Name: real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled bdnf in primary neurons
Uploaded: 2014-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
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私たちは、彼らの技術支援のための越（ポーリン）胡、レイチェルSINITに感謝したいと思います。研究は、NIHの助成金（PN2 EY016525）によって、及びダウン症の研究と治療財団とラリーL. Hillblom財団からの資金によってサポートされています。

外科および動物の手順は厳密に実験動物の管理と使用に関するNI​​Hガイドに従って行われる。動物の使用を含む全ての実験は、UCSDの施設内動物管理使用委員会によって承認されています。 1プラスミドのクローニング、モノビオチン化BDNFの発現および精製（mBtBDNF） 注：HEK293FTセル10におけるpcDNA3.1ベクターと共発現に予めproBDNFaviとBirAをするcDNAを構築します。 mBtBDNFは、成熟生物学的に活性モノビオチン神経成長因子（mBtNGF）10を製造する以前に公開された方法に従ってのNi-NTAビーズを用いて精製する。 マイクロ流体チャンバーの調製マイクロ流体ニューロン培養装置は、流体ニューロン細胞体から軸索を単離することができる。右の各解剖前にコーティングされたばかりカバースリップでチャンバーを組み立てます。使用マイクロ流体室このプロトコルで、商業的に（資機材の表を参照）を購入している。手洗いや5-6xまでの再利用、商業的に購入室。 <ol><li>手洗い1％Alconoxマイクロ流体室。 30分ごとにミリQ水で3回すすいでください。手を70％エタノールで再びチャンバを洗浄する。 </li><li>層流フード中でパラフィルム上で乾燥さ室をレイアウト。 UV下で20分間チャンバーの両側を照射し、滅菌する。ストアは、室温でパラフィルムで密封し、滅菌15cmの皿にチャンバを滅菌した。 </li><li>ガラス容器に24×40ミリメートル1号カバーガラスを配置します。一晩回転装置に35％の塩酸でカバースリップを浸す。翌日、30分水でそれぞれにカバースリップを3回すすいでください。 </li><li>カバースリップを100％エタノールに各カバースリップを浸漬し、ブンゼンバーナーの上に炎によって一枚ずつ滅菌する。無菌ペトリ皿に乾燥カバースリップを保存し、コーティングまで室温で保管してください。 </li><li> OUを置き15cmの培養皿にカバースリップはt。コー​​ト0.01％ポリ-L-リジン（PLL）0.7mlを各カバースリップとは、室温でフード内でインキュベートする。 </li><li> 1時間後、カバースリップを滅菌水で3回リンス。ドライカバーガラス、真空とし、6cmの培養皿に各カバースリップを配置。 </li><li>マイクロ流体チャンバーを組み立てるために、マイクログルーブに触れないように注意して、PLLコーティングしたカバーガラス上に下部にマイクログルーブ側でチャンバーを配置。優しく室が密閉されたことを確認するためにピペットチップでチャンバーを押し下げる。 </li></ol>チェンバースでの神経文化、プレートの3解剖<ol><li> 1％のペニシリン/ストレプトマイシンおよび10mMのHEPESと2ミリリットル解剖バッファー（HBSS、無カルシウム、ないマグネシウムを含む15ミリリットルコニカルチューブ中で解剖2 E17-E18ラット海馬（1脳）を配置します。