This work was funded by grant from the BBSRC (grant number BB/H019685/1 and BB/E527663/1) to the University of Exeter.

（一桁以内、すなわち ）解離定数の近似値の1。決定<ol><li> 表1に詳述液を調製する。 </li><li>利用可能な最高濃度で目的のリガンドの在庫を準備し、この六10倍希釈で。おおよそのK dは 、前のデータから知られている場合には、K dはの上下に少なくとも2濃度を有することを目指しています。 </li><li>定量PCRプレートの8ウェルに分注し、混合物の18μlの。最初のウェルに溶媒の2を添加する。残りの7つの井戸の1つのウェルそれぞれにリガンド希釈系列（ステップ1.2）の各メンバーの2を添加する。 </li><li>プレート上のqPCRシールを配置します。プレートの良好なシールを達成するために、プレートの中央に（特定の試薬の表を参照してください）​​ハンドアプリケータを配置します。片側にシールを下に滑らかで、その後の他の半分に繰り返すプレート。 </li><li>気泡を除去するために2分間500×gでプレートを遠心。 </li><li>は、StepOne定量PCR機器にプレートを置きます。 「融解曲線」オプションを選択し、ROXフィルター、および高速ランプ速度を選択します（これは40分かけて99℃までのランプ、その後、2分休止し、25℃で2分間のポーズを、提供します）。熱変性を実行します。 注：実行を実行するためのスクリプトファイルは、httpからオンラインで入手できます。// <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular。</a> </li><li>楽器の実行の終了時に、画面上の「分析」ボタンをクリックしてください。結果ファイルを保存します。 </li><li>タンパク質の熱シフトソフトウェアを開きます。 <ol><li>新しい研究を作成します。プロパティ]タブで、この名前を付け、[条件]タブにある、細部のリガンド。 </li><li> （実験[ファイル]タブに移動し、保存した結果ファイル（XXX.eds）をインポートし、各ウェルの内容を設定するテンプレートフィルES）は、著者から入手可能である。 </li><li> [分析]タブに移動し、「分析」ボタンを押してください。 注：これは、結果を分析します。これは、[エクスポート]タブを使用してExcelとのさらなる調査のために結果をエクスポートすることが可能である。結果は、タブ描写形式でエクスポートされます。それは、Excelでエクスポートされたファイルを開いて、すぐにExcel形式で保存するのがベストです。 </li></ol></li><li>単独の溶媒の存在下で、タンパク質が、図1Aに示したのと同様の結果が得られることを確認してください。次に、「複製」ペインに結果が観察された融解温度を調べる。これは増加したリガンド濃度の融解温度の明らかな増加を示していることを確認してください。 注：理想的には、これは（タンパク質が完全にリガンド結合していると仮定して）明確な最大融解温度を提供し、溶融温度が、リガンドのないタンパク質との中間にあるおおよその K dになり、最大。 </li></ol>解離定数を決定するための2。実験セットアップ<ol><li>マスターミックスとして表2に詳述した混合物を準備します。 </li><li>最後の実験で10倍に希釈される15の異なる濃度でリガンドの株式を準備します。理想的には、少なくとも二桁推定K dの上および下の濃度を含み、推定K dに濃度をセンタリング。このいずれかの側に別の4点で、推定K dの大きさのオーダー内の点の7に焦点を当てる。選択肢がある場合には、飽和している値で、より多くのポイントがあります。 注：必要であれば、リガンド株は、リガンドの溶解度が制限されている二重の実験濃度であるような実験条件を変更することが可能である。 </li><li>マスターの120μl添加マスターミックスの便利な分配のためのリザーバとして機能するように、U底96ウェルプレートの8ウェルに混合する。 PCRプレートの1列に18μlずつ分注する8チャンネルピペットを使用してください。プレート上6×8のパターンで48満たされた井戸の合計を与えるために、さらに5つの列に対して繰り返します。 </li><li> U底96ウェルプレートのウェルを分離するために、20リガンドの株式μlの、または溶媒を追加します。 8チャンネルピペット、吸引、8つの異なるリガンドストック（または溶剤）を2μlを使用した。ステップ2.3でマスターミックスを充填したPCRプレートの1列にこれらを追加します。さらに2つの列に同じ8リガンド/溶媒ストックを繰り返します。吸引する2残りの8つのリガンドまたは溶媒株式μlの、プレートの4列目にこれらを追加します。さらに2つの列のためにこれを繰り返します。これは、すべての16リガンド、溶媒のサンプルについて3回のサンプルを提供します。 </li><li> （ステップ1.4参照）をプレート上のqPCRシールを置きます。 </li><li> 500×gでプレートを遠心2分。 </li><li>定量PCR機器にプレートを置きます。ステップ1.6に指定されたパラメータを使用して熱変性を実行します。 </li><li>楽器の実行の終了時に、画面上の「分析」ボタンをクリックしてください。結果ファイルを保存します。 </li><li>タンパク質の熱シフトソフトウェアを開きます。新しい研究を作成します。プロパティ]タブで、この名前を付け、[条件]タブにある、細部のリガンド。 </li><li>実験ファイル]タブに移動し、保存した結果ファイル（XXX.eds）をインポートし、各ウェルの内容を設定する。 注：テンプレートファイルは、httpからオンラインで入手できます。// <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular。</a> </li><li> [分析]タブに移動し、「分析」ボタンを押してください。 <ol><li>三連として結果を表示するには、画面の左側にあるメニューから「複製し」タブを選択します。三重はどのようにタイトに基づいてデータの信頼性を評価する。 Shoul三連が悪い再現性を示しているD、密接に生データを調べます。 </li><li>溶融温度を評価するためにボルツマンまたは誘導体法の両方を使用してデータを分析する。 「結果を複製」タブを選択し、 &quot;でプロット：「トグル、「結果プロットを複製」の間のボタン「TM - ボルツマン」と「TM - デリバティブ」。サンプル用の大きな再現性を与える方法を選択します。 [エクスポート]タブを使用してExcelでさらに調査の結果をエクスポートします。 注：複数の遷移を示しているサンプルについては、複数の溶融モードでのデリバティブメソッドを使用するほとんど常に最善の方法です。結果は、タブ描写形式でエクスポートされます。それは、Excelでエクスポートされたファイルを開いて、すぐにExcel形式で保存するのがベストです。 </li><li>結果の再現性を確保するために、独立した日には、リピートを含め少なくとも2回の実験を繰り返します。データ分析（下記のステップ3を参照）はずK dの値が、元の推定値に有意差があることを示し、K dは周囲の値の良好な範囲を確保するために（ステップ2.2参照）に応じてリガンド濃度を変化させる。 </li></ol>熱変性の下での解離定数を決定するために、3。データ解析<ol><li>リガンド濃度のExcelで表と溶融温度を作成します。 </li><li>グラフパッドプリズムソフトウェアを開き、XYテーブルを作成します。リガンド濃度および温度の結果を溶融させるためのY列のX列を使用して、データを入力します。 注：示されている例が図1Bである。プリロード方程式、およびSPSS統計パッケージを使用するための代替指示にスクリプトは、HTTPでオンラインで入手できます：// <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular。</a> </li><li> [分析]タブでは、分析パラメータを変更するオプションを選択秒（Ctrl + Tキー）。 、正しいモデルを入力し、「新規作成」を選択し、「新たな方程式を作成」します。 「単一部位結合リガンド」として表3に詳述され、式を挿入します。 注：これらの手順の例を図1Cに示されている。プリロード式でスクリプトを使用する場合は、関連する方程式は、リストから選択ではなく、入力に向けることができる。この式の導出は付録に記載されている。 </li><li>ボックスの「初期値の規則」を選択し、 表3に詳述されるように、初期値のための規則を入力します。 </li><li> （リガンド内の指定されたのと同じ単位）とタ​​ンパク質の最終濃度を入力する」に等し​​い定数」として、パラメータPを拘束。 </li><li>分析を実行するために[OK]を選択します。 注：これらの手順の例を図1Dに示されている。グラフ作成ソフトウェアは、データとモデルへの適合を示す図を生成します。 Tの例ヘセ分析は代表的なデータに示されている。 </li></ol>協同組合モデルへのデータのフィッティング4。 協力的なモデルにデータを適合させるために、単純な協力モデル、または2の別個の解離定数が定義されているモデルのいずれかを選択。最初のアプローチは、負の協同の場合において好ましい、または最初の調査などされている。しかし、原理的には、二つの異なる解離定数18をモデル化するために正の協同例に優れています。この場合、モデリングは、リガンドの結合、順次、またはリガンドの結合に依存しないのいずれかを仮定して進めることができる。 <ol><li>ステップ3.3で、しかし、プロトコル3と同様の初期ステップに従って、「シンプル協力モデル」と記載されている表3の方程式の1、「二つの配位子の逐次結合&quot;を挿入、または18&quot;独立の2つのリガンドの結合」。 </li><li>初期値に関連するルールを選択します表3にこれらの式のそれぞれに関連する。 </li><li>データへのモデルの適合を調べます。データが不十分適合する必要があり、別のモデルを考える。 注：それは慎重にプロテインサーマルシフトソフトウェア（ステップ2.9）することで、データへの溶融温度のフィッティングを検討することも重要です。