This work was funded by grant from the BBSRC (grant number BB/H019685/1 and BB/E527663/1) to the University of Exeter.

<ol>
	<li>Freyer, M. W., Lewis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isothermal+titration+calorimetry:+experimental+design,+data+analysis,+and+probing+macromolecule/ligand+binding+and+kinetic+interactions.">Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions.</a> Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).</li><li>Ladbury, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calorimetry+as+a+tool+for+understanding+biomolecular+interactions+and+an+aid+to+drug+design.">Calorimetry as a tool for understanding biomolecular interactions and an aid to drug design.</a> Biochem Soc Trans. 38, 888-893 (2010).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor,+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet.</a> Anal Biochem. 377, 209-217 (2008).</li><li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery.">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> J Biomol Screen. 6, 429-440 (2001).</li><li>Senisterra, G., Chau, I., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+denaturation+assays+in+chemical+biology.">Thermal denaturation assays in chemical biology.</a> Assay Drug Dev Technol. 10, 128-136 (2012).</li><li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., Detitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies.">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Anal Biochem. 357, 289-298 (2006).</li><li>Lo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorescence-based+thermal+shift+assays+for+hit+identification+in+drug+discovery.">Evaluation of fluorescence-based thermal shift assays for hit identification in drug discovery.</a> Anal Biochem. 332, 153-159 (2004).</li><li>Nettleship, J. E., Brown, J., Groves, M. R., Geerlof, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+protein+characterization+by+mass+spectrometry,+thermal+shift+(ThermoFluor)+assay,+and+multiangle+or+static+light+scattering.">Methods for protein characterization by mass spectrometry, thermal shift (ThermoFluor) assay, and multiangle or static light scattering.</a> Methods Mol Biol. 426, 299-318 (2008).</li><li>Niesen, F. H., Berglund, H., Vedadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+detect+ligand+interactions+that+promote+protein+stability.">The use of differential scanning fluorimetry to detect ligand interactions that promote protein stability.</a> Nat Protoc. 2, 2212-2221 (2007).</li><li>Geders, T. W., Gustafson, K., Finzel, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+differential+scanning+fluorimetry+to+optimize+the+purification+and+crystallization+of+PLP-dependent+enzymes.">Use of differential scanning fluorimetry to optimize the purification and crystallization of PLP-dependent enzymes.</a> Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 68, 596-600 (2012).</li><li>Vedadi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+screening+methods+to+identify+ligands+that+promote+protein+stability,+protein+crystallization,+and+structure+determination.">Chemical screening methods to identify ligands that promote protein stability, protein crystallization, and structure determination.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 15835-15840 (2006).</li><li>Davis, B. J., Erlanson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Learning+from+our+mistakes:+the+'unknown+knowns'+in+fragment+screening.">Learning from our mistakes: the 'unknown knowns' in fragment screening.</a> Bioorg Med Chem Lett. 23, 2844-2852 (2013).</li><li>Larsson, A., Jansson, A., Aberg, A., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+hit+generation+and+structural+characterization+in+fragment-based+ligand+discovery.">Efficiency of hit generation and structural characterization in fragment-based ligand discovery.</a> Curr Opin Chem Biol. 15, 482-488 (2011).</li><li>Scott, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+fragment-based+approach+to+target+protein-protein+interactions.">Using a fragment-based approach to target protein-protein interactions.</a> Chembiochem. 14, 332-342 (2013).</li><li>Cimmperman, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+model+of+thermal+stabilization+and+destabilization+of+proteins+by+ligands.">A quantitative model of thermal stabilization and destabilization of proteins by ligands.</a> Biophys. J. 95, 3222-3231 (2008).</li><li>Matulis, D., Kranz, J. K., Salemme, F. R., Todd, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+stability+of+carbonic+anhydrase:+measurements+of+binding+affinity+and+stoichiometry+using+ThermoFluor.">Thermodynamic stability of carbonic anhydrase: measurements of binding affinity and stoichiometry using ThermoFluor.</a> Biochemistry. 44, 5258-5266 (2005).</li><li>Zubriene, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+nanomolar+dissociation+constants+by+titration+calorimetry+and+thermal+shift+assay+-+radicicol+binding+to+Hsp90+and+ethoxzolamide+binding+to+CAII.">Measurement of nanomolar dissociation constants by titration calorimetry and thermal shift assay - radicicol binding to Hsp90 and ethoxzolamide binding to CAII.</a> Int J Mol Sci. 10, 2662-2680 (2009).</li><li>Weiss, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hill+equation+revisited:+uses+and+misuses.">The Hill equation revisited: uses and misuses.</a> FASEB J. 11, 835-841 (1997).</li><li>Cuccui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+Burkholderia+pseudomallei+K96243+capsular+polysaccharide+I+coding+region.">Characterization of the Burkholderia pseudomallei K96243 capsular polysaccharide I coding region.</a> Infect Immun. 80, 1209-1221 (2012).</li><li>DeShazer, D., Waag, D. M., Fritz, D. L., Woods, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+Burkholderia+mallei+polysaccharide+gene+cluster+by+subtractive+hybridization+and+demonstration+that+the+encoded+capsule+is+an+essential+virulence+determinant.">Identification of a Burkholderia mallei polysaccharide gene cluster by subtractive hybridization and demonstration that the encoded capsule is an essential virulence determinant.</a> Microb Pathog. 30, 253-269 (2001).</li><li>Berman, H., Henrick, K., Nakamura, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Announcing+the+worldwide+Protein+Data+Bank.">Announcing the worldwide Protein Data Bank.</a> Nat Struct Biol. 10, 980 (2003).</li><li>Vivoli, M., Ayres, E., Beaumont, E., Isupov, M., Harmer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+WcbI,+a+novel+polysaccharide+biosynthesis+enzyme.">Structural insights into WcbI, a novel polysaccharide biosynthesis enzyme.</a> IUCr Journal. 1 (1), 28-38 (2014).</li><li>Sorrell, F. J., Greenwood, G. K., Birchall, K., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+differential+scanning+fluorimetry+based+high+throughput+screening+assay+for+the+discovery+of+affinity+binders+against+an+anthrax+protein.">Development of a differential scanning fluorimetry based high throughput screening assay for the discovery of affinity binders against an anthrax protein.</a> J Pharm Biomed Anal. 52, 802-808 (2010).</li><li>Uniewicz, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+fluorimetry+measurement+of+protein+stability+changes+upon+binding+to+glycosaminoglycans:+a+screening+test+for+binding+specificity.">Differential scanning fluorimetry measurement of protein stability changes upon binding to glycosaminoglycans: a screening test for binding specificity.</a> Anal Chem. 82, 3796-3802 (2010).</li><li>Wan, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+fluorimetry+as+secondary+screening+platform+for+small+molecule+inhibitors+of+Bcl-XL.">Differential scanning fluorimetry as secondary screening platform for small molecule inhibitors of Bcl-XL.</a> Cell Cycle. 8, 3943-3952 (2009).</li><li>Koropatkin, N. M., Holden, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+structure+of+alpha-D-glucose-1-phosphate+cytidylyltransferase+from+Salmonella+typhi.">Molecular structure of alpha-D-glucose-1-phosphate cytidylyltransferase from Salmonella typhi.</a> J Biol Chem. 279, 44023-44029 (2004).</li><li>Paleskava, A., Konevega, A. L., Rodnina, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics+of+the+GTP-GDP-operated+conformational+switch+of+selenocysteine-specific+translation+factor+SelB.">Thermodynamics of the GTP-GDP-operated conformational switch of selenocysteine-specific translation factor SelB.</a> J Biol Chem. 287, 27906-27912 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have nothing to disclose.

