This research was supported in part by NSF grant CHE-1229562 (VDGM), the Office of Undergraduate Research at Elon University, the Elon Chemistry Department, and the Elon Lumen Prize (TL and TAD), the Elon College Fellows Program (JAC), and the Elon College Honors Program (TAD).

すべての動物実験は、健康ガイドラインの国立研究所に適合し、ウェイクフォレスト大学動物実験委員会によって承認された。 SOD1G93A [B6SJL-TGN（SOD1-G93A）1Gur]マウスモデルの繁殖ペアは、ジャクソン研究所（バーハーバー、ME）から入手した。野生型（WT）雌SOD1G93A雄非トランス[B6SJL-TGN（SOD1-G93A）1Gur] SOD1G93Aマウスおよび実験に使用した非トランスジェニックWT同腹子を生成するために飼育した。 調査のための1.モデル<ol><li>細胞培養<ol><li> 5％CO 2中、37℃でヒト胚性腎細胞（HEK-T293）を10％熱不活性化ウシ胎児血清、1％ペニシリン-ストレプトマイシン、および1％L-グルタミンを補充したDMEM中で細胞を維持する。 </li><li> T75フラスコ中で細胞を増殖し、それらが90％コンフルエンスに到達させる。 </li><li> 5％CO 2中37℃で3〜5分間トリプシン処理（0.25％トリプシン-EDTA）を介して細胞分裂を行ってください</sub&gt;、細胞培地の等量とトリプシンの不活性化、及び4℃で700×gで5分間、細胞を遠心分離する。 </li><li>培地を吸引除去し、培養培地中で細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li> T75に適切なフラスコまたはプレート7×10 4細胞における種子細胞が治療サイトカインの前に48時間をフラスコ。これは〜処理時の70％の密度を与える必要があります。 </li><li>血清飢餓細胞を24時間後に、メディアを吸引し、無血清培地を同じ体積（DMEM、無菌）で置換することができる。 </li><li> 5 PG /μL、10 ng /μLでの作業濃度で超純水を用いて凍結乾燥粉末からのTNF-α、IL1-β、およびIFN-γを、準備、および10 ng /μLで、それぞれ、ウェルに追加/フラスコ。 </li><li>直接適切なフラスコの細胞培養培地に可溶化されたサイトカインの添加により、血清飢餓細胞を治療する。治療は、個々のサイトカインの全3（「* 3」ともいう）、またはアイドルマスターのカクテルからなった（「0」と呼ばれる）、対照としてリル水。 </li><li>評価と収穫前に24、48または72時間処理した細胞をインキュベートする。 </li></ol></li><li>細胞生存率を評価<ol><li> 1×PBS中の3- 5mg / mlの溶液（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）を作る。 </li><li> 12ウェルプレートは、各ウェルにMTT溶液100μlを追加し、穏やかに均一な分布を保証するために旋回。 </li><li> 5％、37℃で15分〜1時間、CO 2用プレートをインキュベートし、紫色の存在について顕微鏡下でチェックする。紫色のが存在しない場合は、再び旋回し、紫色が観察されるまで細胞は5分間隔でインキュベートすることを可能にする。必要な時間は、各研究者によって決定されるべきである。 </li><li>反復ピペッターを使用して、各ウェルにMTTの溶媒（4mMのHClおよびイソプロパノール中の0.1％NP40）700μlを添加し、5〜10分間室温でプレート（複数可）を揺する、またはすべての紫色は、細胞を左まで。紫色の場合、色は、細胞から出てくる溶剤の追加の200μlのを追加し、旋回し続けない。 </li><li>分析のために、各ウェルから100μlのを取り、96ウェルプレートに配置し、570nmのを使用して、プレートリーダーを630nmの参照波長で読み取り、しかし595nmでの読み取り値は、一貫性のある設定で採取されることもあれば良い。 </li></ol></li><li> ALSの動物モデル<ol><li>すべての動物実験は、健康ガイドラインの国立研究所に適合し、ウェイクフォレスト大学動物実験委員会によって承認された。 