私たちは、出版物のコストをカバーすることで、この出版を後援するためのロンザ·グループ·リミテッドに感謝しています。私たちは、SLに財政支援のためウントKULTUR WissenschaftドイツInfarktforschungshilfe、ヴィルヘルム·ヴァイヨン-財団、アーネスト·ソルベイ·財団、およびテゥーリンガーMinisteriumエリーゼBildungに感謝。

THP-1マクロファージの1。前分化<ol><li> CO 2中10％（v / v）ウシ胎児血清（FCS）および1％（v / v）ペニシリン/ストレプトマイシン/ L-グルタミン（PSG）を補充したRPMI-1640培地中でTHP-1細胞を培養（5％ 37℃）のインキュベーター。 </li><li>トランスフェクションの前に、細胞を分割し、以前のように新鮮なRPMI培地に移す。 24時間細胞を培養。 </li><li>シード1.0〜1.5×10 75 cm 2の組織培養フラスコ中に7細胞または2.5×10 7 RPMI-1640培地中の150-cm 2の組織培養フラスコへの細胞および10％（v / v）FCS、1％（容量を追加/ 48時間v）のPSG、1％（v / v）のピルビン酸ナトリウム、1％（v / v）の非必須アミノ酸、10ng / mlのPMA、および50μMのβ-メルカプトエタノール。 </li></ol>ヌクレオの調製<ol><li> 37℃の水浴中のAccutase Iおよびすべてのメディアを置く。 </li><li>フラスコからの吸引し培地および6mlの（75 cm 2のフラスコ）または12ミリリットル（150 cm 2のフラスコ）と交換してくださいIのAccutaseと細胞の完全な剥離、37℃で30分間インキュベートする。細胞が丸い外観を有することを確認するために私のAccutase処理後の細胞の形態を観察します。いくつかの細胞は、まだ取り付けられるように表示される場合は、慎重にマイクロピペットでフラスコをすすぎやそっとの剥離を完了するために、それをタップします。これは、細胞の活力に悪影響を与えるように、セルスクレーパーを使用しないでください。 15mlチューブに細胞懸濁液を移す。 </li><li>のAccutase I処理中に、次のメディアを準備します。 <ol><li>トランスフェクション培地を調製する：補足細胞培養培地を、1％（v / v）のPSGを、1％（v / v）の非必須アミノ酸、1％（v / v）のピルビン酸ナトリウム、および5％（v / v）のヒト血清（プラスミドDNAの場合）、ヒト血清（siRNAの場合）または20％（v / v）の; 2つの12ウェルプレートに1つの6ウェルプレートまたは4ミリリットル/サンプルのいずれかのため3ミリリットル/試料の最終容量を準備する。 </li><li>培養培地を準備し補足培養培地を、1％（v / v）のPSGを、1％（v / v）の非必須アミノ酸の、1％（v / v）のピルビン酸ナトリウム、および5％（v / v）のhu男性（siRNAのための）血清または20％（プラスミド用）（v / v）のヒト血清、2.5 ngの/ mlのPMA、および50μMβ-メルカプトエタノール; 2つの12ウェルプレートに1つの6ウェルプレートまたは4ミリリットル/サンプルのいずれかのため3ミリリットル/試料の最終容量を準備する。 </li></ol></li><li>室温で300×gで5分間遠心し、細胞懸濁液。 </li><li> 37℃に予め温めRPMI培地1ml中を吸引のAccutase I再懸濁細胞;細胞数を決定するために、細胞を計数。 注：高速自動細胞計数手順が使用される場合、2.4およびステップ2.5を省略してもよいし、細胞を剥離がのAccutase Iへの長期暴露が回避されることを条件直後にカウントすることができる。 </li><li>各トランスフェクションサンプルについて2.0〜2.5×10 6個の細胞を含む遠心管に分注しを準備します。 </li></ol> THP-1マクロファージの3ヌクレオ<ol><li>室温で250×gで10分間遠心操作は、すべての分量。 </li><li>ヌクレアーゼフリーでプラスミドDNAまたはsiRNAを希釈水または適当な緩衝液。可能な限り小さくプラスミドDNAまたはsiRNAの必要量を保管してください。 </li><li>各トランスフェクションのためのsiRNA1μgのか、プラスミドDNAの0.5μgのいずれかで1ヌクレオキュベットを準備します。 </li><li>一度に一つのトランスフェクションを実行します。細胞アリコートからの上清を吸引し。 </li><li> DNA / siRNAおよびヌクレオフェクター溶液100μlの全容積を得たヌクレオフェクター溶液中でペレット化した細胞を再懸濁する。最小限に純粋なヌクレオ溶液への曝露時間を維持し、露光時間が15分を超えないことを保証する。 </li><li>穏やかなタッピングによるヌクレオキュベット中に再懸濁細胞とDNA / siRNAのミックス。 </li><li>ヌクレオ2bの装置におけるプログラムY-001を実行することによって細胞をトランスフェクトする。 </li><li>使い捨てのプラスチック製パスツールピペットを用いて反応バイアルにトランスフェクトされた細胞を移す。 </li><li>すぐに準備されたトランスフェクション培地500μlを加える。 </li><li>繰り返しは、各トランスフェクションサンプルに対して3.4〜3.9を繰り返します。 </li></ol><ol><li>トランスフェクトされた細胞について6ウェルまたは12ウェルプレートのどちらかを準備します。ピペット12ウェルプレートの各ウェル（1ウェル/トランスフェクション）に6ウェルプレート（1ウェル/トランスフェクション）またはトランスフェクション培地1.75mlを各ウェルにトランスフェクション培地を2.5ml。 </li><li>マイクロピペットで十分に細胞懸濁液を混ぜる。 </li><li>準備されたウェル（12ウェルプレート中の6ウェルプレートまたは2におけるつのウェルのいずれか）にトランスフェクト細胞を移す。 </li><li>加湿インキュベーター（5％CO 2、37℃）で4時間培養する。 </li><li>微視的細胞の再付着を確認してください。 注：細胞の大部分が再び付着性であるべきである。時折、1時間までの潜伏期間を延長することは不十分な再付着の場合には接着細胞の数を増加させる。 </li><li>慎重にマイクロピペットでトランスフェクション培地を吸引し、培養培地の等量交換してください。一度に吸引するだけでなく。 </li> &lt;李&gt;は、プラスミドまたはsiRNA（24〜72時）の最大効果のために必要な時間のために細胞を培養する。潜伏期間が48時間を超えた場合、48時間後に培地を交換してください。 </li><li>エフェクターと追加の治療のために（ 例えば 、サイトカイン、アゴニスト、アンタゴニストおよび阻害剤）は、PMAなしの無血清培地とβ-メルカプトエタノールを使用しています。時間は、プラスミドまたはsiRNAの最大効果の経時エフェクタのインキュベーション期間の終わりとは、媒体に応じて、エフェクターの追加の変化を計画しています。 24時間よりも長い間、無血清の条件下で細胞を維持しないでください。 </li></ol>