組織をすすぎ5mlで3倍解剖できる限り解剖バッファを削除してください。たびにバッファリングし、新鮮なディ900μlのを追加ssectionバッファ。 </li><li>組織を消化するために、1×作業濃度を作るために解剖バッファーに10倍のトリプシン（2.5％）の100μlを添加する。 37℃の水浴中で円錐管を置き。消化の10分後、1 mg / mlの周りの最終濃度に10 mg / mlのDNase Iを100μlのを追加します。 </li><li>ファイアーポリッシュパスツールガラスピペットを使用して、静かにピペッティング5〜10倍によって組織を粉砕する。右粉砕後、（10％FBS、2mMのグルタマックス、2％のB27とのNeurobasal）培地めっき2mlのトリプシンをクエンチする。 </li><li>組織のいずれ破片が底に落ち着くことができるように5分間フード内のサンプルのままにしておきます。慎重に細胞をペレットに5分間200×gで清潔な無菌の15ミリリットルコニカルチューブと遠心分離機に上清の2ミリリットルを削除します。 50μlのメッキメディアでペレットを再懸濁</li><li>血球計算板を用いて細胞を数える。負荷のマイクロ流体チャンバーの1区画への15〜20μlの細胞懸濁液（〜40,000細胞）。チャンバーを配置細胞がカバーグラスに付着することを可能にする10分間インキュベーター中。 10分後、チャンバーの両方の区画を埋めるために、よりメッキメディアを追加。 </li><li>解剖の二日目に、完全に細胞体と軸索コンパートメントの両方で維持培地（2mMのグルタマックス、2％のB27と神経基本）でメッキのメディアを交換してください。海馬ニューロンからの軸索は、3日目に微小溝を渡り、一日5-7間の軸索コンパートメントに到達するために開始します。この期間中、新鮮な維持培地ごとに24〜48時間で培養培地の半分を交換してください。 </li></ol> QD-BDNFの4軸索輸送<ol><li>徹底的に2時間BDNFフリー、無血清神経基本培地で両方の区画ごとに、30分をすすぐことにより、マイクロ流体チャンバーの細胞体と軸索のコンパートメントの両方からのBDNFを枯渇、QD-BDNF軸索輸送のイメージングを生きる前に。 </li><li> BDNFの枯渇時には、QD-BDNF結合体を準備します。モノビオチン化BDの50 nMのミックスNFの神経基礎培地中の50 nMのQD655-ストレプトアビジン抱合体と二量体と60分間氷上でインキュベートする。 </li><li>軸索コンパートメントにメディアを取り出し、37℃で4時間、0.25 nMでの最終濃度で300μlのQD-BDNFを追加します。細胞体区画にQD-BDNFの拡散を最小限に抑えるためには、常に軸索区画におけるよりも細胞体コンパートメント内のメディアのより高いレベルを維持することは非常に重要である。ライブイメージングの前インキュベーション後に、結合していないQD-BDNFを洗い流す。 </li><li> 100X油対物レンズを備えた倒立顕微鏡を用いてQD-BDNF輸送のライブイメージングを実施する。範囲および一定温度（37℃）とCO 2（5％）、それに取り付けられた環境室を温める。 QD655信号を可視化するためにテキサスレッド励起/発光キューブのセットを使用してください。 </li><li>取得しCCDカメラを用いて2分間、合計1フレーム/秒の速度で中間軸索内のタイムラプス画像を取り込む。股関節のない軸索とマイクログルーブを使用してくださいtは浸潤のコントロールとして何QDので、無信号がありません。 </li><li>任意の画像解析ソフトウェアまたはNIHのImageJを使用して、BDNF輸送を分析します。 </li></ol>