SOD1G93A [B6SJL-TGN（SOD1-G93A）1Gur]マウスモデルの繁殖ペアは、ジャクソン研究所（バーハーバー、ME）から入手した。野生型（WT）雌SOD1G93A雄非トランス[B6SJL-TGN（SOD1-G93A）1Gur] SOD1G93Aマウスおよび実験に使用した非トランスジェニックWT同腹子を生成するために飼育した。 </li><li>変異SOD1 25に対して標準プライマーを用いて遺伝子型判定を行います。 </li></ol></li></ol>ミトコンドリアの2の分離注：それはすぐに作業し、作業中は氷の上のすべてを維持することが重要である。 <ol><li>ミトコンドリアの分離バッファ（MIB）の調製、脊髄分離バッファ（SCのMIB）と実験バッファ（EB） <ol><li>先にMIBとEBのための時間の以下のストック溶液を準備します。 </li><li> H 2 O 70ml中のトリス塩基12.1gを溶解させることにより1 Mトリス/ MOPSを作るpHを7.4に取得するためにドライMOPSを追加します。最後の100ミリリットルにボリュームを調整します。フィルター滅菌し、4℃で保存する。 </li><li> KH 2 PO 4のK 2 HPO 4の80.2ミリリットルと19.8ミリリットルを混合して1 M Kphosを行います。室温で保管してください。 </li><li> H 2 O 10mlにEGTAを3.8g添加することによって0.2 M EGTA /トリス作る溶解し、〜30〜40ミリリットルまでの1Mトリス/ MOPSを追加します。 50ミリリットル、室温で滅菌フィルターとストアに調整します。 pHが〜6.7になることに注意してください。 </li><li> 10mlをすることにより1 Mグルタミン酸を作るグルタミン酸の1M溶液。フィルター滅菌し、店舗、4℃。 </li><li>リンゴ酸の1M溶液10ミリリットルを行うことで、1 Mマラテを行います。 50 mMまでのトリス/ MOPSを追加します。フィルター滅菌し、4℃で保存する。 </li><li> 200mMのスクロース、10mMのトリス/ MOPS、pHが7.4、および1mM EGTA /トリスの濃度でMIBを確認します。フィルター滅菌し、4℃で保存する。 </li><li> 250mMのスクロース、20mMのHEPES-KOH pH7.5の、10のKCl、1.5のMgCl 2、1mMのEDTA、1mMのEGTA、1mMのDTT、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルの濃度でSCのMIBを作る。 </li><li> 125のKClの濃度でEBを行い、10mMトリス/ MOPS、pH7.4の5mMのグルタミン酸塩、2.5mMのリンゴ酸塩、1 mMのリン酸カリウム、pH7.4で、10mMのEGTA /トリス。フィルター滅菌し、4℃で保存する。 </li></ol></li><li>細胞を回収する前に、機器の準備。 <ol><li>小さなガラス容器と均質化乳棒を、滅菌水で3回すすぎ、氷上に置きます。 </li><li>そのような標準的なドリル、セルSCRA、必要に応じてアイテムを収集PERS、1.5ミリリットル、15ミリリットルと50ミリリットルチューブとソリューション。 </li></ol></li><li>ミトコンドリアの単離<ol><li>培養細胞<ol><li>各サンプルタイプのために、細胞の2 T175フラスコを使用しています。 </li><li>細胞であることを確認してください〜90％のコンフルエントと対照実験、またはプレートに使用し、ステップ1.2で上記のように扱う。 </li><li>作業台の上に、吸引メディアとの1X PBS各15mlで2回付着細胞を洗う。 </li><li>緩衝液を吸引し、フラスコの底から接着細胞を除去し、フラスコをこすり。 </li><li>氷の上円錐管と場所を、各フラスコに1×PBSの15ミリリットルを追加スワール、および個々の15​​ミリリットルに転送。 </li><li>スクレイピングは、スイングバケットローターを用いて、卓上遠心分離機を用いて、700×gで、4℃で5分間、遠心管を完了すると。 </li><li>吸引し上清とMIBの1ミリリットルの各ペレットを再懸濁。 </li><li>均質化のための小さなガラス容器に懸濁液および転送の両方を兼ね備えています。 </li><li> MIBを追加容器にバッファが最初の行に到達するまで。 