol> LDH放出の5。決定<ol><li>各サンプルからの細胞外液の残りの200μlの細胞溶解の程度を決定するために、LDH放出アッセイ32,41を実施しています。注：総放出可能なLDHの％として計算します。 0.1％サポニンで処理したサンプルから放出可能なLDHを決定します。 </li></ol>

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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electron+spin+resonance+spectra+of+radical+intermediates+in+the+oxidation+of+ascorbic+acid+and+related+substances.">The electron spin resonance spectra of radical intermediates in the oxidation of ascorbic acid and related substances.</a> J. Am. Chem. Soc. 94, 9062-9073 (1972).</li><li>Dringen, R., Kussmaul, L., Hamprecht, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detoxification+of+exogenous+hydrogen+peroxide+and+organic+hydroperoxides+by+cultured+astroglial+cells+assessed+by+microtiter+plate+assay.">Detoxification of exogenous hydrogen peroxide and organic hydroperoxides by cultured astroglial cells assessed by microtiter plate assay.</a> Brain Res. Brain Res. Protoc. 2, 223-228 (1998).</li><li>Lane, D. J. R., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplasma+membrane+electron+transport+comes+in+two+flavors.">Transplasma membrane electron transport comes in two flavors.</a> Biofactors. 34, 191-200 (2009).</li><li>Lin, S., Lin, D. C., Flanagan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+the+effects+of+cytochalasin+B+on+transport+and+motile+processes.">Specificity of the effects of cytochalasin B on transport and motile processes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 75, 329-333 (1978).</li><li>May, J. M., Qu, Z. C., Juliao, S., Cobb, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascorbic+acid+decreases+oxidant+stress+in+endothelial+cells+caused+by+the+nitroxide+tempol.">Ascorbic acid decreases oxidant stress in endothelial cells caused by the nitroxide tempol.</a> Free Radic. Res. 39, 195-202 (2005).</li><li>Avron, M., Shavit, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+and+simple+method+for+determination+of+ferrocyanide.">A sensitive and simple method for determination of ferrocyanide.</a> Anal. Biochem. 6, 549-554 (1963).</li></ol>

著者らは、開示することは何もありません。

本稿では、培養細胞における細胞内および細胞外コンパートメントから派生したアスコルビン酸の測定のための2、迅速な特定と比較的敏感比色マイクロプレートアッセイを提示する。アッセイは、標準的な実験機器や試薬へのアクセスを完了することができます。アッセイに必要な適度に高価な試薬は、それが、L-アスコルビン酸に向けた分析物特異性の高い学位を与...