وقد أثبت المسح التفاضلي fluorimetry قوتها كوسيلة قوية وتنوعا لوصف البروتينات، وتحديد البروتين بروابط المحتملة. جعلت من وسيلة جذابة لفرز أولي من المركبات النجاحات موثقة جيدا في التعجيل استقرار البروتين، واكتشاف الأدوية (خصوصا في المختبرات أقل ممولة جيدا) وتبلور 10،23-25. مركبات تضاف إلى البروتينات تظهر جرعة زيادة واضحة تعتمد في الظاهر درجة حرارة انصهار 7،9. ومع ذلك، كانت هناك بعض المحاولات لاستخدام نتائج هذه التجارب لتحديد ثوابت ملزمة واضحة للمساعدة في ترتيب المركبات للتقارب بهم. هنا، نقدم طريقة لتحديد منهجية ثابتة والتفكك الظاهر للبروتينات في وجود يجند. توضح النتائج المعروضة هنا أن مهرجان دبي للتسوق يمكن أن بسرعة وبقوة تقديم تقديرات ثابت التفكك لمزيج من البروتين يجند. يمكن التلاعب البيانات لاحظ مع الأدوات المتاحة تجاريا لتقديم تقرير سريع للK د، دون الحاجة إلى وضع افتراضات بشأن القيمة المحتملة من المعلمات. طريقة ديه ميزة كبيرة على بعض أساليب مماثلة من كونه شديد البخل في كل من البروتين والوقت المطلوب. فإن التجربة الموصوفة هنا تستهلك 0.13 ملغ من البروتين لكل تجربة (تقريبا 0.4 ملغم للتجارب المتكررة في ثلاث نسخ). هذا يقارن ايجابيا مع الكالوري المعايرة متساوي الحرارة (ITC)، حيث تجربة واحدة بمتوسط ​​40 كيلو دالتون البروتين سوف تستهلك كمية مماثلة. ان مجموعة كاملة من التجارب المطلوبة لهذا البروتوكول تستهلك حوالي 4 ساعة، بما في ذلك إعداد، لمجموعة واحدة من التجارب. مرة أخرى، هذا من المرجح أن يكون أسرع بكثير من الطرق مثل ITC أو مأكل سطح الرنين، والتي غالبا ما تتطلب قوة في حين الأمثل كبيرا لتحقيق أفضل البيانات. وتظهر نتائجنا أنه ما زال هناك شرط أن تدرس بعناية البيانات الخام، وتناسب هذه البيانات لتحديد درجة حرارة انصهار، ونوبة من البيانات لتحديد درجة حرارة انصهار ثابت التفكك. والتحدي الأول هو شكل من البيانات الخام المنتجة في ذوبان البروتين. في بعض الحالات، قد لا الشكل التقريبي لتلك التي لوحظت في الشكل 1A. وتشمل القضايا المشتركة نوبات انخفاض درجة الحرارة على يجند ملزمة، وارتفاع مضان الخلفية، والتحولات متعددة غير عادية في درجات الحرارة. وينظر إلى التحولات على درجة حرارة منخفضة ملزمة عددا من يغاندس. لهذا الأسلوب، المعلمة الأكثر أهمية هو الخطأ في قياس T م، مقارنة مع التحول في درجة الحرارة. يمكن عادة البيانات تركيبها بشكل معقول عندما يكون الانحراف المعياري للقياسات ثلاث نسخ لا تتجاوز 10٪ من التحول درجة حرارة انصهار بين البروتين غير منضم والمربوطة بالكامل. تجربتنا هو أن مثل هذه حيث درجة الحرارةالتحولات erature هي فقط 2 درجة مئوية، وهذا يمكن أن يكون كافيا لتركيب البيانات، إذا كانت نقاط البيانات الفردية هي دقيقة للغاية. يتشكل المسألة الثانية غير عادي المنحنيات. هذه غالبا ما تختلف بين الحرة وأشكال البروتين يجند ملزمة، كما يجند ملزم يؤثر تتكشف وسائط من البروتين. في هذه الحالات، يجب على المستخدم أن تنظر في ما إذا كانت البيانات يمكن استخدامها مع الاعتبار المناسب من النماذج التي ستستخدم لتحديد درجة حرارة انصهار وثابت التفكك. قضية مشتركة أخرى هي أن إضافة العامل المساعد للبروتين (على سبيل المثال، MgCl 2 في مثالنا مع هيكسوكيناز) مطلوب للحصول على البيانات الأكثر موثوقية. كانت تجربتنا أن دراسة متأنية لجميع العوامل المحتملة في التجربة في مرحلة أخذ القراءات الأولية لا بد من الحصول على أفضل النتائج. وعلاوة على ذلك، يمكن أن العلاجات