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	<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+dynein-microtubule+network+is+required+for+NGF+signaling+through+the+Rap1/MAPK+pathway.">A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway.</a> Traffic. 8, 1503-1520 (2007).</li><li>Wortzel, I., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ERK+Cascade:+Distinct+Functions+within+Various+Subcellular+Organelles.">The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles.</a> Genes &amp; cancer. 2, 195-209 (2011).</li><li>Huang, E. J., Reichardt, L. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sensitivity+of+striatal+neurons+to+axonal+transport+defects+induced+by+mutant+huntingtin.">Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).</li><li>Rong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+intracellular+trafficking+of+huntingtin-associated+protein-1+is+critical+for+TrkA+protein+levels+and+neurite+outgrowth.">Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).</li></ol>

利害関係が宣言されていない。

本研究では、生物学的に活性な生成するための新しい技術の開発を報告し、BDNFの軸索輸送を追跡するために使用することができ、BDNF（mBtBDNF）がモノビオチン化。量子ドットストレプトアビジンにタンパク質をコンジュゲート、およびマイクロ流体チャンバを使用することにより、この方法は、1つはリアルタイムでかつ空間的及び時間的解像度で、単一分子感度を有する一次ニューロンにお...

ニューロンは、高度が長く、多くの場合、非常に精緻化プロセスの確立及び神経回路の構造および機能を維持するための基本である細胞を分極されている。軸索はシナプスとの間で貨物を運ぶ重要な役割を果たしている。細胞体で合成されたタンパク質および細胞小器官は、神経機能をサポートするために、シナプス前末端に到達するために軸索を通って輸送される必要がある。これに対応して、遠位軸索で受信された信号は、形質導入し、細胞体に搬送する必要がある。これらのプロセスは、ニューロンの生存、分化および維持に必須である。いくつかのニューロンにおけるその軸索輸送が距離を通って1000倍以上細胞体の直径を行わなければならないでは、可能性は容易に小さくても赤字は著しく、神経回路機能に影響を与える可能性があることが想定される。 脳由来神経栄養因子（BDNF）、増殖因子のニューロトロフィンファミリーのメンバーは、ミリアンペアで存在する海馬、大脳皮質、および前脳基底核を含むニューヨークの脳領域、。 BDNFは、認知回路に関与するニューロンの生存、分化、および機能をサポートすることによって、認知および記憶形成において重要な役割を果たしている。 BDNFは、それがマイトジェン活性化プロテインキナーゼ/細胞外シグナル調節プロテインキナーゼ（MAPK / ERK）、ホスファチジルイノシトール3 - キナーゼを含むのTrkB媒介性シグナル伝達経路を活性化する軸索末端に、その受容体、チロシンキナーゼのTrkBに結合する（PI3K）およびホスホリパーゼC-ガンマ（PLCγ）。これらのシグナル伝達経路に関与するタンパク質を、逆行性神経細胞の細胞体に輸送され、エンドソーム1-6シグナリング BDNF / TrkBのを形成するために、エンドサイトーシス小胞構造にパッケージ化されています。 マイクロ流体培養チャンバーは、通常の条件下でだけでなく、怪我や病気7,8の設定で軸索生物学を研究するための非常に便利なプラットフォームです。軸索を分離することにより細胞体から、デバイスは、1つの軸索8-10で特異的に輸送を研究することができました。本研究で用いた450μmでマイクログルーブの障壁とPDMSベースのマイクロ流体プラットフォームは、商業的に（材料の表を参照）から購入した。 BDNF輸送を調べるために、モノビオチン化BDNF（mBtBDNF）を生成するための新規な技術を開発しました。私たちは（またAviTagをとして知られている）のビオチンアクセプターペプチドは、APを利用しました。これは、特に、大腸菌酵素ビオチンリガーゼ、BirAをすることによって、ビオチンに連結することができるリジン残基を含む15アミノ酸配列である。私たちは、PCR（ 図1A）、マウスプレproBDNF cDNAのC末端にAviTagを融合。構築物は、哺乳動物発現ベクター、をpcDNA3.1 mycを、彼のベクターにクローニングした。またをpcDNA3.1のmyc彼のベクターに細菌のBirA DNAをクローン化した。二つのプラスミドを一過両方のタンパク質を発現させるためにHEK293FT細胞に同時トランスフェクトした。 BirAをはビオのライゲーションを触媒するモノビオチン化BDNFモノマーを製造するために：1の比率、特にリジンの1でBDNFのC末端にAviTagを内に存在する。 〜18 kDaの分子量を有するビオチン化、成熟BDNFをNi-樹脂（ 図1C）を用いて培地から回収して精製した。イムノブロッティング（ 図1D）で修正されていないBDNFを検出することができないことによって判断されるようにBDNFのビオチン化は、完了した。ストレプトアビジン共役量子ドット、量子ドット655は、QD-BDNFを作るためにmBtBDNFを標識するために使用された。 mBtBDNFは、リン酸化のTrkB（ 図1E）を活性化し、組換えヒトBDNF（rhBDNF）程度に神経突起伸長（ 図1F）を刺激することができたとしてAviTagをの存在は、BDNFの活性を妨害しませんでした。免疫染色は、QD-BDNFはQD-BDNFは、生物活性（ 図1G）であることを示す、海馬軸索でのTrkBと共局在することが示さ。 BDNF輸送を研究するために、QD-BDNFは、遠位軸索区画に添加したラットE18海馬ニューロン（ 図2A）を含むマイクロ流体文化。軸索内のQD-BDNF逆行性輸送を赤色蛍光タグ（ 支援動画S1、S2）のリアルタイムライブイメージングによって捕獲された。生成されたカイモグラフを分析することによって、QD-BDNFは、約1.06ミクロン/秒（ 図3A）の移動速度で逆行性に輸送されることが観察された。 GFPまたはmCherryをタグ付きBDNFは、BDNFの軸索移動を追跡するために使用されている。主な欠点は、それらが単一分子研究のための十分に明るいではないということです。また、順行性および逆行性BDNFの動きの両方の存在は、それが困難な逆行性輸送BDNFは、ニューロトロフィン/受容体複合体にあったかどうかを評価することができる。 このビデオでは、一次ニューロンを用いたマイクロ流体チャンバ内にQD-BDNFのライブ人身売買を検査するために使用される技術を実証する。 ultrabrightnessと量子ドットのMAKの優れた光安定性エスことが可能BDNF輸送の長期的な追跡を実行する。これらの技術は、AD、HD、および他の神経変性疾患において、軸索機能の研究を強化するために利用することができる。