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	<li>Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+diversity+in+renal+injury+and+repair.">Macrophage diversity in renal injury and repair.</a> J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Morille, M., Passirani, C., Vonarbourg, A., Clavreul, A., Benoit, J. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+activators.">Development of novel adenosine monophosphate-activated protein kinase activators.</a> J Med Chem. 53 (6), 2552-2561 (2010).</li><li>Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+THP-1+differentiation+is+required+for+the+detection+of+responses+to+weak+stimuli.">Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli.</a> Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).</li><li>Mae&#223;, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+PMA+enhances+the+responsiveness+of+transfected+THP-1+macrophages+to+polarizing+stimuli.">Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli.</a> J Immunol Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).</li><li>Angosto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+inflammasome+functions+in+vertebrates:+Inflammasome+and+caspase-1+trigger+fish+macrophage+cell+death+but+are+dispensable+for+the+processing+of+IL-1b.">Evolution of inflammasome functions in vertebrates: Inflammasome and caspase-1 trigger fish macrophage cell death but are dispensable for the processing of IL-1b.</a> Innate Immun. 18 (6), 815-824 (2012).</li><li>Latz, E., Xiao, T. 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ここで概説したプロトコルは、通常、トランスフェクションがかなり困難であるTHP-1マクロファージをトランスフェクトする信頼性の高い効率的な方法を提示します。トランスフェクションは、細胞の生命力の有意な減少なしにsiRNAの90％を超えるトランスフェクション効率を達成することができる。プラスミドについて効率は、そのサイズが少ないためであり得るが、70％程度のトランスフェクション効率は、通常、達成することができる。 siRNA媒介ノックダウンの効率は適用されたsiRNAに応じて百分の80から90まで到達することができます。このプロトコルの主な利点は、細胞分化を妨害しないことである。トランスフェクション後、細胞は、依然として12分化剤PMA（1Bと図4に図1A）に正常に応答。これはまた、トランスフェクションA後の培養のために選択された媒体に強く依存するが、加えて、そのようなIL10またはLPS /IFNγなどのサイトカインの刺激による細胞分極は、12影響を受けません図4に示す。■。 特定の要件にプロトコルを適合させるために修飾することができるプロシージャ内のいくつかのオプションがあります。 図4に示すように細胞をトランスフェクションした後、選択培地に応じて、同じIL10刺激に異なって反応する。これは培地組成が細胞挙動に強い影響を持っていることを示している。媒体によって課される効果は、さまざまな実験的な刺激のために異なるかもしれないので、それは最適な媒体が変更される可能性があることが可能であり、したがって、独立して、異なる実験のために培地の適合性を検証する必要がある。しかしながら、THP-1細胞の培養に使用されるデフォルトの媒体であるRPMI-1640培地は、細胞活力の有意な損失が観察されたように、トランスフェクション後の培養には不向きであることが証明された。さらに、プロトコルはまた、前のPMA誘導性分化せずにTHP-1単球に適用することができ、これを明らかに手順の間の細胞剥離の必要性を除去するが、残りのすべての手順を調整する必要はありません。必要に応じて、THP-1単球を、その後分化させることができる。 プロトコルの最も重要な要素は、まず、剥離および第二に、トランスフェクションのために必要な時間である。剥離が高い細胞生存率を維持するために、できるだけ穏やか行わなければならない。そこで私たちは、私のAccutaseオーバーな​​ど、トリプシン処理として非常に攻撃的な方法によって、比較的温和な酵素脱離することをお勧めします。そのようなリドカインまたはスクレーピングによる治療などのさらなる剥離法は、むしろ有害であることが判明したため、使用しないでください。のAccutase I治療の30分すべての細胞を剥離するのに十分であるべきではない場合に正しく、これは通常、誤って格納されている、または期限切れのAccutase I溶液またはあまりにも多くの凍結融解サイクルの指標である。私たちは、-20°でのAccutase私の小さなアリコートを格納することにより、良好な結果を得たCは、凍結融解サイクルの回数を減少させる。