3つのパスのために中程度の速度でドリルに装着乳棒で細胞をホモジナイズする。容器は、液体の上乳棒を削除するには、連続パスで安定した速度を使用しないように、このステップの間に氷の上にあることを確認します。 </li><li> 50ミリリットルコニカルチューブに均質化されたソリューションを転送します。 </li><li> 18ゲージ1½インチの針を用いて3ミリリットル注射器にソリューションを描画し、27ゲージ1/2インチの針を氷上に戻って円錐管にそれを追放。細胞膜破壊のためにその力を利用するように、管の内壁に対してソリューションを追放するように注意してください。 </li><li> 5回の合計のための注射器の手順を繰り返します。 </li><li>スイングバケットローターを使用して、テーブルトップ遠心機で600×gで、4℃で5分間15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に溶液を移す。 </li><li>注意深く上清を除去し、3 1.5ミリリットルのチューブの間で分配する。 注：Mitocho細胞膜および未破壊細胞をペレット化している間ndriaは、この最初の低速回転後の上清中にある。 </li><li>万XG、5分間、4℃で固定角ローターで遠心管。 </li><li>吸引し上清と100μlのMIBにペレットを組み合わせて、すぐに氷上に置きます。 注：ミトコンドリアは、この高速スピンした後のペレットである。ミトコンドリアは、典型的には、単離後2-3イオン氷〜のためのそれらの膜電位を維持し、MIB中の濃縮ストック溶液として最も安定しているであろう。 </li></ol></li><li>マウス組織からミトコンドリア単離<ol><li> IACUCプロトコルに従って、マウスを麻酔。麻酔を誘導するために5.0％で気化器を設定します。目に近づいたり、綿棒でタップされると動物が足のピンチまたは点滅反射のために反射の欠如によって麻酔をかけていることを確認した。 1.5％と2.0％の間で気化器を保つことによって全体の外科的処置のために麻酔下でマウスを保管してください。 </li><li> EXC氷の中に個別に各動物と場所から肝臓および脊髄冷たい1×PBS ISE - / - すべての血液を洗い流すために。 </li><li>肝臓は、氷上で計量皿に組織を転送し、1分間新鮮カミソリの刃を使用して細かく切る。 </li><li>バッファは最初の行に到達するまで容器に組織し、適切なバッファー（脊髄のために肝臓またはSC MIBのMIB）を追加します。 5パス手で乳棒で組織をホモジナイズする。容器は、液体の上乳棒を削除するには、連続パスで安定した速度を使用しないように、このステップの間に氷の上にあることを確認します。 </li><li>ホモジネートを15 mlチューブをきれいに転送します。 </li><li> 750×gで固定角ローター中で遠心管、4°Cで10分間。 </li><li>きれいなチューブに上清を保存して、氷の上に置きます。 注：細胞膜および未破壊細胞をペレット化しながらミトコンドリアは、この最初の低速回転後の上清中にある。 </li><li>脊髄ペレットを再懸濁ISC MIBのN 500μL。 </li><li>唯一のSC MIBと血管ハーフウェイこの時間を埋める、各3回を再均質化する。 </li><li>新しいチューブに新しいホモジネートを転送します。 </li><li>遠心機750×gで固定角ローターで、4℃、10分間。 </li><li>各サンプルからの最初の上清と、より多くのミトコンドリアが含まれているこれらの新しい上清を、結合します。 </li><li>万XG、5分間、4℃で固定角ローターで遠心管。 </li><li>吸引し上清と500 MIBのμLと50μlのSC MIBの脊髄ペレットに肝臓ペレットを再懸濁し、直ちに氷上に置きます。 注：ミトコンドリアは、この高速スピンした後のペレットである。ミトコンドリアは、典型的には、単離後2-3イオン氷〜のためのそれらの膜電位を維持し、MIB中の濃縮ストック溶液として最も安定しているであろう。 </li><li>溶液中のミトコンドリアの濃度を推定するためのタンパク質濃度のアッセイを行う。指示に従う商業的タンパク質アッセイキット又は類似の方法26を使用するための。ミトコンドリアの典型的な濃度は以下のとおりです。2 T175フラスコの収量〜2 mg / mlの、1マウス肝臓〜3-5 mg / mlの、そして1マウス脊髄〜1-3 mg / mlの。 </li></ol></li></ol></li><li> （製造業者によって提供されたプロトコルから適応）のQuantikine ELISAキットC R＆Dラット/マウスチトクロームを使用してシトクロム cアッセイ。 <ol><li>すぐに反応をセットアップする前に、EBと0.5 mg / mlの作業濃度にミトコンドリアを希釈し、反応（チューブあたりミトコンドリアの一般的に30〜50μl）を1.5 mlチューブに希釈したミトコンドリアを配布。 </li><li>希釈されたミトコンドリアに、全体積の1％で、EBまたはDMSOのいずれかを追加し、7〜10分間、ベンチトップでの反応をインキュベートする。より長い時間枠が必要な場合、これらの反応は、室温で最大30分間安定である。 </li><li>ペレットを10,000×gでの固定角ローターで遠心分離によるミトコンドリア、4℃で5分間、慎重LY上清を分離し、独立した1.5​​ミリリットルのチューブにそれぞれ配置します。 注意：チューブのいずれか後の分析のために-20℃で凍結するか、または直ちに使用することができる。 </li><li>ペレットおよび上清27にシトクロムc の濃度を比較することにより、シトクロムc の放出を決定します。 <ol><li> 1×PBS中0.5％のTx-100との反応の元のボリュームでペレットを可溶化することにより、サンプルを準備します。 </li><li>各サンプルについて、 シトクロム cジュゲートの100μlの（直ボトルから使用）プラス0.5％TX-100μlを添加することによって反応をELISAプレート上に2つのウェル、現在可溶化ペレット用と上清のための1つを準備する1×PBSで100、その後、すべてのペレットまたは上清サンプルの。 </li><li>静かに、カバーを混ぜ、1時間、37℃でインキュベートする20秒間プレートを低く設定（レベル2-4）ボルテックス。 </li><li>次に、機械製造に応じて希釈した洗浄緩衝液でプレートを4回洗浄ER者の説明。ペーパータオル上のウェルをタップして余分な溶液を除去。 </li><li>各ウェルに1 A + B現像液、室温、暗所で20〜30分間静置します：次に、1の150μlを添加する。 </li><li>最後に、各ウェルに50μlの停止溶液を追加し、マイクロプレートリーダーを用いて540nmでの吸光度の読み取りを行う。各反応の上清対ペレット中のシトクロムcの量を比較することによって、 シトクロム c の放出の量を計算する。 </li></ol></li></ol></li></ol>ミトコンドリアの3。評価（DYS）関数<ol><li>反応は、（通常はミトコンドリアの30〜50μlのチューブごとに使用されている）、セットアップEBと0.5 mg / mlの作業濃度にミトコンドリアを希釈し、反応のために1.5ミリリットルチューブ内に配置されます直前。 </li><li>ミトコンドリア治療<ol><li> 50 nMのバリノマイシンと混合FCCP適切な治療法を追加します（EB制御、1μM、10μMロテノン、5μMのオリゴマイシン、2 mMのKCN、または200μMのADP、最終濃度）が希釈されたミトコンドリアの総容量番目の 1/10での反応を分離する。 7分間、ベンチトップでの反応をインキュベートします。 注：有害である可能性があり、皮膚を通して誤飲や吸収などのこれらの物質を取り扱う場合は注意が必要です。 </li><li> 100μMの作業濃度で滅菌水で再構成し、2μMに、-20℃で保存し、TMREを希釈し、ミトコンドリアの反応容量に等しいボリュームを追加。 </li><li> 7分間、ベンチトップでの反応をインキュベートします。 </li><li>万XG、5分間、4℃で固定角ローターでの遠心分離によってペレットのミトコンドリア。 </li><li>負荷396ウェルプレート上の各サンプルの上清容量の半分と蛍光を読み取る。 注：TMREの励起および発光波長は、のために使用されるボリュームとプレートを用いて、製造者の指示に従って最適化されるべきであるアッセイ。励起/発光波長を用いて、1μMTMREを25μlを標準384ウェル黒色プレート（最終反応濃度）最も強い信号が得られたを使用して&#160; 485ナノメートル/ 535 nmの。 </li><li>コントロール（EB）と対照サンプルからRFUによる実験サンプルのためのプレートリーダーから得られた相対蛍光値（RFU）で割ることにより、各治療の間の蛍光の倍率差を計算する。 </li></ol></li></ol>