時にはそれが最良の結果を得るために、ここでパラメータを変更する必要がある。 K dのいずれかの側でのデータの限定されたセット、または（特に最高のリガンド濃度での）単一の異常な点のいずれか、大幅に影響を与えることができる：別の考慮事項は、データ点の範囲が理想的であり、いずれの異常な点が存在するかどうかどうかである結果。 </li><li>再現性を確実にするために（ステップ2.12参照）を少なくとも二回の実験を繰り返します。 </li></ol>融解温度のバイナリシフトを表示曲線にデータ近似5。 時折、むしろリガンドへの段階的な応答よりも、タンパク質がされている結合した試料は明らかに結合していない試料から分離されているバイナリの応答を、採用することが観察された。例は代表的な結果（ 図4）が設けられている。この場合には、融解温度のフィッティングはK dのための良好なフィット感を提供することはありません。 <ol><li>タンパク質の熱シフトソフトウェアからの生のデータ出力をエクスポートします。各温度点については、ゼロリガンドに対する平均蛍光、最高リガンド濃度を計算します。これらの隣に各データ点の結果を集計。 注：ここで作成したエラーは、フィットの融解温度の誤差よりも小さい。 </li><li> SPSS統計パッケージを開きます。 SPSSのデータウィンドウに各実験のための温度、2平均値のデータセット、およびデータをコピーします。変数]タブで、「低」、「高」が最も高いリガンド濃度の平均データセットとして無リガンドの平均データセットを設定します。 </li><li>使用可能な構文ファイルをダウンロードオンラインでは、http：// <a href="http://www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular">www.exeter.ac.uk/biosciences/capsular</a> 。 「ファイル名を指定して実行]→[実行]のすべて」を選択してください。 </li><li>関連するリガンド濃度で、新しいExcelワークブックに結果をバインド割合をコピーします。 </li><li>グラフパッドソフトウェアを開き、XYテーブルを作成します。リガンド濃度および温度の結果を溶融させるためのY列のX列を使用して、データを入力します。分析]タブで、「変化分析パラメータ」を選択します。 、正しいモデルを入力し、「新規作成」を選択し、「新たな方程式を作成」します。 「融解温度のバイナリシフトの分析」としてリストされ、表3に示した式を入力します。 </li><li> 「初期値の規則」ボックスをオンにして、 表3に詳述された初期値のための規則を入力します。」に等しい定数」として、パラメータPを拘束し、リーガと同じ単位で（タンパク質の最終濃度を入力してくださいnd）がで与えられている。 注：セクション3のプロトコルのためのこれらのボックスを完了する例が図1C、Dに示されている。 </li><li>良好な適合がある場合、結果は、無限のリガンド濃度での期待される結果を外挿することにより改善することができる。各リガンド濃度で結合の割合のモデルから、リガンド濃度の最高値の値を調べます。これが0.99以上であれば、さらなる分析が結果を改善しにくい。 </li><li>比率が0.99未満である場合、追加のステップが、最も高いリガンド濃度試料中の非結合タンパク質の影響を補正する必要がある。ステップ5.2では、セルR2（異なるセルを使用してもよく、R2は、 表3の式で適宜置換さ）にする（ステップ5.7からの）は、最も高いリガンド濃度の点で結合したリガンドの割合を書き込む。最高リガンド濃度結果の平均の後に余分な列を作成します。モミでT細胞は、「無限のリガンド濃度を外挿」として表3に示す式をコピーする。この列の残りのセルにこの数式をコピーします。 注：この計算は、最も高いリガンド濃度で非結合タンパク質の影響を除去します。リガンド遊離タンパク質と最も高いリガンド濃度との差を各温度点での完全結合および非結合タンパク質状態間の予想される差異を提供するために、最も高いリガンド濃度での結合した割合の逆数を乗算する。この差は、完全に、リガンド結合タンパク質の予想される蛍光を与えるために結合していない状態から加算または減算する。 </li><li>この新しい列を持つSPSSのデータシートに最大リガンド濃度の列を交換し、データフィッティングを繰り返します。 注： - モデルは、最大リガンドconcentratiで結合割合のさらなる有意な変化を示唆している場合は、5.9を繰り返すことが必要になる場合があり5.7は、手順上（この場合であれば、それはおそらく含ま高いリガンド濃度ポイントと実験を繰り返すことが理想的である）。 </li><li>タンパク質は、バイナリシフトして表示協同挙動を示している場合では、方程式は、ステップ4.1からのもので置換されていなければならないステップ5.5で提案されている。 「トップ」と「ボトム」のパラメータは、それぞれ1と0に置き換える必要がある。 </li><li>再現性を確実にするために（ステップ2.12参照）を少なくとも二回の実験を繰り返します。 </li></ol></li></ol>