しかし不十分な剥離新鮮なのAccutaseでのAccutase私を交換するか、1時間までのインキュベーション時間を増やすのいずれかがある場合もございます。加えて、フラスコまたはプレートを穏やかにタッピングやリンスを脱離を支援することができます。トランスフェクションのための必要な時間に関する純粋なヌクレオ溶液への細胞の曝露時間は、できるだけ短くする必要があり、したがって細胞の生存に大きな影響を持っている。これを達成する最良の方法は、時間並行して（ステップ2.10から2.15）ではなく、複数のトランスフェクションでのそれぞれのトランスフェクションを行うことである。 ノックダウン効率が低い場合、これは通常、低いトランスフェクション効率によるものではないが、これは容易にフローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡使用して検証し、蛍光標識siRNAまたはGFPをコードするプラスミドを標識することができる。大部分の原因は、非効率的なsiRNA又はプラスミドDNAである。これらの状況下では、（2-3μgのまで）siRNAの量を増加させるために考慮されるべきであるか（1-2μgのまで）プラスミドDNAまたは利用可能な場合は、別のsiRNAまたは発現ベクターを使用します。代替的に、満足な結果は、同じターゲットに対して向け複数の異なるsiRNAのプールを使用することによって達成され得る。さらに、経時変化実験は、正確には、通常、トランスフェクション後24〜72時間後に達した最大効果の期間を決定するために必要とされる場合があります。 別にトランスフェクションからのエレクトロポレーションによって哺乳動物細胞のトランスフェクションのための更なる十分に確立された技術がある。頻繁に適用されるシステムは、貨物核酸と複合体を形成した後、細胞内への輸送を容易にすることができる化学的トランスフェクション剤である。最も一般的に使用される試薬は、異なる脂質種に基づいているか、カチオン性ポリマー3の数から選択することができる。両方が多様な選択に近づくために市販されている。これらのトランスフェクション試薬は、それらが通常であるという利点を提供使いやすく、多くの時間を必要としないため、剥離の必要性を取り除くだけでなく、接着細胞を扱う。残念ながら、マクロファージは、それらがインビトロで有意に増殖し、外来DNAの細胞質ゾル13-15に対して向けられた防御機構を持たないように、これらの方法によってトランスフェクトすることがかなり困難である。したがって、化学的トランスフェクションアプローチは、しばしば、細胞生存率の著しい減少をもたらす。しかしながら、図2に示すようにそこに成功マクロファージへのsiRNAを転送することができ、化学的トランスフェクション剤があるが、フローサイトメトリー（ 図2A）および蛍光顕微鏡（ 図2B）の分析は、それらが細胞内のsiRNAの同一の均一な分布を達成することができない示すようヌクレオにより得られた。実際には、フローサイトメトリーデータは、トランスフェクトされた細胞の二つの異なる集団がNucleofecti後の細胞と同様の蛍光を有する集団まず、起こることを示しているオンが検出され、第二に、より強い蛍光を持つ人口があります。明確な確認がまだ必要であるが、私たちは、第一集団は、蛍光顕微鏡で第二集団は、おそらく非常に明るい凝集体を持つ細胞に相当する細胞質ゾル内の蛍光siRNAの均一な分布を示し、これらの細胞と同一であると仮定します。 図2Aに示すフローサイトメトリーのデータは、代替リポフェクション法よりも細胞あたりの少ないsiRNA中のヌクレオ結果。しかし、図3のデータは、ヌクレオとして援用するsiRNAであっても、比較的少量既に標的遺伝子の80〜90％のノックダウンのために十分であることを示している。したがって、化学的トランスフェクション後の第二の集団として援用siRNAの追加の量は非常に可能性が余剰であり、従って、更なる増加ノックダウン効率よりも望ましくない副作用を引き起こす可能性が高くなる。それとは別にこれらのsiRNA分子は、機能または遊離siRNA分子よりも少なくとも効率が低い可能性があり、オフターゲット効果を引き起こす可能性があるため、細胞内凝集体の形成は、それ自体が既に望ましくない。さらに、これらの凝集物の真の性質はまだ明らかではない。それは、これらの明るいスポットがsiRNAが細胞によって内部が、その後エンドソームからの放出されたことを示すエンドソームに失敗し、siRNAは、閉じ込められたため、効果がないまま表現している可能性があります。あるいは、スポットは、細胞内で形成される凝集体である可能性があります。化学トランスフェクションの機能評価は、したがって、ノックダウン効率に決定的な文はまだ二つの異なる集団の存在が、これはすべての結果は両集団の平均を記載していることを意味する、既に好ましくない、まだ作ることができない、保留されている、これはそのために対応していない集団のいずれか。そのためヌクレオは、優れたアプローチである。 <p clお尻は= &quot;jove_content&quot;&gt;それにもかかわらず、ここで説明トランスフェクション法には限界もあります。細胞は、ヌクレオ接着細胞が細胞に追加の応力係数を提示する、脱着する必要が懸濁液である必要があるからである。さらにプロトコル全体はかなり時間がかかります。 10実験当たり - トランスフェクションを同時に行うが、細胞の損傷を避けるために迅速に実行する必要はできないので、サンプル数は約8に制限されている。したがって、このプロトコルは、ハイスループットスクリーニングプロジェクトには適していない。高スループットのアプリケーションでは異なるヌクレオシステムが用意されています。まず、16ウェルストリップ·フォーマットを提供しています4D-ヌクレオシステムがあります。さらに大きなスループットを得るため、96ウェルシャトルシステムと384ウェルのHTヌクレオシステムがあります。しかし、これらの新しいシステムは、アルミニウム、したがって電気的条件、 すなわちプログラムやcomposの代わりに導電性ポリマー電極を用いて作業するヌクレオソリューションのitionは、それが私たちのプロトコルは、それらのシステムに転送することができるかどうかを決定する必要がある、それに応じて変更されています。 しかし、これらの制限にもかかわらず、ここに提示プロトコルは、すべての他の非ウイルス的アプローチよりも優れているTHP-1細胞の信頼性のある効果的なトランスフェクションを生じない。このプロトコルは、他のすべての面で差別化し、普通に偏光するため、可能な限りトランスフェクションの少ない副作用として表示THP-1細胞における遺伝子発現の変化の影響の調査を可能にします。