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K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid.">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150, 76-85 (1985).</li><li>Certo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+primed+by+death+signals+determine+cellular+addiction+to+antiapoptotic+BCL-2+family+members.">Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic BCL-2 family members.</a> Cancer Cell. 9, 351-365 (2006).</li><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues;+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver;+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material.">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> The Journal Of Biological Chemistry. 172, 619-635 (1948).</li><li>Hogeboom, G. H., Claude, A., Hotch-Kiss, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+distribution+of+cytochrome+oxidase+and+succinoxidase+in+the+cytoplasm+of+the+mammalian+liver+cell.">The distribution of cytochrome oxidase and succinoxidase in the cytoplasm of the mammalian liver cell.</a> The Journal of Biological Chemistry. 165, 615-629 (1946).</li><li>Marques-Fernandez, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNFalpha+induces+survival+through+the+FLIP-L-dependent+activation+of+the+MAPK/ERK+pathway.">TNFalpha induces survival through the FLIP-L-dependent activation of the MAPK/ERK pathway.</a> Cell Death &amp; Disease. 4, e493 (2013).</li><li>Chao, C. C., Hu, S., Ehrlich, L., Peterson, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergistically+mediate+neurotoxicity:+involvement+of+nitric+oxide+and+of+N-methyl-D-aspartate+receptors.">Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors.</a> Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).</li><li>Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+death+in+cytokine-activated+primary+human+brain+cell+culture:+role+of+tumor+necrosis+factor-alpha.">Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha.</a> Glia. 28, 114-127 (1999).</li><li>Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+endothelial+cell+activation+in+experimental+sepsis+with+a+two-step+cell+culture+model.">Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model.</a> Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).</li><li>Brown, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes:+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria.">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li><li>Wong, A., Cortopassi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+in+a+neural+cell+line+using+a+fluorescence+plate+reader.">High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).</li><li>Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+assays+for+the+mitochondrial+permeability+transition+using+a+fluorescence+multiwell+plate+reader.">Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader.</a> Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).</li><li>Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+membrane+potential+in+the+cells+by+microchip+flow+cytometry.">Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry.</a> Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).</li><li>Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivator+of+transcription+fusion+protein+transduction+causes+membrane+inversion.">Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