البديلة النظرية تكشف عن ملامح هذه البيانات 15،17. وأخيرا، فإنه ليس من غير المألوف بالنسبة لبعض البروتينات التي جontain أصلا تتعرض المناطق مسعور لإظهار عالية مضان الخلفية. هناك عدد من الحلول لهذه المشاكل، والتي تم استعراضها على نطاق واسع في أماكن أخرى 6،9. على وجه الخصوص، يجب على المستخدم أن تنظر في ما إذا كان استخدام بولتزمان أو النماذج المشتقة (مثل الشكل 4)، وفي حالة استخدام المشتقات، سواء يذوب متعددة يجب أن تكون على غرار. طريقتين للنمذجة الحرارية التي تتكشف تختلف في أن طريقة بولتزمان يناسب البيانات التجريبية للمعادلة بولتزمان، على افتراض شكل السيني منتظم لمنحنى تتكشف. في المقابل، فإن طريقة المشتقة يأخذ أول مشتق من البيانات التجريبية عند كل نقطة (اللوحة السفلى في الشكل 1A)، وتعتبر درجة حرارة انصهار لتكون وجهة الأعلى أولا مشتق. طريقة المشتقة يعود عموما درجة حرارة انصهار أعلى بنحو 2 - 3 درجات مئوية. فإن معظم البروتينات بإرجاع أكثر اتساقانتيجة (أي الخطأ المعياري لدرجة حرارة انصهار للتجارب ثلاث نسخ أقل) في واحدة من طريقتين. هذا هو عادة ترتبط ارتباطا وثيقا الشكل الدقيق للبروتين تتكشف منحنى، وأنه من الضروري لتحديد أفضل طريقة تجريبيا في كل حالة. حيث يتم استخدام نموذج مشتق، من المهم أيضا النظر إلى الأحداث ذوبان متعددة. تظهر بعض البيانات بوضوح الأدلة على التحولات متعددة، وفي هذه الحالات نتائج من المحتمل أن يكون من الأسهل لتفسير إذا غرار هذه الأحداث ذوبان متعددة. في سياق هذا البروتوكول، هو حالة أن إضافة يجند يمكن أن يسبب البروتين ليتحول من وجود التحولات ذوبان متعددة لانتقال واحد (على سبيل المثال، عن طريق تثبيت فرعي الأكثر هشاشة حراريا)، أو العكس في كثير من الأحيان. ولذلك فإننا ندعو إلى أن البيانات الأولية يتم فحص معا قبل النظر في النهج الذي سوف يكون من الأفضل للاستخدام. بعد مodelling من درجات الحرارة وذوبان الفردية، يمكن أن تنشأ المزيد من القضايا في ملاءمتها مع النماذج المعروضة في قسم البروتوكول. لا بد أن تدرس بعناية صالح إلى التفكك معادلة ثابتة باستخدام مقياس لوغاريتمي، وهذا التحليل غالبا ما يبرز تناقضات بين البيانات احظ ونموذج (ه .G.، الشكل 3). في حين أن النتائج التي تم الحصول عليها هي قوية بشكل عام والرعاية في التفسير يتيح الفرصة لاستخلاص أفضل النتائج، والأكثر معنى، من البيانات. وهناك قضية معينة تثيرها هذه البيانات هو التفسير الذي ينبغي أن توضع على البروتينات التي تظهر cooperativity، أو الأحداث ملزمة متعددة، في مهرجان دبي للتسوق. قمنا حتى الآن، لاحظ فقط هذه الظاهرة في البروتينات التي من المتوقع أن يكون لديك عدة أحداث ملزمة محددة (على سبيل المثال، WcbM، وهو بروتين الذي هو متعدد القسيمات 26 نديد أفضل، والذي يعمل بمثابة متعدد القسيمات على استبعاد حجم اللوني [البيانات لاأظهرت]). فإنه ليس من الواضح على الإطلاق أن cooperativity السلبية التي لوحظت في مهرجان دبي للتسوق تمسخ إلى أن إنزيم سوف تظهر في نهاية المطاف cooperativity سلبية: بدلا من ذلك، وهذا قد يكون مؤشرا ملزمة مجمع التي يجب استكشافها أكثر شمولا باستخدام مجموعة واسعة من الأساليب. هذا لا يوحي لنا، مع ذلك، أن دراسات أوسع لهذه البروتينات من المحتمل أن تحديد تأثيرات مثيرة للاهتمام. القيم المعطاة للثابت التفكك باستخدام هذه الطريقة عادة ما تكون من نفس النظام وتلك التي توفرها أساليب أخرى، مثل قياس الكالوري المعايرة متساوي الحرارة ومأكل سطح الرنين. ومع