ヒト免疫系の細胞成分の中で、マクロファージは、先天性免疫応答のために非常に重要である。彼らのタスクは多様である。彼らは、組織恒常性において重要な役割を果たし、免疫応答1を調整し、調整するために多数のサイトカインを産生し、分泌し、病原体及び壊死物質の食作用に関与している。したがって、マクロファージは、一体的に、多くの生理学的プロセスおよび病態生理学的状態に関与している。それらの作業の多様性に、マクロファージは非常に異質で多面細胞型である。これは、異なる偏光によって達成される。外部刺激のマクロファージに応じて異なる表現型2内に開発することができます。免疫応答に対するマクロファージ &#39;変動性と影響、それらは非常に興味深い研究対象にする。彼らの複雑な代謝および調節機能を解明するために、in vitroモデル内の適切なマクロファージはREQです正しくマクロファージの不均一や変動性を反映しているuired。 細胞遺伝子の発現を変更するために、プラスミドDNAベクターまたは小さな干渉RNA（siRNA）を用いた細胞のトランスフェクションは、遺伝子調節、遺伝子機能の両方を調査するための細胞生物学で広く使用される強力なツールとなっている。現在、真核細胞のトランスフェクションのための利用可能なさまざまなツールの大規模な選択があります。これらのツールは、（核酸と複合体を形成することができるポリマーまたは脂質に依存している）ウイルスベクター（例えば、遺伝子銃など）機械的方法、化学的ア ​​プローチの適用、およびセル3のエレクトロポレーションが含まれる。これらのアプローチの全ては、それぞれの長所と短所があり、特定の細胞型およびアプリケーションのためにこの広い配列から最適なを選択することが困難で時間のかかるプロセスであることができる。 マクロファージは、ほぼすべての十分に確立されたtransfeをトランスフェクションが困難であることが知られてctionアプローチは大幅にマクロファージ&#39;の生存率を低下させるか、その行動を妨害する、 すなわち分化及び特定の偏光における。したがって、ここではDNA量の減少を必要とする最適化されたエレクトロポレーションアプローチを表し、エレクトロポレーション、ヌクレオベース技術を用いてヒトTHP-1マクロファージをトランスフェクトするための効率的な、非ウイルス性プロトコルを提示する。クレオは、単球やマクロファージなどの感受性細胞に非常に適している。このプロトコルは、以前に公開されたバージョン4,5を最適化したものです。 要するに、ホルボール12 - ミリステート13 - アセテート（PMA）は、従来siRNAまたはプラスミドDNAでのトランスフェクションに未熟マクロファージへの48時間のヒトTHP-1単球を区別するために使用される。トランスフェクションのために未分化マクロファージのAccutase I処理により酵素的に切り離されている。トランスフェクションは、細胞のエレクトロポレーションのためのヌクレオ2bの装置を用いて行われる。トランスフェクションの後、異なる必要に応じてentiationは、別の24〜48時間継続される。最後に、成熟したトランスフェクトされたマクロファージは、機能的研究のための化合物の異なる種類と共にインキュベートする。 このアプローチは、ヒトTHP-1単球およびマクロファージのような細胞株のトランスフェクションを可能にし、正常に過去6-10に適用されている。ほとんどの化学的トランスフェクションアプローチとは対照的に、未熟マクロファージを使用して私たちの修正されたヌクレオ手順は、ウイルスベクターを使用するか、または未知の副作用がさらに担体化合物を添加する必要なしに、損なわれていない細胞の生存率と組み合わせた高トランスフェクション効率をもたらす。また、マクロファージは、このように、トランスフェクション11以下のスムーズな機能の調査を可能にするそれらの完全な差別化のための可能性だけでなく、偏光を保持します。 さらに、ヌクレオ後に適用細胞培地を強くトランに続く機能的研究に影響を与えsfection;特に、偏光のためのマクロファージの能力が適用培地に依存して影響を受ける可能性がある。ここで、細胞培養培地の4つの異なるタイプが（IMDM、X-VIVO 20、LGM3およびマウスT細胞のNucleofector培地）THP-1マクロファージを用いたインターロイキン（IL）10を用いて不活性化する条件下で試験した、私たちはIL10に対する細胞の応答性があることが観察さマウスT細胞のNucleofector媒体は、上述した他の培地と比較して使用される場合、最も強い。これらの結果は、これらが大幅に実験結果を改善することができるように、すべての細胞培養条件の適切な最適化が成功したトランスフェクションundの後続の機能的研究のために必須であることを示している。 マクロファージは、さまざまなヒト疾患に関与しているように、多くの研究が、マクロファージの行動だけでなく、マクロファージによって制御マクロファージまたは順番に影響を与える規制的なメカニズムの解明に焦点を当てています。したがって、このプロトコルは、で関連性がある多くの異なった研究分野。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Accutase I</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">A6964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Amino acids, nonessential</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">M11-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal calf serum (FCS gold)</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">A15-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Human Monocyte Nucleofector Kit</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">VPA-1007</td>
			<td>Contains Nucleofector Solution, cuvettes and Pasteur pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Human serum off the clot</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">C11-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Isove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3)</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">CC-3211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Mouse T Cell Nucleofector Medium</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">VZB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nucleofector 2b</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">AAD-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin / Streptomycin / L-glutamine (100&#215;)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">BP685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640)</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">E15-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">siRNA / plasmid</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">THP-1 human leukemia monocytes</td>
			<td style="width:145px;">CLS</td>
			<td style="width:145px;">300356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tissue culture flasks (75 cm&#178;; 150 cm&#178;)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP90076/TPP90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tissue culture plates (6-well; 12-well)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP92406/TPP92012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tubes (1.5 ml)</td>
			<td style="width:145px;">StarLab</td>
			<td style="width:145px;">S 1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">X-Vivo 20 with Gentamycin</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">BE04-448Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly efficient transfection of human thp-1 macrophages by nucleofection