1928年から1934年1に発表された論文中のアスコルビン酸（ビタミンC）、そして念願のアルバートシェント·ジェルジによる「抗壊血病因子」、および他のようなその同定の化学的性質の発見は、歴史の中で画期的なイベントでした生化学の。確かに、これらの発見は、シェント·ジェルジが1937年にノーベル生理学·医学賞を受賞しているに貢献した。動物や植物生理学におけるアスコルビン酸のための役割の拡大を続けるスイートだけでなく、人間の健康を、アクティブな科学の対象であり続ける調査と論争。 L-アスコルビン酸が豊富な生理学的還元剤であり、哺乳動物系で補因子、酵素、コラーゲンヒドロキシル化、カルニチンやノルエピネフリン生合成、チロシン代謝とペプチドホルモンのアミド化2を含む数々の明確に定義された酵素反応に貢献しています。興味深いことに、取り付けevideNCEは、アスコルビン酸などの水酸化に関与リルとアスパラヒドロキシラーゼなどの他の鉄依存ジオキシゲナーゼを、刺激し、低酸素誘導因子（HIFS）1αおよび2α3の標的化に関与していることを示唆している。最近の報告では、アスコルビン酸が核ヒドロキシラーゼ、十文字C（のJmjC）ドメインタンパク質を刺激する、その活性を介したクロマチン脱メチル化に影響を与えることによって、T細胞の成熟に関与していることを示唆している。後者は完全な活性4のためのアスコルビン酸を必要とするように表示されます。実際、アスコルビン酸によるこのような酵素の刺激は、HIFとコラーゲンヒドロキシラーゼのアスコルビン酸による刺激と同様のメカニズムで起こると思われる。他の古典的な効果の中で、アスコルビン酸は、水溶性連鎖頑丈ラジカルスカベンジャー5などの細胞抗酸化および原形質膜のリサイクルに大きく寄与するα-トコフェロールwを、6α-トコ基の還元による（ビタミンE）HICHは、膜脂質過酸化に対する保護7において重要である。ほとんどの哺乳類は、D-グルコースからのアスコルビン酸の新たな肝臓での合成が可能であるが、重要なのは、高等霊長類、モルモットといくつかのコウモリはビタミン8の栄養源に依存しています。これはグロ遺伝子の不活性化に起因して、影響を受けていない哺乳動物のオルソログのは9月13日オキシダーゼ酵素、γ-グロノ-ラクトンをコードする。この酵素は、グルコース13からのアスコルビン酸生合成の最終的な反応のために必要である。 ヒトでの腸管腔からのトランスポーターが介在する吸収後、アスコルビン酸は、循環系によって体全体に分布している。ビタミンは、一般的に（濃度は、通常、一般的な血漿中濃度と同様である、赤血球の注目すべき例外として）、およびマイクロモルの濃で、細胞内にミリモル濃度でその還元型で発見されているほとんどの細胞外液14,15におけるentrations（ 例えば 50〜200μM）。 生理的条件下では、アスコルビン酸は通常、アスコルビン酸、フリーラジカルに可逆的一電子酸化を受ける（AFR;もmonodehydroascorbateまたはsemidehydroascorbateとして知られている）。 AFRは比較的安定なラジカル16ですが、戻ってアスコルビン酸への迅速な一電子酵素的還元が存在しない場合に、2 AFRSは1アスコルビン酸とデヒドロ1（DHA）9,13,17に不均化を促進することができます。セルの内部に、アスコルビン酸、DHAの二電子酸化生成物は、急速にグルタチオンとNAD（P）H依存性酵素及び非酵素的反応によって13に戻って、アスコルビン酸を低減することができる。 それは古典的に鉄代謝におけるアスコルビン酸の唯一の重要な役割は、非ヘム鉄18の栄養吸収を刺激することであることが認められているが、我々と他の証拠Sを提供してきたtronglyアスコルビン酸塩、この金属の代謝に大幅に拡張役割を果たすことを示唆している。まず、アスコルビン酸満ち細胞によって放出されたアスコルビン酸は、細胞19,20による非トランスフェリン結合鉄の取り込みを調節するのに重要な役割を果たしていると思われる、と非常に最近の証拠は、アスコルビン酸はまた、トランスフェリン結合鉄の取り込みを調節することを示すセル21で、後半は主要な生理学的な鉄取り込み経路22に対応しています。 アスコルビン酸は哺乳類23,24の正常な中枢神経系の機能に必須である。一緒に副腎皮質、脳下垂体、胸腺、網膜と黄体と、脳は他の体組織23,25-27にアスコルビン酸の相対的な高濃度が含まれています。また、アストロサイト28,29および神経様細胞にグルタミン酸への30の両方の露出がascorbat外空間へとアスコルビン酸の放出を引き起こすことが知られているEはグルタミン酸誘発神経機能障害31に対してニューロンを保護すると考えられている。アストロサイトからのグルタミン酸誘発アスコルビン酸の放出の正確なメカニズムは不明であるが、我々は最近、アストロサイトのグルタミン酸とアスパラギン酸トランスポーター（GLASTによるグルタミン酸の取り込みによる膨潤細胞の関与を示す証拠を提供した。にも知られている興奮性アミノ酸トランスポーターアイソフォーム1 [EAAT1ヒトにおける）とアスコルビン酸塩32のような小さな有機アニオンに対して透過性容積感受性オスモライトおよび陰イオンチャネル（VSOACs）の結果としての活性化。 VSOAC形成に関与する形質膜導管の分子同一性は、33,34同定されていない。 多くのアッセイは、蛍光分光光度アッセイ及びクロマトグラフィー35,36を含む生物学的サンプル中のアスコルビン酸の測定のために開発されてきたが、特異性、感度、interferencに多くのばらつきがある化学汚染物質によるE、エンドポイントの分析物の効果的な直線範囲と安定性。さらに、アッセイの選択に影響を与える他の重要な要因は、迅速、使いやすさや、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）装置などの比較的特殊な装置へのアクセスである。 ここでは、培養細胞における細胞内アスコルビン酸の決定だけでなく、培養細胞からのアスコルビン酸の流出を測定するための別々のアッセイのためのシンプルかつ非常に特異的な比色マイクロプレートアッセイを提示する。後者のアッセイは、ナトリウム依存性アスコルビン酸トランスポーター（SVCTs）が発表しアスコルビン酸の迅速な再取り込みによる細胞からのアスコルビン酸の放出の過小評価の問題を回避することを目指しています。これらのメソッドの両方が私たちの前の出版物19,20,32,37,38の一部で登場してきたが、この原稿は、その効果的な実行のための命令とガイドラインの明示的なセットを提供します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="678">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:284px;">Nunc 96-well flat-bottom plates</td>
			<td style="width:135px;">Thermo</td>
			<td style="width:127px;">269620</td>
			<td style="width:132px;">Any flat-bottom 96-well plate can be used</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:284px;">Refrigerated benchtop microcentrifuge</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:127px;">5415D</td>
			<td style="width:132px;">A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used</td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:74px;width:284px;">Refrigerated bench-top centrifuge</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:127px;">5810R</td>
			<td style="width:132px;">Swing-bucket</td>
		</tr>
		<tr height="260">
			<td height="260" style="height:260px;width:284px;">Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer</td>
			<td style="width:135px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;">Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:284px;">Ependorf MixMate (microplate orbital mixer)</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf&#160;</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;">This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">General-purpose buffers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:284px;">MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="87">
			<td height="87" style="height:87px;width:284px;">HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2&#8226;2 H2O, 0.8 mM MgSO4&#8226;7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">General chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:284px;">L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;">Highest purity preparations should be obtained</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:284px;">Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>30790</td>
			<td style="width:132px;">Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:284px;">Cytochalasin B</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">C6762</td>
			<td style="width:132px;">Stock solutions prepared in DMSO or ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:284px;">Ascorbate oxidase (AO)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">A0157</td>
			<td style="width:132px;">Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Potassium ferricyanide (FIC)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">455989</td>
			<td style="width:132px;">Trihydrate</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5&#8242;,5&#8242;&#8242;-disulfonic acid disodium salt)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">92940</td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Sodium L-glutamate</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">L-glutamine</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Saponin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:127px;">47036</td>
			<td style="width:132px;">Prepare a 0.1% stock solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">3 M sodium acetate (pH 6.0)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">Glacial acetic acid</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">0.2 M citric acid</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:284px;">3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">30 mM ferene-S</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:284px;">50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stock solutions for ascorbate-efflux assay</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:127px;"></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">AO (120 U/ml)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">2.4 mM ferene-S</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:284px;">0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:132px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a rapid and specific microplate assay for the determination of intra- and extracellular ascorbate in cultured cells