ذلك، فإن القيم المطلقة لوحظ أعلى كثيرا مما لوحظ استخدام هذه الأساليب. هذا هو على الأقل جزئيا نتيجة لحقيقة أن لوحظ ثابت التفكك في درجة حرارة انصهار من البروتين مع يجند. هذا K د عموما أعلى من ذلك في درجات حرارة الفسيولوجية. وdissociatioن الثابت هي ذات الصلة إلى درجة حرارة رد فعل من جانب المعادلات: <img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq1.jpg" /> [1] <img alt="المعادلة 2" src="/files/ftp_upload/51809/51809eq2.jpg" /> [2] (حيث c θ هو تركيز المرجعية القياسية، Δ ص G هو التغيير طاقة جيبس الحرة للتفاعل، R هو ثابت الغاز المولي، Δ H هو التغير في المحتوى الحراري للتفاعل، وΔ S هو التغيير الكون في رد فعل .) سوف ردود الفعل مع ثوابت التفكك في نطاق قياس هذه الطريقة عادة يكون سلبي Δ ص G، وبالتالي فإن تأثير زيادة في درجة الحرارة على المعادلة [1] سيكون لزيادة التفكك المستمر. كل من Δ H Δ S والمصطلحات التي تشكل الطاقة الحرة جيبس (المعادلة [2]) ودرجة حرارةسوف يعتمد 27 ه، والتأثير على ثابت التفكك تعتمد على حجم وعلامة من هذه التبعيات درجة الحرارة، وسيكون بالضرورة إحداث تفاعل بين الجسيمات التابع. وبالتالي، فإنه ليس من غير المتوقع أن ثوابت التفكك تحددها هذه الطريقة هي أكبر أحيانا من تلك التي يحددها الأساليب التي تعمل على RT. درجة حرارة الاعتماد هو، بطبيعة الحال، أيضا التحذير من طرق أخرى كثيرة، والتي تميل إلى توفير ثابت التفكك في درجات حرارة أقل من درجة حرارة الفسيولوجية. تحذير آخر من طريقة مهرجان دبي للتسوق هو أنه وسيلة المسمى، خلافا ITC. التسمية الفلورسنت المستخدمة (SYPRO البرتقال) هي مسعور، وحتى في بعض الحالات يمكن أن تتنافس مع ربط بروابط مسعور إلى البروتينات. وبالتالي، فمن المرجح أنه في بعض الحالات، ثابت التفكك الحصول عليها سيتم رفع مصطنع بسبب المنافسة مع التسمية. ومع ذلك، لمقارنة بروابط متنوعة، (الاستخدام الرئيسي للDSF)، من غير المرجح أن تكون كبيرة بما فيه الكفاية للتأثير على الترتيب من المركبات التي تقارب الاختلافات. والعيب المحتمل لهذا الأسلوب هو الحد من الكشف الذي يمكن تحقيقه. من حيث المبدأ، فإنه لا ينبغي أن يكون من الممكن قياس بدقة قيمة K د أن أقل من 50٪ من تركيز البروتين، وحتى القيم في هذا النطاق من المحتمل أن تكون ذات دقة مشكوك فيها. في حين أن الحد من الكشف في نهاية هذا النطاق يمكن تمديدها قليلا عن طريق خفض تركيزات البروتين وصبغ، فإن حساسية الصك منع مزيد من الانخفاض في تركيز البروتين. وبالمثل، سيتم تحديد نهاية العلوي من حساسية من قبل ذوبان يجند. للحصول على تقدير قوي رياضيا لK د، ومن المهم للغاية للحصول على البيانات مع 90٪ من البروتين موجودة في شكل محدد يجند، الأمر الذي يتطلب تركيز يجند أن تكون تقريبيةلاي عشر مرات K د (بافتراض عدم cooperativity). وبالتالي فإن الحد من الكشف بالضرورة عشر ذوبان يجند في المخزن المؤقت ذات الصلة. هذا يعني أن حدود الكشف عن الطريقة سوف تتراوح عادة بين 1 ميكرومتر وبين 1 و 100 ملم، اعتمادا على البروتين ويجند. في الختام، المسح التفاضلي fluorimetry هي تقنية متعددة الاستعمالات التي تنطبق على مجموعة واسعة من البروتينات. باستخدام الأساليب المعروضة هنا، فمن الممكن لتحديد بسرعة وبتكلفة زهيدة تقارب من البروتين للبروابط مختلفة. هذه لديها امكانات كبيرة لتطبيقها في تنقية البروتين والاستقرار، توضيح وظيفة أو خصوصية الانزيمات من metagenomes، واكتشاف المخدرات، وخاصة في المختبرات الصغيرة.