マクロファージは、先天性免疫応答のキープレーヤーとして、組織の恒常性やさまざまな病状を扱う研究の焦点である。 siRNAおよびプラスミドDNAを用いたトランスフェクションは、それらの機能を研究するための効果的なツールですが、マクロファージのトランスフェクションは、些細な問題ではありません。真核細胞のトランスフェクションのための多くの異なったアプローチが利用可能であるが、わずか数は、マクロファージの信頼性と効率的なトランスフェクションが、減少した細胞の活力と頻繁に観察され、分化や偏光のために減少した能力のような深刻な改変された細胞の挙動を可能にする。従って、トランスフェクションプロトコールは、このように正常な細胞挙動の文脈におけるsiRNAの効果またはプラスミドの調査を可能にする重大な副作用を引き起こすことなく、マクロファージへのsiRNAおよびプラスミドDNAを伝達することが可能であることが要求される。ここに提示されたプロトコルは、確実かつ効率的にヒトTHP-1マクロファージおよびカをトランスフェクトするための方法を提供高い細胞活力、高いトランスフェクション効率、および細胞の挙動に最小限の影響でnocytes。このアプローチは、ヌクレオに基づいており、プロトコルは、トランスフェクション後、細胞活性化のための最大能力を維持するために最適化されている。プロトコルは、接着性剥離後の細​​胞ならびに懸濁液中の細胞のために適切であり、小型の媒体にサンプル番号のために使用することができる。このように、提示された方法は、マクロファージ分化と偏光の間に遺伝子調節の効果を調査するのに便利です。別に代替化学的方法と比較してこのプロトコルに従ってトランスフェクションしたマクロファージを特徴付ける結果を提示から、細胞の挙動上のトランスフェクション後の細胞培養培地の選択の影響も議論されている。提示されたデータは、さまざまな実験的な設定のための選択を検証することの重要性を示している。