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The authors declare that they have nothing to disclose.

示差走査蛍光定量は、タンパク質を特徴付ける、および潜在的なタンパク質リガンドを同定するための堅牢で汎用性の高い方法として、その力を実証してきました。 （特にあまり資金を研究室で）タンパク質の安定化、薬物の発見を促進し、結晶化10,23-25 ​​において十分に実証の成功は、それ化合物の初期スクリーニングのための魅力的な方法作った。タンパク質に付加する化合物は、見かけ上の溶融温度7,9の明確な用量依存性の増加を示す。しかし、それらの親和性について化合物をランク付けするのを助けるために見かけの結合定数を決定するために、これらの実験からの結果を使用するいくつかの試みがなされてきた。ここでは、体系的リガンドの存在下でのタンパク質の見かけの解離定数を決定するための方法を提示する。 ここに示す結果は、DSFを迅速かつ確実にするための解離定数の推定値を提供できることを実証タンパク質 - リガンドの組み合わせ。観測データは、パラメータの可能性が高い値に関する仮定をする必要なしに、K dの迅速な決定を提供するために、市販のツールを使って操作することができます。この方法は、必要なタンパク質と時間の両方での倹約であることのいくつかの同等の方法に比べて大きな利点があります。ここに記載した実験は、実験当たりタンパク質0.13ミリグラム（三連で繰り返し実験では約0.4 mg）を消費します。これは平均的な40kDaのタンパク質と単一の実験は、同様の量を消費する等温滴定熱量測定（ITC）、と好意的に比較します。このプロトコルのために必要な実験のフルセットは、実験の単一のセットのための準備、など約4時間、消費する。再び、これは、強力ながら、多くの場合、最良のデータを得るために、かなりの最適化が必要ITCまたは表面プラズモン共鳴などの方法よりもかなり迅速である可能性が高い。 本発明者らの結果は慎重に生データを検討する必要性が残っていることを示している、これらのデータのフィットは、融解温度を決定するために、溶融温度データの適合は、解離定数を決定する。最初の課題は、タンパク質の溶解で製造した生データの形である。いくつかのケースでは、形状は、 図1Aで観察されるものに近似しなくてもよい。一般的な問題は、リガンド結合上の低温度変化、高いバックグラウンド蛍光、および温度の異常な複数の遷移が含まれています。低温シフトは、リガンドの数を結合に見られる。この方法では、最も重要なパラメータは、温度シフトに比べて、T mの測定における誤差である。 3回の測定の標準偏差が結合していないと完全に結合したタンパク質との間の融解温度シフトの10％を超えていない場合に、データは、通常、合理的に取り付けることができる。私たちの経験は、どこにそのような気温ということですeratureシフトはわずか2℃での個別のデータポイントが非常に正確である場合、これは、データをフィッティングするために十分であり得る。第二の問題は、非常に曲線形状となっている。リガンド結合は、タンパク質のモードを展開影響を与えるように、これらは多くの場合、無料の蛋白質とリガンド結合形態の間で異なる。これらのケースでは、ユーザは、データが融解温度および解離定数を決定するために使用されるモデルの適切な考慮して使用できるかどうかを考慮しなければならない。もう1つの一般的な問題は、タンパク質の補因子の添加（ 例えば、ヘキソキナーゼとの例でのMgCl 2）が最も信頼性の高いデータを得るために必要とされることである。私たちの経験は、最初の読み取りを行う段階で、実験中のすべての可能性が高い要因を慎重に検討が最良の結果を得るために不可欠であることとなっている。さらに、代替理論的治療法は、これらのデータ15,17の特徴を明らかにすることができます。最後に、Cいくつかのタンパク質は珍しいことではありませんontainネイティブ高いバックグラウンド蛍光を示すために疎水性領域を露出した。広範囲に他の場所で6,9概説されているこれらの問題に対する解決策がいくつかあります。 具体的には、ユーザは、（ 例えば、 図4）、及びその誘導体を使用する場合には、複数の溶融物をモデル化する必要があるかどうかボルツマンまたは派生モデルを使用するかどうかを考慮しなければならない。熱変性をモデル化する方法は2ボルツマン法がアンフォールディング曲線への定期的なS字状の形状を仮定して、ボルツマン方程式に実験データをフィットするという点で異なる。対照的に、誘導体方法は、各点（ 図1Aの下のパネル）での実験データの一次導関数をとり、最も高い一次導関数の点と融解温度を考慮する。 3℃ - 派生方法は、一般的に約2だけ高い溶融温度を返します。ほとんどのタンパク質は、より一貫性のある戻りますその結果、二つの方法のいずれか（ すなわち、三連の実験のために溶融温度の標準誤差は低くなる）。これは通常、タンパク質のアンフォールディング曲線の正確な形状に密接に関連し、それは経験的にそれぞれの場合に最適な方法を決定する必要がある。誘導体モデルが使用される場合、それは、複数の融解事象を考慮することも重要である。いくつかのデータは明らかに、複数の遷移の証拠を示し、これらの場合の結果は、これらの複数の融解イベントがモデル化される場合に解釈することが容易である可能性が高い。