組換えサイトカインとHEK-293T細胞の治療は、48時間（ 図1）を介して細胞死の程度の量を引き起こす。 TNF-α処理により誘導される細胞死の量は、以前に報告された研究30と同様であり、細胞の生存率は、単独でも、文献31,32と一致する任意のサイトカインと総括量よりも大きい複数のサイトカインの同時投与後に減少する。サイトカイン治療の量およびタイプを調?...

生きている細胞は、脂肪や炭水化物の形で代謝エネルギーを銀行と生合成、膜輸送や移動のためにこのエネルギーを使用しています。いくつかのエネルギーは、解糖の間に直接ATPへの栄養糖の変換によって細胞質ゾルが得られる。しかし、細胞内のATP産生の主な供給源は、ミトコンドリア呼吸鎖1を介してミトコンドリア内活かされている。ミトコンドリアのアーキテクチャは、効果的かつ効率的なATP産生に必要な空間的な方向性を提供します。ミトコンドリアは、膜間スペースと一緒にマトリックスと、最も内側のミトコンドリアのコンパートメント、家のコンポーネントで区切って二重膜を有し、ATP生成に関与する化学反応を調整する。内膜は、呼吸鎖ならびにATPシンターゼ、ATPの形成のために一緒にADP及びPiのをもたらすタンパク質複合体を含む膜結合タンパク質複合体のシリーズを含んでいる。宿小胞体膜はクリステに折り畳まれ、電子はシトクロム c、膜間空間内での複合体との間で移動する可溶性電子伝達体を介して呼吸鎖複合体に沿って渡される。電子が移動すると、還元当量の酸化が発生し、水素イオンは、膜間空間にマトリックスからポンピングされる。膜間空間内の高イオン濃度の結果として、電気化学的勾配は、ミトコンドリア内膜（Δψ）2を横切る膜電位をもたらす構築する。酸素は、電子伝達鎖の最終的な電子受容体であり、水素イオンがバックマトリックス間腔からATPシンターゼを流れ、そうすることによって、直接ATPの形成を引き起こす。その全体が説明されているように、このプロセスは、酸化的リン酸化として知られている。クリステのひだは、最大電子輸送及び内ATP生産を可能にする、内膜の表面積を増加させる各ミトコンドリア。タンパク質、酵素、および酸化的リン酸化に関与する他の分子は、核およびミトコンドリアの両方の遺伝子に由来する。ミトコンドリアは、自分の環状DNA、13タンパク質のためのコード化だけでなく、ATP産生3のために必要なtRNA及びmRNAを含んでいます。しかし、より多くのタンパク質が必要とされ、従って符号化された核である。これらの核コードタンパク質の大部分は、前駆体タンパク質のN末端 ​​プレ配列を用いることにより、ミトコンドリアマトリックスに標的化され、それらのインポートはΔψ4,5によって部分的に駆動される。 細胞の生体エネルギーに寄与超えて、ミトコンドリアはまた、TCAおよびβ酸化、カルシウムの調節を介して細胞内シグナル伝達、ならびにアポトーシス6において重要な役割のような主要な代謝プロセスに影響を及ぼす。具体的には、細胞ストレスの時代に、上に存在するか、または、BCL-2ファミリータンパク質は、ミトコンドリアを引き起こす可能性がミトコンドリア外膜に対話外膜透過（MOMP）7,8。 MOMP中は、 シトクロム cおよび他のタンパク質が細胞質ゾル中に放出され、一緒にいくつかの細胞質のタンパク質との複合体が、アポトソーム9,10と呼ばれる形成する。アポトソームは、アポトーシスの実行段階中に細胞タンパク質とDNAを切断するために行くカスパーゼを活性化させる。 MOMPが発生するとすぐに、ΔΨが崩壊され、ATP産生が停止。アポトーシスが開始されるように、このように、ミトコンドリアの機能が損なわれ、ΔΨの変化はミトコンドリアおよび細胞の健康12と相関させることができる。アポトーシスは、多くの疾患モデル内のエンドポイントであるが、ΔΨのミトコンドリア機能および変更はまた、疾患の発信および/または進行に関する貴重な情報を得ることができる。例えば、ミトコンドリアの構造的および機能的変化は、神経変性疾患13,14の過程で記録されている。 プロトコルの最初の部分では、ISO彼らのΔΨを保持無傷ミトコンドリアの設置とが記載されている。 HEK-293T細胞は、アポトーシスを誘導するために、異なる濃度の組換えTNF-α、IL1-βおよびIFN-γの組合せに曝露した。それらはしばしば、その受容体6への結合TNF-αとの相互作用によって誘発され得る初代ヒト敗血症サンプル15およびアポトーシスの外因性経路において高いことが報告されているので、これらのサイトカインは、選択された。培養した細胞と比較して、一次組織から機能的ミトコンドリアを単離するために必要な微妙な変化があるため、多くの研究は、動物を使用しているため、そして、プロトコルは、肝臓及び側索硬化症（ALS）マウスモデルを前方の脊髄からミトコンドリアを単離する方法を記載している。 プロトコルの第2の部分は、蛍光プレートリーダーを用いて電位感受性蛍光色素を使用して、ミトコンドリア膜電位摂動をモニターするために開発した。違い細胞状態（不健康対すなわち 、健常）との間の、ミトコンドリア膜電位の損失を引き起こす全てが脱共役剤、呼吸鎖阻害剤複合体の阻害剤およびイオノフォアと併せて単離されたミトコンドリアのΔΨの強度を定量することによって区別される。ミトコンドリア健康な、ミトコンドリア阻害剤で処理するとΔΨの変化が大きいので、ミトコンドリアの応答は、ミトコンドリア（DYS）機能の指標として用いることができる。 むしろ機能のその場評価に比べて単離されたミトコンドリアの使用は、病状または治療が直接細胞小器官16-18への変更を調節することを決定的な証拠を提供しています。培養細胞からミトコンドリアを単離するための文献中に記載された方法があるが、それらは17曖昧であり、および/ ​​または特殊な装置16を利用する。このプロトコルは、具体的に単離方法を記載している一次組織および培養13,14,19,20を含む他の細胞株に容易に適合。多くの単離されたミトコンドリアの研究は再び機器の非常に具体的かつ専門的な部分である、（21文学の多くの論文の代表例である）、このプロトコルではなく、クラーク電極を使用したのと同じミトコンドリアの脱共役剤および阻害剤を利用する。さらに、この伝統的な方法は、低いスループットと高い複雑22,23として制限があり、ミトコンドリアのかなりの量（〜500μgの/反応）が必要です。このプロトコルでは、蛍光膜電位感知プローブTMREは多くの研究所において標準機で蛍光プレートリーダーと一緒に使用される。それはすぐに細胞および単離されたミトコンドリアに入り、低濃度24で使用することができるので、TMRE広くみなされている。複数の反応が迅速にタンデムに設定することができ、バッチは、このプロトコルを使用して分析した。また、反応Sは、単離されたミトコンドリア（〜10μgの/反応）の多くは、少量を必要とする。より少ない材料を必要とすることによって、より小さな組織または細胞培養試料がミトコンドリアの単離のための出発点として利用することができ、より多くの複製または反応をセットアップすることができ、そのようなATPの生産、酸素消費量、またはインポートのような他の単離されたミトコンドリアの実験のために潜在的に十分な材料アッセイが可能である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:137px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1251</td>