siRNAを用いたTHP-1マクロファージのトランスフェクションのために、このプロトコルを使用して、私たちは通常、細胞の活力を大幅に削減することなく、90％以上のトランスフェクション率を達成。 図1は、非トランスフェクトに対するsiRNAを蛍光標識して、トランスフェクション後の細胞の状態の24時間を特徴付ける代表的なデータを示しているクレオ試薬およびパルスまたはsiRNAで処理したが、トランスフェクトサンプルとして培養培地のすべての変更を受け取っていなかったコントロール、。 図1Aに細胞形態は、フローサイトメトリー測定により示されている。顕微鏡画像を図1（b）に示す1Cおよび1Dは 、アポトーシス（コントロール：1.5％;ヌクレオ：5.4％）のための低金利表す図 。：;：影響を受けた細胞の活力を示すと壊死（3.2％対照ヌクレオ2.0％）。トランスフェクトされたTHP-1マクロファージがもっとあるので壊死とアポトーシスは、トランスフェクションサンプルに対してわずかに高い着脱が増加中の細胞の損傷の確率こうして、非トランスフェクト細胞よりも取り外すのは困難。最後に、トランスフェクション効率は、 図1Eに示されている。全体のトランスフェクトされた集団は対照に対してシフトされるように、これは全ての細胞が蛍光顕微鏡像（ 図2B）によって確認されたトランスフェクトされることを示している。フローサイトメトリーデータと同様に蛍光顕微鏡画像の両方は、全ての細胞が一貫してセル間だけでなく、細胞内でのsiRNAの均一な分布をトランスフェクトすることを示している。これは、比較図2Aおよび2Bのための脂質ベースのアプローチを用いて化学トランスフェクション剤のためのそれぞれのフローサイトメトリーデータ及び蛍光顕微鏡画像を示す、多くの化学的トランスフェクション試薬とは対照的である。これらの図は、トランスフェクトされた細胞の二つの異なる集団を検出することができることを示している。最初の人口はFolloのトランスフェクションされた細胞に似ているウイングヌクレオ。それらは、低い全体的な蛍光および細胞内のsiRNAの均一な分布によって特徴付けられる。第二の集団は、siRNAの非常に明るい細胞内凝集体に由来する、より強い蛍光でマークされています。 図2Cにおける微分干渉コントラストで示すように、細胞の形態は、両方のトランスフェクションアプローチの影響を受けません。効果的に同様の結果をプラスミドDNAの収量を用いたトランスフェクションは、例についてRobenek ら （2009）9または謝を参照してくださいら （2006）7。 トランスフェクション後の細胞培養培地の選択は、非常に関連性がある。したがって、異なる細胞培養培地は、比較して試験した。選択されたメディアは、すべてのTHP-1細胞の培養に適しており、ポストヌクレオ栽培に適用媒体としてロンザの推奨に従って選択した。 図3は、siRNAのmediatを表すedはIL10RB（インターロイキン10受容体β鎖）のmRNAに対するsiRNAを使用して、効率をノックダウン。試験したすべてのメディアのIL10RBの発現は、対照レベル（ 図3）の10〜20％に減少した。しかし、トランスフェクトされた細胞は、偏光に対するそれらの潜在的な培養培地に応じて異なる。非特異的コントロールsiRNAまたはIL10RB特異的siRNAのいずれかでトランスフェクトしたTHP-1マクロファージは、トランスフェクション後、異なる媒体で栽培し、IL10で処理した。続いて、mRNAレベルでのIL10誘導遺伝子SOCS3（3サイトカインシグナル伝達の抑制因子）の発現レベルをRT-qPCRにより測定した。培養培地との違いは、SOCS3 mRNA発現の誘導の程度に関して発生する（ 図4）、テストされたメディアのマウスT細胞のNucleofector媒体のそれぞれについて、帰納、LGM3、X-VIVO 20とIMDMであった19.5 [17.7から21.5 ]、11.5 [8.5から15.7]、8.0 [4.6から14.2]と7.2 [5.6から9.5]は、それぞれ、倍。ザ·マウスT細胞のNucleofector媒体のreforeアプリケーションが不可欠です。 IL10治療が観察した後に加えて、SOCS3発現に対するIL10RBのノックダウンの効果の違いは、SOCS3 mRNAの発現レベルは、9.5 [8.8から10.3】マウスT細胞のNucleofector媒体に折り、2.1 [1.1から4.1]倍に減少したLGM3で、4.8 [3.2から7.2、X-VIVO 20および3.3 [2.7から3.9]中折りIMDM中で折る。これらの値は、それぞれ49％、18％、60％、45％、異なる媒体におけるSOCS3の発現の減少に相当する。 IL10RB siRNAのトランスフェクション後のIL-10誘導性のSOCS3発現の減少は、トランスフェクションによるIL10RBが正常にダウンレギュレーションを確認します。 <img alt="図1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" width="300" /> トランスフェクトされたTHP-1マクロファージの図1。キャラ。光学顕微鏡によって明らかにし、フローサイトメトリーは、トランスフェクトしていない共同の分析として細胞の特徴的状態が影響を受けない提示されたプロトコールに従ってトランスフェクションしたTHP-1マクロファージに対するntrol細胞。 