<table><tbody><tr><td>Platinum pfx DNA polymerase&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11708021</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&amp;nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>FD0274</td><td></td></tr><tr><td>BamHI&amp;nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>FD0054</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT cells</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-high glucose media</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>D-biotin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>TurboFect&amp;nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA resins</td><td>Qiagen</td><td>30250</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitors cocktail</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;S8820</td><td></td></tr><tr><td>Silver staining kit&amp;nbsp;</td><td>G-Biosciences</td><td>786-30</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant BDNF</td><td>Genentech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluidic chambers</td><td>Xona</td><td>SND450</td><td></td></tr><tr><td>24 x 40 mm No. 1 glass coverslips&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>48393-060</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine&amp;nbsp;</td><td>Cultrex</td><td>3438-100-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B27&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>QD655-streptavidin conjugates</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;Q10121MP</td><td></td></tr><tr><td>anti-Avi tag antibody</td><td>GenScript</td><td>A00674</td><td></td></tr><tr><td>streptavidin-agarose beads&amp;nbsp;</td><td>Life Technology</td><td>&amp;nbsp;SA100-04</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid</td><td>Sigma</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>HRP-streptavidin&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>N100</td><td></td></tr><tr><td>anti-pTrkB antibody</td><td>a generous gift from Dr M. Chao of NYU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-TrkB antibody</td><td>BD Science</td><td>610101</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled bdnf in primary neurons

BDNFは、神経細胞の生存、分化、および機能のいくつかのファセットに重要な役割を果たしている。軸索における構造的および機能的障害は、ますますアルツハイマー病（AD）およびハンチントン病（HD）を含む神経変性疾患の早期の特徴とみなされる。未だ不明な軸索損傷が誘導される機構（単数または複数）である。私たちは、BDNFの軸索輸送を追跡するために使用することができ、BDNF（mBtBDNF）モノビオチン、生物学的に活性な生産する新規な技術の開発を報告した。量子ドットで標識されたBDNF（QD-BDNF）がmBtBDNFに量子ドット655を結合させることにより作製した。マイクロ流体デバイスは、ニューロン細胞体から軸索を単離するために使用した。軸索コンパートメントへのQD-BDNFを添加すると、軸索におけるBDNF輸送のライブイメージングを可能にした。私たちは、QD-BDNFは、約1.06ミクロン/秒の移動速度で、非常に少数のポーズで、逆行本質的に排他的に移動させることを実証した。このシステムは私を調査するために使用することができADまたはHDビデオで破砕軸索機能だけでなく、他の変性疾患のchanisms。