ビタミンC（アスコルビン酸）は、唯一の近年の光になってきた、その多くは細胞代謝の多数の重要な役割を果たしている。脳のアスコルビン酸の恒常性のために重要であると思われる関係 - 例えば、脳内では、アスコルビン酸は、ニューロンとビシアストロサイト間のアスコルビン酸サイクルを伴う神経保護および神経調節的に作用する。さらに、新たな証拠は強くアスコルビン酸よりも古典的に認識され、細胞および全身の鉄代謝の調節において大幅に拡大役割を有することを示唆している。ノーマルと規制緩和、細胞および生物生理学のアスコルビン酸の重要な役割の増加の認識は非常に高価な専門機器を必要とせずに実行することができ、中スループットと高感度な分析手法の範囲を要求している。ここでは、BOの決定のための具体的かつ比較的安価なマイクロプレートアッセイ、中スループットの明示的な指示を提供細胞培養におけるTH細胞内および細胞外アスコルビン酸。

浮遊培養細胞の細胞内アスコルビン酸の定量第一のアッセイ（ 図1）において、細胞内アスコルビン酸は、以前公開された手順37でフェロシアン化物の高感度な測定を使用して、フェロシアンするフェリシアン化（ すなわち 、AOと小文字を区別）削減アスコルビン酸特有の後、決定されます。アスコルビン酸の検出は、フェロシアン化による第一...

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A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

アスコルビン酸は、近年では光になってきたそれらの多くは、細胞代謝の多数の重要な役割を果たしている。ここでは、媒体スループット、細胞培養の両方において細胞内および細胞外アスコルビン酸の測定のための特異的かつ安価なマイクロプレートアッセイを記載している。

培養細胞における細胞内および細胞外アスコルビン酸の定量のための迅速かつ特異的マイクロプレートアッセイ

Vitamin C (ascorbate) plays numerous important roles in cellular metabolism, many of which have only come to light in recent years. For instance, within ...

a-rapid-specific-microplate-assay-for-determination-intra

Research

JoVE Journal

Biology

13.4K ビュー.  University of Sydney. アスコルビン酸は、近年では光になってきたそれらの多くは、細胞代謝の多数の重要な役割を果たしている。ここでは、媒体スループット、細胞培養の両方において細胞内および細胞外アスコルビン酸の測定のための特異的かつ安価なマイクロプレートアッセイを記載している。 

ビデオ: A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells

Counting and Determining the Viability of Cultured Cells

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A hemacytometer is a thick glass slide with a central area designed as a counting chamber. Cell suspension is applied to a defined area and counted so cell density can be calculated. 