سيتم ربط جميع البروتينات، مع الانتماءات متفاوتة، لمجموعة متنوعة من الجزيئات الأخرى من أيونات بسيطة لالجزيئات الكبيرة الأخرى. في كثير من الحالات، والبروتينات ربط للشركاء جزيء صغير كجزء من وظيفتها الطبيعية (على سبيل المثال، كيناز ملزمة لATP). قد تكون التفاعلات الأخرى لا علاقة لها وظيفة، ولكنها مفيدة تجريبيا كأدوات (مثل الجزيئات الصغيرة التي استقرار البروتينات لتحسين نجاح تبلور، أو المساعدة في الحفاظ البروتينات في الحل). بينما الجزيئات الصغيرة التي تربط إلى مواقع نشطة والمواقع تفارغي من البروتينات يمكن أن تكون بمثابة مثبطات، وهكذا تعدل من نشاط الانزيمات. هناك مجموعة واسعة من التقنيات التي يمكن استخدامها لتحديد تقارب من البروتينات لجزيئات الشريكة. وينظر متساوي الكالوري المعايرة 1 على نطاق واسع بأنه &quot;معيار الذهب&quot;، لأنه يقدم معلومات غنية على ردود الفعل، والتسمية خالية، وفرص محدودة لrtifacts التجربة. ومع ذلك، على الرغم من التحسينات الأخيرة في حساسية الأجهزة وأتمتة التجريبية مجموعة المتابعة، فإنه لا يزال مكلفا نسبيا من حيث الاحتياجات من البروتين، وعلى أحسن تقدير إنتاجية المنخفضة والمتوسطة، والأنسب لتفاعلات مع معتدلة إلى الانتماءات عالية (10 نانومتر إلى 100 ​​ميكرومتر K د) 2. طرق تسمية أخرى مجانية مثل الرنين مأكل السطح أو طبقة ثنائية التداخل 3 عرض الانتاجية العالية، وحققت حساسية للكشف عن جزيئات أصغر منخفضة تصل إلى 100 ​​دا. ومع ذلك، وأدوات الإنتاجية العالية لهذه الطرق مكلفة نسبيا، لها ما يبررها فقط حيث سيكون هناك الإنتاجية المستمرة للمشاريع ذات الصلة، وذلك يحتمل أن تكون بعيدة عن متناول العديد من المختبرات الأكاديمية. وكان أول وصف الفرق fluorimetry المسح (مهرجان دبي للتسوق، أو thermofluor) في عام 2001 4 كطريقة لاكتشاف الأدوية. في هذا methoد، يتم تحضين البروتينات مع صبغة الفلورسنت (استخدمت الأصباغ في البداية، النفثالين السلفونيك)، الذي يغير مضان طلبها ملزمة للمناطق مسعور من البروتينات. العينة البروتين صبغة ثم هي ساخنة، ومضان مراقبة مع ارتفاع الحرارة. تتكشف من البروتين، والتعرض لأجزاء مسعور من البروتين، يؤدي إلى وجود نمط مميز في مضان بوصفها وظيفة من درجة الحرارة (الشكل 1A). التجربة يمكن أن يؤديها في كميات صغيرة في أي صك PCR الكمي التجاري، وذلك في تجربة واحدة، وعدد كبير من العينات يمكن اختبار في وقت واحد (عادة 48، 96 أو 384 عينات، اعتمادا على نموذج الصك). يمكن عادة أن يؤديها في التجارب حول وجود ساعة، وتوفير إمكانية تحليل إنتاجية عالية من العينات 5. شهدت تحسينات أخرى لمنهجية اعتماد الأصباغ مع أفضل الخصائص الطيفية 6،7 </سوب&gt;، أدوات عامة لتحليل البيانات، واقترحت بروتوكولات الفحص الأولي 8،9. وقد تم تمديد نطاق التطبيقات للأسلوب، مع التركيز بشكل خاص على إيجاد الظروف المثلى لإعداد وتخزين البروتينات 10، وعلى تحديد الشركاء المحتملين ملزم لمساعدة تبلور 11. على إنتاجية عالية نسبيا من طريقة، منخفضة التكلفة نسبيا بالبروتين (~ 2 ميكروغرام في رد الفعل) جعلت، وتطبيق لدراسة الجزيئات ملزمة ضعيفة DSF أداة قيمة لجزء يستند تصميم المخدرات، لا سيما في سياق أكاديمي 12-14. على الرغم من تطبيق واسع من مهرجان دبي للتسوق لدراسة تفاعلات البروتين يجند، ووصف عدد قليل من الدراسات تحديد ثوابت التفكك من هذه الدراسات. ومع ذلك، فقد اتجهت هذه المعادلات لإنتاج مفصلة تصف تتكشف من البروتين، مع العديد من المعلمات التي يجب تركيبها على البيانات متفرق أو في بعض الحالات البريدstimated 7،15-17. هذه الأساليب هي ذات أهمية خاصة في الحالات الصعبة، مثل المركبات ملزمة بإحكام، أو البروتينات التي تظهر التحولات غير عادية. ومع ذلك، بالنسبة لكثير من المختبرات، وهذه التحليلات التفصيلية هي مرهقة جدا للاستخدام الروتيني. لذا نقترح العلاجات البديلة لسيناريوهات مختلفة، وإظهار كيف يمكن استخدام هذه البيانات لتناسب مختلف التفاعلات الناتجة عن البروتين يجند. يستخدم أسلوب لدينا الصك StepOne QPCR، التي برمجيات تحليل البيانات مفصل متاح. بينما هذا يسرع تحليل البيانات، ويمكن معالجة النتائج من الأدوات الأخرى باستخدام أساليب نشرت سابقا 9، ويمكن إجراء نفس التحليل المصب.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">StepOne real time PCR instrument</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4376357</td>
			<td style="width:167px;">DSF can be performed with many other instruments. The StepOne instrument has very convenient software for data analysis.</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">Protein thermal shift software v1.0</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right" style="width:119px;">4466037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">MicroAmp Fast optical 48-well plates&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4375816</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">Optical sealing tape&#160;</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td align="right">4375323</td>
			<td>Bio-rad part no. 223-9444 is an alternative supplier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">U-bottomed 96-well plates</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td align="right">11521943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:216px;">SYPRO Orange</td>
			<td style="width:71px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">S6650</td>
			<td>For a smaller volume supplier, use Sigma part no. S5692</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SPSS statistics version 20</td>
			<td style="width:71px;">IBM</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Other statistics packages will provide similar functionality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GraphPad Prism 6.02</td>
			<td style="width:71px;">GraphPad</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Other statistics packages will provide similar functionality</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Hand applicator (PA1)</td>
			<td style="width:71px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">75-3454-4264-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Hexokinase from Saccharomyces cerevisiae</td>
			<td style="width:71px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Glucose</td>
			<td style="width:71px;">Fisher scientific</td>
			<td align="right">10141520</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of protein-ligand interactions using differential scanning fluorimetry