THP-1マクロファージは、48時間10ng / mlのPMAで分化し、蛍光標識（アレクサ488）、非特異的対照siRNAをトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後のいずれかの生細胞の画像は、（B）撮影された、または細胞がIのAccutase処理によって剥離し、フローサイトメトリー（A）により分析した。アポトーシスおよび壊死染色、アネキシンV-フィコエリトリン（PE）（C）および7 -アミノアクチノマイシン（7-AAD）（D）を用いて行った。トランスフェクション効率（E）は、siRNAと取り付けられた蛍光標識を用いたフローサイトメトリーによって決定した。トランスフェクトした細胞（黒色）の蛍光信号は、制御信号（灰色）に対して示されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" fo:content-width = &quot;4インチ&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 51960 / 51960fig2highres.jpg&quot;幅= &quot;400&quot; /&gt; リポフェクション対ヌクレオ後のsiRNAの細胞内分布の図2の比較。THP-1細胞は、このプロトコルに従って48時間分化し、その後ヌクレオによって、またはリポフェクションのいずれかによってトランスフェクトした。提示リポフェクション結果は4のsiRNAと試薬の仕込み比で、製造業者の推奨に従ってXtremegene siRNAのキットを用いて得られた：1。トランスフェクション細胞から24時間後のいずれか、フローサイトメトリー解析のためのAccutase私で剥離または生細胞を用いて顕微鏡的に評価した。集団内の（A）トランスフェクション効率および細胞当たりのsiRNAの分布は、siRNAと取り付けられた蛍光ラベルを使用してフローサイトメトリーによって決定した、siRNAでトランスフェクトすることなく、コントロールは灰色で表示され、siRNAをトランスフェクト試料は、黒で示されている。 （B）蛍光顕微鏡siRNAの（アレクサフルオロ488）蛍光標識の細胞内分布を示す画像。スケールバーは40μmでを表します。 （C）蛍光画像に応じた微分干渉コントラスト像;スケールバーは40μmでを表しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" width="500" /> トランスフェクトされたTHP-1マクロファージにおけるIL10RBの図3 siRNA媒介ノックダウン。THP-1マクロファージを概説したプロトコルに従ってトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をプロトコールセクションで説明したように補充し、LGM3（C）、及びX-VIVO 20（D）は、4つの異なる培養培地、すなわちマウスT細胞ヌクレオ培地（A）、IMDM（B）中で培養した。 C言語のエルどちらか非特異的対照siRNA（Ctrlキー）またはIL10RB特異的siRNA（IL10RB）でトランスフェクトした。パルス制御、 すなわち 、次のサンプルが含まれていた追加の対照として。 siRNAは（パルス）の欠如、及び媒体制御でトランスフェクションを受けた細胞、 すなわち 。培地の変更のみを受信し、それ以外は未処理のままの細胞。 24時間のトランスフェクション後に細胞をさらに24時間50ng / mlのIL10を含むまたは含まない無血清培地中でインキュベートした。 IL10RB発現をRT-qPCRにより測定した;図は、3つの独立した実験の平均値は、エラーバーは平均の標準誤差を表す示す。 * はp &lt;0.05; ** はp &lt;0.01; *** はp &lt;0.001対Ctrlキー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" width= &quot;500&quot; /&gt; トランスフェクトされたTHP-1マクロファージにおけるIL10RBのノックダウン後にSOCS3の図4 IL10依存性調節。THP-1マクロファージは記載されているプロトコルに従ってトランスフェクトした。トランスフェクション細胞は、4つの異なる培養培地マウスT細胞ヌクレオ培地（A）、IMDM（B）で培養した後のプロトコールセクションで説明したように、LGM3（C）及びX-VIVO 20（D）を補充。細胞は、いずれの非特異的対照siRNA（Ctrlキー）またはIL10RB特異的siRNA（IL10RB）でトランスフェクトした。追加の対照として、以下のサンプルが含まれていた： すなわちパルス制御、新羅（パルス）の欠如、及び媒体制御でトランスフェクションを受けた、すなわち細胞を、。培地の変更のみを受信し、それ以外は未処理のままの細胞。 24時間のトランスフェクション後に細胞をさらに24時間50ng / mlのIL10を含むまたは含まない無血清培地中でインキュベートした。 SOCS3のexpressionをRT-qPCRにより測定した;図は、3つの独立した実験の平均値は、エラーバーは平均の標準誤差を表す示す。 *、＃ はp &lt;0.05; **、## はp &lt;0.01; ***、### Ctrlキー対と対のp &lt;0.001はCtrl + IL-10であった。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