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. In this video, we demonstrate how cells are counted using a hemacytometer.

カウントと培養細胞の生存率の決定

Determining the number of cells in culture is important in standardization of culture conditions and in performing accurate quantitation experiments. A ...

生物学

Clonogenic Assay: Adherent Cells

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. Apart from documenting the method, the initial landmark study generated the first radiation-dose response curve for X-ray irradiated mammalian (HeLa) cells in culture1. Basically, the clonogenic assay enables an assessment of the differences in reproductive viability (capacity of cells to produce progeny; i.e. a single cell to form a colony of 50 or more cells) between control untreated cells and cells that have undergone various treatments such as exposure to ionising radiation, various chemical compounds (e.g. cytotoxic agents) or in other cases genetic manipulation. The assay has become the most widely accepted technique in radiation biology and has been widely used for evaluating the radiation sensitivity of different cell lines. Further, the clonogenic assay is commonly used for monitoring the efficacy of radiation modifying compounds and for determining the effects of cytotoxic agents and other anti-cancer therapeutics on colony forming ability, in different cell lines. A typical clonogenic survival experiment using adherent cells lines involves three distinct components, 1) treatment of the cell monolayer in tissue culture flasks, 2) preparation of single cell suspensions and plating an appropriate number of cells in petri dishes and 3) fixing and staining colonies following a relevant incubation period, which could range from 1-3 weeks, depending on the cell line. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cell lines with the use of an immortalized human keratinocyte cell line (FEP-1811)2. Also, our aims are to describe common features of clonogenic assays including calculation of the plating efficiency and survival fractions after exposure of cells to radiation, and to exemplify modification of radiation-response with the use of a natural antioxidant formulation.

The applicability of the clonogenic assay for evaluating reproductive viability has been established for more than 50 years. Here we demonstrate the general procedure for performing the clonogenic assay with adherent cells.

クローン原性アッセイ：付着細胞

The clonogenic (or colony forming) assay has been established for more than 50 years; the original paper describing the technique was published in 19561. ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

Detection of Intracellular Gene Expression in Live Cells of Murine, Human and Porcine Origin Using Fluorescence-labeled Nanoparticles

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, rat, human, pig and others. The verification of iPS clones mainly relies on the detection of the endogenous expression of different pluripotency genes. These genes mostly represent transcription factors which are located in the cell nucleus. Traditionally, the proof of their endogenous expression is supplied by immunohistochemical staining after fixation of the cells. This approach requires replicate cultures of each clone at this early stage to preserve validated clones for further experiments. The present protocol describes an approach with gene-specific nanoparticles which allows the evaluation of intracellular gene expression directly in live cells by fluorescence. The nanoparticles consist of a central gold particle coupled to a capture strand carrying a sequence complementary to the target mRNA as well as a quenched reporter strand. These nanoparticles are actively endocytosed and the target mRNA displaces the reporter strand which then start to fluoresce. Therefore, specific target gene expression can be detected directly under the microscope. In addition, the emitted fluorescence allows the identification, isolation and enrichment of cells expressing a specific gene by flow cytometry. This method can be applied directly to live cells in culture without any manipulation of the target cells.

This manuscript describes a novel technique which allows the detection of intracellular gene expression after endocytosis of fluorescence-labeled nanoparticles directly in live cells. The method does not require manipulation of the cells and is not restricted with respect to the target gene or species.

蛍光標識ナノ粒子を用いたマウス、ヒトおよびブタ起源のライブ細胞の細胞内遺伝子発現の検出

The reprogramming of somatic cells to induced pluripotent stem cells (iPS) has successfully been performed in different mammalian species including mouse, ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

ゼブラフィッシュにおける腎毒素マイクロインジェクションは急性腎障害をモデルに

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

核酸の濾過単離：簡易迅速DNA抽出方法

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

A Rapid, Scalable Method for the Isolation, Functional Study, and Analysis of Cell-derived Extracellular Matrix

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and pathological processes. However, the isolation of ECM, from tissues or cell culture, is complicated by the insoluble and cross-linked nature of the assembled ECM and by the potential contamination of ECM extracts with cell surface and intracellular proteins. Here, we describe a method for use with cultured cells that is rapid and reliably removes cells to isolate a cell-derived ECM for downstream experimentation.
Through use of this method, the isolated ECM and its components can be visualized by in situ immunofluorescence microscopy. The dynamics of specific ECM proteins can be tracked by tracing the deposition of a tagged protein using fluorescence microscopy, both before and after the removal of cells. Alternatively, the isolated ECM can be extracted for biochemical analysis, such as sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. At larger scales, a full proteomics analysis of the isolated ECM by mass spectrometry can be conducted. By conducting ECM isolation under sterile conditions, sterile ECM layers can be obtained for functional or phenotypic studies with any cell of interest. The method can be applied to any adherent cell type, is relatively easy to perform, and can be linked to a wide repertoire of experimental designs.