هناك مجموعة واسعة من وسائل متاحة لتحديد التفكك المستمر بين البروتين والتفاعل الجزيئات الصغيرة حاليا. ومع ذلك، فإن معظم هذه تتطلب الوصول إلى معدات متخصصة، وغالبا ما تتطلب قدرا من الخبرة لإقامة فعالية تجارب موثوقة وتحليل البيانات. وتستخدم بشكل متزايد التفاضلي fluorimetry المسح (DSF) كوسيلة من وسائل قوية لفرز أولي من البروتينات للتفاعل جزيئات صغيرة، إما لتحديد الشركاء الفسيولوجية أو لاكتشاف ضرب. هذا الأسلوب له ميزة أنه يتطلب سوى آلة PCR مناسبة للالكمي PCR، ومناسبة حتى الأجهزة متاح في معظم المؤسسات. مجموعة ممتازة من البروتوكولات متاحة بالفعل؛ وهناك سوابق قوية في الأدب لاستخدامات متعددة من طريقة. وقد اقترح العمل السابق عدة وسائل لحساب ثوابت التفكك من البيانات مهرجان دبي للتسوق، ولكن هذه هي تطلبا رياضيا. هنا، نحن ماركاonstrate طريقة لتقدير ثوابت التفكك من كمية معتدلة من البيانات التجريبية مهرجان دبي للتسوق. يمكن عادة هذه البيانات يتم جمعها وتحليلها في غضون يوم واحد. علينا أن نظهر كيف نماذج مختلفة يمكن استخدامها لتتناسب مع البيانات التي تم جمعها من الأحداث ملزمة بسيطة، وحيث المواقع التعاونية ملزمة، أو مستقلة ملزمة موجودة. وأخيرا، نقدم مثالا لتحليل البيانات في حالة حيث لا تنطبق النماذج القياسية. يتم توضيح هذه الأساليب مع البيانات التي تم جمعها على البروتينات تحكم المتاحة تجاريا، واثنين من البروتينات من برنامج البحوث لدينا. وعموما، يوفر طريقة لدينا وسيلة مباشرة للباحثين للحصول على مزيد من التبصر بسرعة تفاعلات البروتين يجند باستخدام مهرجان دبي للتسوق.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry at JoVE.com

Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

تحديد تفاعلات البروتين يجند عن طريق المسح الضوئي التفاضلية Fluorimetry

A wide range of methods are currently available for determining the dissociation constant between a protein and interacting small molecules. However, most ...

determination-protein-ligand-interactions-using-differential-scanning

Research

JoVE Journal

Biology

61.1K Views.  University of Exeter. Differential scanning fluorimetry is a widely used method for screening libraries of small molecules for interactions with proteins. Here, we present a straightforward method to extend these analyses to provide an estimate of the dissociation constant between a small molecule and its protein partner.

Video: Determination of Protein-ligand Interactions Using Differential Scanning Fluorimetry

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

Microvolume تحديد تركيز البروتين باستخدام 2000c NanoDrop الطيف

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

بلورة البروتينات الغشائية لتحديد الهيكل باستخدام Mesophases Lipidic

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development of a larger region of the embryo. This makes defining its role in a particular tissue difficult to analyze. For example, noggin overexpression in Xenopus laevis embryos causes the expansion of the entire anterior region, including the eye1,2. From this result, it is not known if Noggin plays a direct role in eye determination or that by causing an expansion of neural tissue, Noggin indirectly affects eye formation. Having this complex phenotype makes studying its eye-specific role in cell fate determination difficult to analyze. We have developed an assay that overcomes this problem. Taking advantage of the pluripotent nature of the Xenopus laevis animal cap 3, we have developed an assay to test the ability of gene product(s), like noggin or the eye field transcription factors (EFTFs), to transform caps into particular tissue or cell types by transplanting this tissue onto the side of the embryo 4. While we have found either Noggin protein treatment or a collection of transcription factors can determine retinal cell fate in animal caps, this procedure could be used to identify gene product(s) involved in specifying other tissues as well.

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant ACT Assay in Xenopus laevis

Animal caps overexpressing gene product(s) are transplanted to the flank of developing Xenopus laevis embryos in order to establish whether tissue is determined.

تحديد الأنسجة باستخدام زرع رسملة الحيوان (ACT) في الفحص القيطم المورق</em

Many proteins play a dual role in embryonic development. Those that regulate cell fate determination in a specific tissue can also affect the development ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

تحليل شفان نجمية طريق التفاعلات في المختبر فحوصات

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Proteomics research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that proteins in cells mostly exist not as isolated entities but exert their biological activity in association with many other proteins, in humans ten or more, forming assembly lines in the cell for most if not all vital functions.1,2 Knowledge of the function and architecture of these multiprotein assemblies requires their provision in superior quality and sufficient quantity for detailed analysis. The paucity of many protein complexes in cells, in particular in eukaryotes, prohibits their extraction from native sources, and necessitates recombinant production. The baculovirus expression vector system (BEVS) has proven to be particularly useful for producing eukaryotic proteins, the activity of which often relies on post-translational processing that other commonly used expression systems often cannot support.3 BEVS use a recombinant baculovirus into which the gene of interest was inserted to infect insect cell cultures which in turn produce the protein of choice. MultiBac is a BEVS that has been particularly tailored for the production of eukaryotic protein complexes that contain many subunits.4 A vital prerequisite for efficient production of proteins and their complexes are robust protocols for all steps involved in an expression experiment that ideally can be implemented as standard operating procedures (SOPs) and followed also by non-specialist users with comparative ease. The MultiBac platform at the European Molecular Biology Laboratory (EMBL) uses SOPs for all steps involved in a multiprotein complex expression experiment, starting from insertion of the genes into an engineered baculoviral genome optimized for heterologous protein production properties to small-scale analysis of the protein specimens produced.5-8 The platform is installed in an open-access mode at EMBL Grenoble and has supported many scientists from academia and industry to accelerate protein complex research projects.

Protein complexes catalyze key cellular functions. Detailed functional and structural characterization of many essential complexes requires recombinant production. MultiBac is a baculovirus/insect cell system particularly tailored for expressing eukaryotic proteins and their complexes. MultiBac was implemented as an open-access platform, and standard operating procedures developed to maximize its utility.

على البروتين MultiBac مجمع منصة الإنتاج في EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

باستخدام Coculture لكشف كيميائيا وساطة بين الأنواع التفاعلات

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and understanding the nature of such interactions is a central step in biological research. Surface Plasmon Resonance (SPR) is a sensitive detection technique for label-free study of bio-molecular interactions in real time. In a typical SPR experiment, one component (usually a protein, termed 'ligand') is immobilized onto a sensor chip surface, while the other (the 'analyte') is free in solution and is injected over the surface. Association and dissociation of the analyte from the ligand are measured and plotted in real time on a graph called a sensogram, from which pre-equilibrium and equilibrium data is derived. Being label-free, consuming low amounts of material, and providing pre-equilibrium kinetic data, often makes SPR the method of choice when studying dynamics of protein interactions. However, one has to keep in mind that due to the method's high sensitivity, the data obtained needs to be carefully analyzed, and supported by other biochemical methods. 
SPR is particularly suitable for studying membrane proteins since it consumes small amounts of purified material, and is compatible with lipids and detergents. This protocol describes an SPR experiment characterizing the kinetic properties of the interaction between a membrane protein (an ABC transporter) and a soluble protein (the transporter's cognate substrate binding protein).