このプロトコルのコンテキストでは、リガンドの添加、またはその逆 （最も熱的に脆弱なサブドメインを安定化させることにより、 例えば、）単一の遷移に複数の融解転移を有することからシフトするタンパク質を引き起こすことがよくある。そこで、生データを使用するのがベストであろうどのアプローチ検討する前に一緒に検討されていることを提唱したい。 メートルに続いて個別の融解温度のodellingは、更なる問題は、プロトコルセクションに表示モデルにこれらのフィッティングに発生する可能性があります。なお、この分析はしばしば観察されたデータとモデル間の相違を強調したよう慎重に、対数目盛を用いて解離定数方程式に当てはめを調べるために不可欠である（電子.G。 図 3）。得られた結果は、一般的に強固である一方で、解釈のケアはデータから、より良い結果を抽出する機会、そして最も意味を提供しています。 これらのデータが提起した特定の問題は、DSFで、協同性を示し、タンパク質、または複数の結合イベントに配置する必要があります解釈である。私たちは、これまでに、唯一の複数の特定の結合事象（ 例えば、WcbM、その最高の相同体26の多量体であり、サイズ排除クロマトグラフィー上の多量体として作用する[データではないタンパク質を有することが期待されるタンパク質においてこの現象を観察している示さ]）。むしろ、これはメソッドの広い範囲を使用して、より徹底的に調査されなければならない複雑な結合を示している可能性がありますそれは、DSFの変性で観察された負の協同が酵素で、最終的には負の協同が表示されることを示していることは全く明らかではない。これはそのようなタンパク質のより広範な研究が面白い効果を特定する可能性があること、しかし、私たちに示唆していない。 この方法を用いて解離定数のために与えられた値は、一般に、等温滴定熱量測定及び表面プラズモン共鳴などの他の方法によって提供されるものと同じオーダーである。しかし、観察された絶対値は、これらの方法を使用して観察されるものより頻繁に高い。これは、少なくとも部分的に解離定数は、リガンドとタンパク質の融解温度で観察されるという事実の結果である。このK dは 、生理的温度でのものよりも一般に高い。 dissociationは定数式により反応の温度に関連している： <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq1.jpg" /> [1] <img alt="式2" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq2.jpg" /> [2] （Cθは 、標準的な基準濃度であり、ΔはGは反応のギブスの自由エネルギー変化であるR、Rはモル気体定数、ΔHは反応におけるエンタルピー変化であり、ΔSは反応におけるエントロピー変化である。） この方法の測定可能範囲内の解離定数との反応は、一般に負のΔrは Gを持ち、従って式に温度上昇の影響は、[1]の解離定数を増加させるであろう。どちらのギブスの自由エネルギーを構成ΔH、ΔSの用語は、（式​​[2]）temperaturですE従属27、および解離定数への影響は、これらの温度依存性の大きさと符号に依存し、必ずしも相互作用依存することになる。したがって、この方法によって決定解離定数は、時にはRTで動作する方法によって決定されたものよりも大きいことは予想外ではない。温度依存性はまた、もちろん、生理的温度より低い温度で解離定数を提供する傾向がある多くの他の方法、の警告である。 それはITCとは異なり、ラベルされた方法であることをDSF方法の他の注意点はある。 （SYPROオレンジ）を使用する蛍光標識は、疎水性であるので、場合によってはタンパク質に疎水性リガンドの結合と競合することができる。したがって、いくつかの場合において、得られた解離定数は、人為的に起因するラベルとの競争に昇温される可能性がある。しかし、多様なリガンドの比較、（の主な用途のためにDSF）、差異は、親和性による化合物のランキングに影響を与えるために十分に有意である可能性は低い。 この方法の潜在的な欠点を達成することができる検出限界である。原理的には、正確にタンパク質濃度の50％未満であり、この範囲内の偶数値が疑わしい精度であると思われるK dの値を測定することが可能であってはならない。範囲のこの端部における検出限界は、タンパク質と色素の濃度を低減することによって少し延長することができる一方で、機器の感度は、タンパク質濃度のさらなる低下を防止する。同様に、感度の上端は、リガンドの溶解性によって決定される。 K dの数学的にロバスト推定を得るためには、近似であるとリガンド濃度を必要とするリガンド結合形態中に存在するタンパク質の90％を使用してデータを取得するために最も重要であるLY十倍の K d（協同がないと仮定して）。検出限界は、したがって必然的に、関連するバッファ内のリガンドの溶解性の十分の一になります。これは方法の検出限界は、典型的には、タンパク質とリガンドに応じて、1μMmMの間、および1〜100の範囲であることを意味する。 結論として、示差走査型蛍光定量は、広範囲のタンパク質に適用可能で多目的な技術である。ここに提示される方法を使用して、迅速かつ安価に異なるリガンドに対するタンパク質の親和性を決定することが可能である。これは、特に小さな実験室で、タンパク質精製および安定化の応用、メタゲノムからの酵素の機能または特異性を解明するための大きな可能性を有しており、創薬における。