The extracellular matrix plays a major role in defining the microenvironment of cells and in modulating cell behavior and phenotype. We describe a rapid method for the isolation of cell-derived extracellular matrix, which can be adapted to different scales for microscopic, biochemical, proteomic, or functional studies.

細胞由来の細胞外マトリックスの急速な、単離、機能性研究のためのスケーラブルな方法、および分析

The extracellular matrix (ECM) is recognized as a diverse, dynamic, and complex environment that is involved in multiple cell-physiological and ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

動的細胞突起におけるソフトウェア支援トラッキングのためのグラフィカルユーザインタフェース

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Transient Expression and Cellular Localization of Recombinant Proteins in Cultured Insect Cells

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and the determination of the biochemical function of proteins at the sub-organismal level. Although baculovirus expression systems are increasingly used for protein production in numerous biotechnological, pharmaceutical, and industrial applications, nonlytic systems that do not involve viral infection have clear benefits but are often overlooked and underutilized. Here, we describe a method for generating nonlytic expression vectors and transient recombinant protein expression. This protocol allows for the efficient cellular localization of recombinant proteins and can be used to rapidly discern protein trafficking within the cell. We show the expression of four&#160;recombinant proteins in a commercially available insect cell line, including two aquaporin proteins from the insect Bemisia tabaci, as well as subcellular marker proteins specific for the cell plasma membrane and for intracellular lysosomes. All recombinant proteins were produced as chimeras with fluorescent protein markers at their carboxyl termini, which allows for the direct detection of the recombinant proteins. The double transfection of cells with plasmids harboring constructs for the genes of interest and a known subcellular marker allows for live cell imaging and improved validation of cellular protein localization.

Nonlytic insect cell expression systems are underutilized for production, cellular trafficking/localization, and recombinant protein functional analysis. Here, we describe methods to generate expression vectors and subsequent transient protein expression in commercially available lepidopteran cell lines. The co-localization of Bemisia tabaci aquaporins with subcellular fluorescent marker proteins is also presented.

培養昆虫細胞における一過性発現および組換えタンパク質の細胞内局在

Heterologous protein expression systems are used for the production of recombinant proteins, the interpretation of cellular trafficking/localization, and ...

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. HIF-1 consists of a heterodimeric oxygen-regulated &#945; subunit (HIF-1&#945;) and constitutively expressed &#946; subunit (HIF-1&#946;) also known as aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator (ARNT), regulating genes involved in diverse processes including angiogenesis, erythropoiesis and glycolysis. The identification of HIF-1 interacting proteins is key to the understanding of the hypoxia signaling pathway. Besides the regulation of HIF-1&#945; stability, hypoxia also triggers the nuclear translocation of many transcription factors including HIF-1&#945; and ARNT. Notably, most of the current methods used to study such protein-protein interactions (PPIs) are based on systems where protein levels are artificially increased through protein overexpression. Protein overexpression often leads to non-physiological results arising from temporal and spatial artifacts. Here we describe a modified co-immunoprecipitation protocol following hypoxia treatment using endogenous nuclear proteins, and as a proof of concept, to show the interaction between HIF-1&#945; and ARNT. In this protocol, the hypoxic cells were harvested under hypoxic conditions and the Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) wash buffer was also pre-equilibrated to hypoxic conditions before usage to mitigate protein degradation or protein complex dissociation during reoxygenation. In addition, the nuclear fractions were subsequently extracted to concentrate and stabilize endogenous nuclear proteins and avoid possible spurious results often seen during protein overexpression. This protocol can be used to demonstrate endogenous and native interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators under hypoxic conditions.

Here we describe a co-immunoprecipitation protocol to study protein-protein interactions between endogenous nuclear proteins under hypoxic conditions. This method is suitable for demonstration of the interactions between transcription factors and transcriptional co-regulators at hypoxia.

低酸素の条件の下で培養された細胞から内因性の核蛋白質を用いた Co 免疫沈降試験

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...