生産と生物学的に活性なモノビオチン化BDNFの精製 AviTagをシーケンス（GGGLNDIFEAQKIEWHE）と融合したBDNFの発現ベクターは、以前に公開されたプロトコル10に従って作成されました。完全長融合タンパク質の分子量は〜32kDaのが（であると予測された<a href="http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html" target="_blank">http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html</a> ）18 kDaの（ 図1A）の予測...

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Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF、神経栄養因子の軸索輸送は、いくつかのニューロン集団の生存と機能に重要である。いくつかの変性疾患は、軸索の構造と機能の破壊でマークされています。私たちは、一次ニューロンを用いたマイクロ流体チャンバ内のQD-BDNFのライブ人身売買を検査するために使用される技術を実証した。

一次ニューロンにおける量子ドットで標識されたBDNFの軸索輸送のリアルタイムイメージング

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K ビュー.  University of California, San Diego.  BDNF、神経栄養因子の軸索輸送は、いくつかのニューロン集団の生存と機能に重要である。いくつかの変性疾患は、軸索の構造と機能の破壊でマークされています。私たちは、一次ニューロンを用いたマイクロ流体チャンバ内のQD-BDNFのライブ人身売買を検査するために使用される技術を実証した。 

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Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  Vital fluorescent probes, particularly green fluorescent protein (GFP) have revolutionized cell biology stemming from the ability to label specific intracellular compartments and cellular structures. For example, the live imaging of GFP (and its spectral variants) chimeras have allowed for a dynamic 
analysis of the cytoskeleton, organelle transport, and membrane dynamics in a multitude of organisms and cell types [1-3].  Although live imaging has become prevalent, this approach still poses many technical challenges, particularly in primary cultured neurons.  One challenge is the expression of GFP-tagged proteins in post-mitotic neurons; the other is the ability to capture fluorescent images while minimizing phototoxicity, photobleaching, 
and maintaining general cell health.  Here we provide a protocol that describes a lipid-based transfection method that yields a relatively low transfection rate (~0.5%), however is ideal for the imaging of fully polarized neurons.  A low transfection rate is essential so that single axons and dendrites can be characterized as to their orientation to the cell body to confirm directionality of transport, i.e., anterograde v. retrograde.  Our approach to imaging 
GFP expressing neurons relies on a standard wide-field fluorescent microscope outfitted with a CCD camera, image capture software, and a heated imaging chamber. We have imaged a wide variety of organelles or structures, for example, dense-core vesicles, mitochondria, growth cones, and actin without any special optics or excitation requirements other than a fluorescent light source. Additionally, spectrally-distinct, fluorescently 
labeled proteins, e.g., GFP and dsRed-tagged proteins, can be visualized near simultaneously to characterize co-transport or other coordinated cellular events.  The imaging approach described here is flexible for a variety of imaging applications and can be adopted by a laboratory for relatively little cost provided a microscope is available.

Live cell imaging is of particular utility when studying the dynamics of organelle trafficking. Here we describe a protocol for live imaging of dense-core vesicles in cultured neurons using wide-field fluorescence microscopy. This protocol is flexible and can be adapted to image other organelles such as mitochondria, endosomes, and peroxisomes.