全てのタンパク質は、他の巨大分子への単純なイオンから他の分子の多様な範囲に、変動する親和性で、結合するであろう。多くの場合、タンパク質は、それらの通常の機能（ 例えば、ATPに結合するキナーゼ）の一部として低分子パートナーに結合する。他の相互作用は、機能とは無関係であるが、ツール（ 例えば、結晶化の成功を向上させる、または溶液中のタンパク質を維持するのを助けるためにタンパク質を安定化する小分子）として実験的に有用であり得る;活性部位及びタンパク質のアロステリック部位に結合する小分子阻害剤として作用し、したがって酵素の活性を調節することができる一方。 パートナー分子のためのタンパク質の親和性を決定するために使用することができる技術の広い範囲がある。等温滴定熱量計1は、反応に豊富な情報を提供するように広くラベルフリーであり、「ゴールドスタンダード」とみなされる、との機会が限られている実験のrtifacts。しかし、実験設備の計装や自動化の感度の最近の改善にもかかわらず、それは、タンパク質の要件の面ではまだ比較的高価であり、せいぜい低〜中スループットを持ち、中程度からとの相互作用に最適です高親和性（100μMのK dに 10 nM）の2。このような表面プラズモン共鳴または二重層干渉3オファーより高いスループット、および感度を達成しているような他のラベルフリーの方法は、100ダルトンと低い小さな分子を検出する。しかし、これらの方法のためのハイスループット機器は比較的高価であり、関連するプロジェクトの継続的なスループットがあるだろう場所でのみ正当化され、非常に多くの大学の研究室へのアクセス不能である可能性が高いされている。 示差走査蛍光定量（DSF、またはthermofluor）は、第一の薬剤発見のための方法として、2001年4に記載した。このメトでdは、タンパク質は、タンパク質の疎水性領域に結合すると、その蛍光を変化させる蛍光色素（最初はナフタレンスルホン染料を使用した）と共にインキュベートする。タンパク質 - 色素次いで、試料を加熱し、熱が上昇すると蛍光をモニターした。タンパク質のアンフォールディングおよびタンパク質の疎水性部分の曝露、温度（ 図1A）の関数としての蛍光の特徴的なパターンを生じさせる。実験は、商業定量的PCR装置で、少量で行うことができ、したがって単一の実験で、多数のサンプルを同時に（装置モデルに応じて、通常、48、96または384サンプル）を試験することができる。実験は通常、試料5のハイスループット解析の可能性を提供し、時間の周りで行うことができる。 方法論へのさらなる改良は、より良いスペクトル特性6,7と色素の採用を見てきました</データ分析のための一般的なツールは、&gt; SUPや初期スクリーニング8,9のためのプロトコルを提案した。この方法の応用範囲は、蛋白質10の調製および保存のために、結晶11を支援するために潜在的な結合パートナーを同定することに最適な条件を確立することに特に焦点を当て、拡張されました。弱い結合分子を研究する方法が比較的高いスループット、タンパク質中の比較的低コスト（反応あたり〜2μg）を、そして適用性は、特に学術的文脈12-14に、DSFのフラグメントベースの薬物設計のための貴重なツールを作っています。 タンパク質 - リガンド相互作用を研究するDSFの幅広いアプリケーションにもかかわらず、いくつかの研究では、これらの研究からの解離定数の決定を記載している。しかし、これらは、疎データまたはいくつかの場合（e）で取り付けられなければならない多くのパラメータと、タンパク質のアンフォールディングを記述する詳細な方程式を生成する傾向が7,15-17を stimated。これらの方法は、異常な遷移を表示きつく結合化合物、またはタンパク質のような、困難なケースで特に関連するものである。しかし、多くの研究室では、これらの詳細な分析は、日常的な使用のためにあまりにも扱いにくい。そこで、異なるシナリオのための代替治療法を提案し、これらは、異なるタンパク質 - リガンド相互作用から得られるデータを適合させるために使用することができる方法を示す。提案手法では、オーダーメイドのデータ解析ソフトウェアが提供されているは、StepOne定量PCR機器を使用しています。これは、データ分析を高速化しながら、他の機器からの結果は、以前に公表された方法9を使用して処理することができ、同じ下流の分析を行うことができる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">StepOne real time PCR instrument</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4376357</td>
			<td style="width:167px;">DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis.</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Protein thermal shift software v1.0</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4466037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">MicroAmp Fast optical 48-well plates&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4375816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">Optical sealing tape&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4375323</td>
			<td>Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">U-bottomed 96-well plates</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td align="right">11521943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">SYPRO Orange</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S6650</td>
			<td>For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SPSS statistics version 20</td>
			<td style="width:71px;">IBM</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Other statistics packages will provide similar functionality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GraphPad Prism 6.02</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Other statistics packages will provide similar functionality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hand applicator (PA1)</td>
			<td style="width:71px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">75-3454-4264-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:71px;">Fisher scientific</td>
			<td align="right">10141520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry

広範囲の方法は、現在、タンパク質との解離定数を決定し、小分子の相互作用に利用可能である。しかし、これらのほとんどは、専門機器へのアクセスを必要とし、しばしば効果的に信頼性の高い実験を確立し、データを分析するための専門知識の程度を必要とする。示差走査蛍光光度（DSF）は、ますます生理パートナーを同定するため、またはヒット発見のためのいずれか、小分子相互作用のためのタンパク質の初期スクリーニングのためのロバストな方法として使用されている。この技術は、定量的PCRに適した唯一のPCRマシンを必要とし、従って適切な器具類は、ほとんどの施設で利用可能であるという利点を有する。プロトコルの優れた範囲がすでに利用可能である;および方法の複数の用途のための文学に強い先例があります。過去の研究は、DSFデータから解離定数を計算するが、これらは数学的に求めているのいくつかの手段を提案している。ここでは、DEMonstrate DSF実験データの中程度の量から解離定数を推定する方法。これらのデータは、典型的には、一日以内に収集し、分析することができる。私たちは、単純な結合事象から収集されたデータを適合させるために使用できる方法の異なるモデルを実証し、ここで、協同的結合、または独立した結合部位が存在する。最後に、標準モデルが適用されない場合には、データ分析の一例を提示する。これらの方法は、研究プログラムから商業的に入手可能な対照タンパク質に収集されたデータ、および2つのタンパク質と示されている。全体的に、私たちの方法は、研究者が急速にDSFを用いたタンパク質 - リガンド相互作用へのさらなる洞察を得るするための簡単​​な方法を提供します。