			<td>Can use the potassium salt instead.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8304</td>
			<td>Can use the potassium salt instead.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trisma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Dilute down to 100uM as a working stock in ethanol and store at -20C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Valinomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0627</td>
			<td>Make in DMSO and use as a 5uM working stock. Store at -20C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCN</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td align="right">6379</td>
			<td>Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Highly toxic. Made in ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Highly toxic. Made in ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TMRE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8717-25mg</td>
			<td>Dilute 100uM stock with EB immediatley before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td>1x regular (high glucose).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3002101</td>
			<td>Store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-501F</td>
			<td>US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO</td>
			<td>SIgma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Protien Assay Dye (5x)</td>
			<td style="width:137px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:163px;">500-0006</td>
			<td>Any protein assay can substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">BSA</td>
			<td style="width:137px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">BP1600-100</td>
			<td>Make 2mg/mL stock in water for protein assay.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MTT powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2128</td>
			<td>Filter sterlize 5mg/mL stock made in PBS. Store aliquots at -20C; store at 4C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tergitol solution (NP-40)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NP40S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant Human IL-1B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PCH08014</td>
			<td>Once opened store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant Human TNF-alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC3015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IFN-gamma</td>
			<td style="width:137px;">Gibco</td>
			<td>PHC4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Dulbeccos PBS (-/-)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:163px;">D8537</td>
			<td>Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytochrom c ELISA kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DTC0</td>
			<td>Human for HEK-293T cells.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