Real Time Measurements of Membrane Protein:Receptor Interactions Using Surface Plasmon Resonance SPR

Surface Plasmon Resonance (SPR) is a label-free method for detecting bio-molecular interactions in real time. Herein, a protocol for a membrane protein:receptor interaction experiment is described, while discussing the pros and cons of the technique.

قياسات الوقت الحقيقي من البروتين غشاء: مستقبلات التفاعلات عن طريق مأكل السطح الرنين (SPR)

Protein-protein interactions are pivotal to most, if not all, physiological processes, and  understanding the nature of such interactions is a central ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these multi-spanning transmembrane proteins, with or without change in channel gating, is often postulated to contribute significantly in this process. It has thus become critical to develop a method to quantify the change of the relative cell surface expression of cardiac ion channels on a large scale. Herein, a detailed protocol is provided to determine the relative total and cell surface expression of cardiac L-type calcium channels CaV1.2 and membrane-associated subunits in tsA-201 cells using two-color fluorescent cytometry assays. Compared with other microscopy-based or immunoblotting-based qualitative methods, flow cytometry experiments are fast, reproducible, and large-volume assays that deliver quantifiable end-points on large samples of live cells (ranging from 104 to 106 cells) with similar cellular characteristics in a single flow. Constructs were designed to constitutively express mCherry at the intracellular C-terminus (thus allowing a rapid assessment of the total protein expression) and express an extracellular-facing hemagglutinin (HA) epitope to estimate the cell surface expression of membrane proteins using an anti-HA fluorescence conjugated antibody. To avoid false negative, experiments were also conducted in permeabilized cells to confirm the accessibility and proper expression of the HA epitope. The detailed procedure provides: (1) design of tagged DNA (deoxyribonucleic acid) constructs, (2) lipid-mediated transfection of constructs in tsA-201 cells, (3) culture, harvest, and staining of non-permeabilized and permeabilized cells, and (4) acquisition and analysis of fluorescent signals. Additionally, the basic principles of flow cytometry are explained and the experimental design, including the choice of fluorophores, titration of the HA antibody and control experiments, is thoroughly discussed. This specific approach offers objective relative quantification of the total and cell surface expression of ion channels that can be extended to study ion pumps and plasma membrane transporters.

Inherited cardiac arrhythmias are often caused by mutations that alter the surface delivery of one or more ion channels. Here, we adapt flow cytometry assays to provide a quantification of the relative total and cell surface protein expression of recombinant ion channels expressed in tsA-201 cells.

تقرير من سطح الخلية النسبي ومجموع التعبير عن قنوات المؤتلف ايون باستخدام التدفق الخلوي

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Sperm Collection of Differential Quality Using Density Gradient Centrifugation

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with fertilizing ability are required to interact with a female gamete to ensure fertilization. As such, the fertilizing ability of individual sperm cells is critical for successful reproduction. Density gradient centrifugation has been utilized for several decades as a reproducible, fast, efficient, effective and extremely adaptable method to collect only high-quality sperm to be used in assisted reproductive technology. The protocols we described herein focus on the utilization of the discontinuous Percoll density gradient centrifugation (PDGC) technique to isolate three distinct populations of rooster sperm by their quality. We were able to collect low-, medium- and high-quality sperm. We also describe reproducible protocols that entail determining fertility potential of sperm by assessing their viability, mobility and penetrability. Collection of sperm by their quality using PDGC technique would be useful to accurately and thoroughly characterize sperm with differential fertility potential.

In this paper, we aim to describe the performance of the density gradient centrifugation technique and its application in sperm physiology research.

جمع الحيوانات المنوية فرق الجودة باستخدام الكثافة المتدرجة الطرد المركزي

In sexual reproduction, a male gamete or sperm cell fuses with a female gamete to bring about fertilization. However, a large number of sperm cells with ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, sequester or eliminate damaged proteins to maintain a healthy proteome, thus ensuring cellular proteostasis and preventing further protein damage. Because of redundant functions within the proteostasis network, screening for detectable phenotypes using knockdown or mutations in chaperone-encoding genes in the multicellular organism Caenorhabditis elegans results in the detection of minor or no phenotypes in most cases. We have developed a targeted screening strategy to identify chaperones required for a specific function and thus bridge the gap between phenotype and function. Specifically, we monitor novel chaperone interactions using RNAi synthetic interaction screens, knocking-down chaperone expression, one chaperone at a time, in animals carrying a mutation in a chaperone-encoding gene or over-expressing a chaperone of interest. By disrupting two chaperones that individually present no gross phenotype, we can identify chaperones that aggravate or expose a specific phenotype when both perturbed. We demonstrate that this approach can identify specific sets of chaperones that function together to modulate the folding of a protein or protein complexes associated with a given phenotype.

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

To study chaperone-chaperone and chaperone-substrate interactions, we perform synthetic interaction screens in Caenorhabditis elegans using RNA interference in combination with mild mutations or over-expression of chaperones and monitor tissue-specific protein dysfunction at the organismal level.

استخدام Elegans Caenorhabditis إلى الشاشة لتفاعلات Chaperone الأنسجة محددة

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...