初代培養海馬ニューロンにおける高密度コア小胞のライブイメージング

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

生物学

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

ショウジョウバエニューロンの開発における高速樹状分岐ダイナミクスのタイムラプスライブイメージングと定量化

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

神経科学

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

An Improved Protocol to Purify and Directly Mono-Biotinylate Recombinant BDNF in a Tube for Cellular Trafficking Studies in Neurons

Recombinant BDNF containing an Avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells and then cost-effectively purified by affinity chromatography. A reproducible protocol was developed to directly&#160;mono-biotinylate BDNFAvi with the enzyme BirA in a tube. In this reaction, mono-biotinylated BDNFAvi retains its biological activity.
Neurotrophins are target-derived growth factors playing a role in neuronal development and maintenance. They require rapid transport mechanisms along the endocytic pathway to allow long-distance signaling between different neuronal compartments. The development of molecular tools to study the trafficking of neurotrophins has enabled the precise tracking of these proteins in the cell using in vivo recording. In this protocol, we developed an optimized and cost-effective procedure for the production of mono-biotinylated BDNF. A recombinant BDNF variant containing a biotinylable avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells in the microgram range and then purified in an easily scalable procedure using affinity chromatography. The purified BDNF can then be homogeneously mono-biotinylated by a direct in vitro reaction with the enzyme BirA in a tube. The biological activity of the mono-biotinylated BDNF (mbtBDNF) can be conjugated to streptavidin-conjugated to different fluorophores. BDNFAvi and mbtBDNF retain their biological activity demonstrated through the detection of downstream phosphorylated targets using western blot and activation of the transcription factor CREB, respectively. Using streptavidin-quantum dots, we were able to visualize mbtBDNF internalization concomitant with activation of CREB, which was detected with a phospho-CREB specific antibody. In addition, mbtBDNF conjugated to streptavidin-quantum dots was suitable for retrograde transport analysis in cortical neurons grown in microfluidic chambers. Thus, in tube produced mbtBDNF is a reliable tool to study physiological signaling endosome dynamics and trafficking in neurons.

Recombinant BDNF containing an Avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells in a cost-effective manner and is purified by affinity chromatography. BDNFavi is then directly mono-biotinylated with the enzyme BirA in a tube. BDNFavi and mono-biotinylated BDNFavi retain their biological activity when compared to commercially available BDNF.

ニューロンの細胞密売研究のためのチューブ内の組換えBDNFを精製し、直接モノビオチン化するための改良されたプロトコル

Recombinant BDNF containing an Avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells and then cost-effectively purified by affinity chromatography. A ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

切除されたマウス脛骨神経におけるニューロフィラメント輸送のイメージングと解析

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a powerful model system for the investigation of cell type-specific mechanisms of neuronal morphogenesis and connectivity. The organization and composition of retinal subtypes are well-defined, and genetic tools are available to access specific types during development. Many retinal cell types also constrain their dendrites and/or axons to narrow layers, which facilitates time-lapse imaging. Mouse retina explant cultures are well suited for live-cell imaging using confocal or multiphoton microscopy, but methods optimized for imaging dendrite dynamics with temporal and structural resolution are lacking. Presented here is a method to sparsely label and image the development of specific retinal populations marked by the Cre-Lox system. Commercially available adeno-associated viruses (AAVs) used here expressed membrane-targeted fluorescent proteins in a Cre-dependent manner. Intraocular delivery of AAVs in neonatal mice produces fluorescent labeling of targeted cell types by 4-5 days post-injection (dpi). The membrane fluorescent signals are detectable by confocal imaging and resolve fine branch structures and dynamics. High-quality videos spanning 2-4 h are acquired from imaging retinal flat-mounts perfused with oxygenated artificial cerebrospinal fluid (aCSF). Also provided is an image postprocessing pipeline for deconvolution and three-dimensional (3D) drift correction. This protocol can be used to capture several cellular behaviors in the intact retina and to identify novel factors controlling neurite morphogenesis. Many developmental strategies learned in the retina will be relevant for understanding the formation of neural circuits elsewhere in the central nervous system.

Here, we present a method for investigating neurite morphogenesis in postnatal mouse retinal explants by time-lapse confocal microscopy. We describe an approach for sparse labeling and acquisition of retinal cell types and their fine processes using recombinant adeno-associated virus vectors that express membrane-targeted fluorescent proteins in a Cre-dependent manner.