200 pg / mlでTNF-α、40 / mlのIL1-β、および75 / mlのIFN-γとHEK-293T細胞の処理（* 3）24〜48時間、細胞死の進行量（ 図1Aにつながる）。細胞生存率はMTTアッセイを用いて評価し、一貫〜24時間の処理による細胞生存率の10％減少し、48時間の処理で〜20％の減少があることを実証した。同様な濃度で処理した細胞（100 pg / mlでTNF-α、40 / mlのIL1-β、および75 / mlのIFN-γ）48時間で同様の細胞死の?...

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Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

培養細胞およびマウス組織から単離とミトコンドリアの機能解析

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

isolation-functional-analysis-mitochondria-from-cultured-cells-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

39.2K ビュー.  Elon University. Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress. 

ビデオ: Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

プラセンタから造血幹細胞の単離と解析

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

生物学

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

酵母細胞からミトコンドリアの精製

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

成体マウスから海馬歯状回の解剖

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

マウスおよびヒト結腸組織からの一次筋線維芽細胞の分離

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

組織解離と差動濾過により移植のためにミトコンドリアの迅速な単離および精製

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

ハイスループットマイクロプレート呼吸測定のためのマウスの骨格筋の最小量からミトコンドリアの単離

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, which is regulated in response to cellular demands. The lipid molecule Coenzyme Q (CoQ) is essential in this process by transferring electrons to complex III in the electron transport chain (ETC) through constant oxidation/reduction cycles. Mitochondria status and, ultimately, cellular health can be assessed by measuring ETC oxygen consumption using respirometric assays. These studies are typically performed in established or primary cell lines that have been cultured for several days. In both cases, the respiration parameters obtained may have deviated from normal physiological conditions in&#160;any given organ or tissue.
Additionally, the intrinsic characteristics of cultured single fibers isolated from skeletal muscle impede this type of analysis. This paper presents an updated and detailed protocol for the analysis of respiration in freshly isolated mitochondria from mouse skeletal muscle. We also provide solutions to potential problems that could arise at any step of the process. The method presented here could be applied to compare oxygen consumption rates in diverse transgenic mouse models and study the mitochondrial response to drug treatments or other factors such as aging or sex. This is a feasible method to respond to crucial questions about mitochondrial bioenergetics metabolism and regulation.

Here, we describe a detailed method for mitochondria isolation from mouse skeletal muscle and the subsequent analysis of respiration by Oxygen Consumption Rate (OCR) using microplate-based respirometric assays. This pipeline can be applied to study the effects of multiple environmental or genetic interventions on mitochondrial metabolism.

呼吸法アッセイのためのマウス骨格筋からのミトコンドリアの単離

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

マウス脳実質の動脈内皮の単離と機能解析

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative stress has been suggested as a mechanism resulting in GEC dysfunction in the pathogenesis of some glomerular diseases. Historically the isolation of GECs from in vivo models has been notoriously challenging due to difficulties in isolating pure cultures from glomeruli. GECs have complex growth requirements in vitro and a very limited lifespan. Here, we describe the procedure for isolating and culturing conditionally immortalized GECs with fluorescent mitochondria, enabling the tracking of mitochondrial fission and fusion events. GECs were isolated from the kidneys of a double transgenic mouse expressing the thermolabile SV40 TAg (from the Immortomouse), conditionally promoting proliferation and suppressing cell differentiation, and a photo-convertible fluorescent protein (Dendra2) in all mitochondria (from the photo-activatable mitochondria [PhAMexcised] mouse). The stable cell line generated allows for cell differentiation after inactivation of the immortalizing SV40 TAg gene and photo-activation of a subset of mitochondria causing a switch in fluorescence from green to red. The use of mitoDendra2-GECs allows for live imaging of fluorescent mitochondria&#39;s distribution, fusion, and fission events without staining the cells.

The article describes the method for isolating conditionally immortalized glomerular endothelial cells from the kidneys of transgenic mice expressing the thermolabile simian virus 40 and photo-activatable mitochondria, PhAMexcised. We describe the procedure for glomeruli isolation from whole kidneys using beads, digestion steps, seeding, and culturing of GECs-CD31 positive.

蛍光ミトコンドリアによる条件付き不死化マウス糸球体内皮細胞の単離

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...