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Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

示差走査蛍光光度を用いたタンパク質 - リガンド相互作用の定量

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

determination-protein-ligand-interactions-using-differential-scanning

Research

JoVE Journal

Biology

61.3K ビュー.  University of Exeter. Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

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Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by Zernike, in 1942, who received the Nobel prize for his achievement. DIC microscopy, introduced in the late 1960s, has been popular in biomedical research because it highlights edges of specimen structural detail, provides high-resolution optical sections of thick specimens including tissue cells, eggs, and embryos and does not suffer from the  phase halos  typical of phase-contrast images. This protocol highlights the principles and practical applications of these microscopy techniques.

Phase Contrast and Differential Interference Contrast DIC Microscopy

This protocol highlights the principles and practical applications of Phase and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

位相コントラストおよび微分干渉コントラスト（DIC）顕微鏡

Phase-contrast microscopy is often used to produce contrast for transparent, non light-absorbing, biological specimens. The technique was discovered by ...

生物学

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

光度計2000C分光光度計を使った微量タンパク質の濃度測定

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

脂質中間相を用いた構造決定のための膜タンパク質の結晶化

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

でアニマルキャップの移植（ACT）アッセイを用いて組織の決定アフリカツメガエル</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

使用シュワン-アストロサイト相互作用の解析インビトロアッセイ

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

EMBLでMultiBacタンパク質複合体生産プラットフォーム

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

化学的に媒介種間相互作用を検出するための共培養を使用して

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

膜タンパク質のリアルタイム測定：受容体相互作用は、表面プラズモン共鳴を使用した（SPR）

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

密度勾配遠心法を用いた差動品質の精液採取

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, sequester or eliminate damaged proteins to maintain a healthy proteome, thus ensuring cellular proteostasis and preventing further protein damage. Because of redundant functions within the proteostasis network, screening for detectable phenotypes using knockdown or mutations in chaperone-encoding genes in the multicellular organism Caenorhabditis elegans results in the detection of minor or no phenotypes in most cases. We have developed a targeted screening strategy to identify chaperones required for a specific function and thus bridge the gap between phenotype and function. Specifically, we monitor novel chaperone interactions using RNAi synthetic interaction screens, knocking-down chaperone expression, one chaperone at a time, in animals carrying a mutation in a chaperone-encoding gene or over-expressing a chaperone of interest. By disrupting two chaperones that individually present no gross phenotype, we can identify chaperones that aggravate or expose a specific phenotype when both perturbed. We demonstrate that this approach can identify specific sets of chaperones that function together to modulate the folding of a protein or protein complexes associated with a given phenotype.

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

To study chaperone-chaperone and chaperone-substrate interactions, we perform synthetic interaction screens in Caenorhabditis elegans using RNA interference in combination with mild mutations or over-expression of chaperones and monitor tissue-specific protein dysfunction at the organismal level.

カエノハブディティス・エレガンスを使用して組織特異的シャペロン相互作用をスクリーニングする

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...