遺伝子標的網膜細胞集団のスパースアデノ随伴ウイルス標識を用いた神経樹木化のタイムラプスイメージング

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

軸索輸送の In Vivo イメージングのためのツールキットの拡張

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal ...

Measuring Axonal Cargo Transport in Mouse Primary Cortical Cultured Neurons

Neuronal cells are highly polarized cells that stereotypically harbor several dendrites and an axon. The length of an axon necessitates efficient bidirectional transport by motor proteins. Various reports have suggested that defects in axonal transport are associated with neurodegenerative diseases. Also, the mechanism of the coordination of multiple motor proteins has been an attractive topic. Since the axon has uni-directional microtubules, it is easier to determine which motor proteins are involved in the movement. Therefore, understanding the mechanisms underlying the transport of axonal cargo is crucial for uncovering the molecular mechanism of neurodegenerative diseases and the regulation of motor proteins. Here, we introduce the entire process of axonal transport analysis, including the culturing of mouse primary cortical neurons, transfection of plasmids encoding cargo proteins, and directional and velocity analyses without the effect of pauses. Furthermore, the open-access software "KYMOMAKER" is introduced, which enables the generation of a kymograph to highlight transport traces according to their direction and allow easier visualization of axonal transport.

The present protocol describes the whole procedure of analysis for axonal transport. In particular, the calculation of transport velocity, not including the pausing, and the visualization method using open-access software "KYMOMAKER" are shown here.

Neuronal cells are highly polarized cells that stereotypically harbor several dendrites and an axon. The length of an axon necessitates efficient ...

<meta charset="utf8"></head><body>生細胞イメージングによる初代海馬ニューロンのタンパク質の可視化

Using Live&#45;Cell Imaging to Measure the Effects of Pathological Proteins on Axonal Transport in Primary Hippocampal Neurons

Bidirectional transport of cargos along the axon is critical for maintaining functional synapses, neural connectivity, and healthy neurons. Axonal transport is disrupted in multiple neurodegenerative diseases, and projection neurons are particularly vulnerable because of the need to transport cellular materials over long distances and sustain substantial axonal mass. Pathological modifications of several disease-related proteins negatively affect transport, including tau, amyloid-&#946;, &#945;-synuclein, superoxide dismutase, and huntingtin, providing a potential common mechanism by which pathological proteins exert toxicity in disease. Methods to study these toxic mechanisms are necessary to understand neurodegenerative disorders and identify potential therapeutic interventions.
Here, cultured primary rodent hippocampal neurons are co-transfected with multiple plasmids to study the effects of pathological proteins on fast axonal transport using live-cell confocal imaging of fluorescently-tagged cargo proteins. We begin with the harvest, dissociation, and culturing of primary hippocampal neurons from rodents. Then, we co-transfect the neurons with plasmid DNA constructs to express fluorescent-tagged cargo protein and wild-type or mutant tau (used as an exemplar of pathological proteins). Axons are identified in live cells using an antibody that binds an extracellular&#160;domain of neurofascin, an axon initial segment protein, and an axonal region of interest is imaged to measure fluorescent cargo transport.
Using KymoAnalyzer, a freely available ImageJ macro, we extensively characterize the velocity, pause frequency, and directional cargo density of axonal transport, all of which may be affected by the presence of pathological proteins. Through this method, we identify a phenotype of increased cargo pause frequency associated with the expression of pathological tau protein. Additionally, gene-silencing shRNA constructs can be added to the transfection mix to test the role of other proteins in mediating transport disruption. This protocol is easily adaptable for use with other neurodegenerative disease-related proteins and is a reproducible method to study the mechanisms of how those proteins disrupt axonal transport.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:神経変性疾患における軸索輸送に対する病理学的タンパク質の影響の理解

Here, we demonstrate how to combine transfection of primary hippocampal rodent neurons with live-cell confocal imaging to analyze pathological protein-induced effects on axonal transport and identify mechanistic pathways mediating these effects.

一次ニューロンにおける量子ドットで標識されたBDNFの軸索輸送のリアルタイムイメージング

要約

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