このプロトコルは、高い細胞活力と分化と偏光のための完全なマクロファージの容量を維持しつつ、高いトランスフェクション効率でエレクトロポレーションによってsiRNAまたはプラスミドDNAを用いたヒトTHP-1マクロファージをトランスフェクションするための効率的で信頼性の高い手法を提案する。

ヌクレオによるヒトTHP-1マクロファージの高効率トランスフェクション

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

highly-efficient-transfection-human-thp-1-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

46.2K ビュー.  Friedrich Schiller University Jena. このプロトコルは、高い細胞活力と分化と偏光のための完全なマクロファージの容量を維持しつつ、高いトランスフェクション効率でエレクトロポレーションによってsiRNAまたはプラスミドDNAを用いたヒトTHP-1マクロファージをトランスフェクションするための効率的で信頼性の高い手法を提案する。 

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A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

成人肝細胞の混合初代培養からマクロファージを分離するためにシンプルかつ効率的な方法

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

免疫・感染学

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

細胞の成熟せずに樹状細胞の効率的なトランスフェクションに最適化されたプロトコル

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

フローサイトメトリーによるヒト好中球の核因子の活性を検出するために簡単で効率的な方法

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

設立<em&gt;インビトロ</em&gt;システムの細胞内挙動を研究するために、<em&gt;カンジダ·グラブラタ</em&gt;人間のTHP-1マクロファージにおける

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

ダブル勾配遠心、テフロンコーティングされた細胞培養バッグ中のマクロファージへの分化によるヒト単球の単離

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

2D電気泳動によるマクロファージのプロテオームプロファイリング

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

フローサイトメトリーによるラットの腎臓からのマクロファージの表現型の特徴

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

次世代エレクトロポレーションによって初代ヒトTh17細胞の小さなRNAのトランスフェクション

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution of inflammation. Accumulation of apoptotic debris in the body may trigger chronic inflammatory responses that lead to systemic autoimmune diseases over time. Impaired apoptotic cell clearance has been implicated in a variety of autoimmune diseases. Apoptotic clearance is a complex process rarely detected under physiological conditions. It involves abundant surface receptors and signaling molecules. Studying the process of apoptotic cell clearance provides insightful molecular mechanisms and subsequent biological responses, which may lead to the development of new therapeutics. Here, we describe protocols for the induction of apoptotic thymocytes, the preparation of peritoneal macrophages, and the analysis of apoptotic cell clearance by flow cytometry and microscopy. All cells will undergo apoptosis at a certain stage, and many residential and circulating cells can uptake apoptotic debris. Therefore, the protocol described here can be used in many applications to characterize apoptotic cell binding and ingestion by many other cell types.

Here, we present a protocol to prepare apoptotic thymocytes and peritoneal macrophages and analyze the efficiency of efferocytosis and the specific inhibitor-mediated blocking of apoptotic thymocytes engulfment. This protocol has a broad application in cell-mediated clearance of other particles including artificial beads and bacteria.

マクロファージに貪食アポトーシス胸腺細胞の実験的解析

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...