אנו מודים לLonza גרופ בע&quot;מ להנותנים חסות פרסום זה על ידי כיסוי עלויות הפרסום. אנו מודים לדויטשה Infarktforschungshilfe, וילהלם-Vaillant-Stiftung, ארנסט-סולביי-Stiftung, וMinisterium Thuringer für Bildung, דעם und Kultur לתמיכה כספית לSL.

.1 Predifferentiation של המקרופאגים THP-1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטפח THP-1 תאים בינוניים RPMI-1640 תוספת 10% (v / v) עוברי עגל בסרום (FCS) ו1% (v / v) פניצילין / סטרפטומיצין / L-glutamin (PSG) ב CO 2 (5% חממה) בשעה 37 C °. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני transfection, לפצל תאים ולהעבירם למדיום RPMI טרי כמו קודם. לטפח תאים ל24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע 1.0-1.5 x 10 7 תאים לתוך בקבוק תרבית רקמת 75 סמ&quot;ר או 2.5 x 10 7 תאים לתוך בקבוק תרבית רקמה 150-סמ&quot;ר במדיום RPMI-1640 ולהוסיף 10% (v / v) FCS, 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) פירובט נתרן, 1% (v / v) חומצות אמינו חיוני, 10 ng / ml PMA, וβ-mercaptoethanol 50 מיקרומטר ל48 שעות. </li></ol> 2 הכנת nucleofection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח Accutase אני וכל מדיה לתוך אמבט מים על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיום התרבות לשאוב מבקבוק ולהחליף עם 6 מ&quot;ל (בקבוק 75 סמ&quot;ר) או 12 מ&quot;ל (בקבוק 150 סמ&quot;ר) שלAccutase אני ודגירה של 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס במשך ניתוק מלא של תאים. שים לב תא מורפולוגיה לאחר Accutase אני טיפול כדי להבטיח שיש לי תאים מראה עגול. אם חלק מהתאים מופיעים עדיין להיות מחוברים, לשטוף בזהירות את הבקבוק עם micropipette או לטפוח בעדינות את זה כדי להשלים את הניתוק. אין להשתמש במגרדי תאים, כמו זה שיש לו השפעה שלילית על חיוניות תא. העבר את ההשעיה תא צינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך Accutase אני טיפול, להכין את המדיה הבאה: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום transfection: מדיום תרבות תא תוסף עם 1% (v / v) PSG, 1% (v / v) (V / V) בסרום אנושי של חומצות אמינו חיוניות, 1% (v / v) פירובט נתרן, ו -5% (לsiRNA) או 20% (v / v) בסרום אנושי (לפלסמיד דנ&quot;א); להכין נפח סופי של שני 3 מ&quot;ל / מדגם לצלחת אחת 6 היטב או 4 מ&quot;ל / מדגם לשתי 12 גם צלחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין מדיום טיפוח: מדיום תרבות תוספת עם 1% (v / v) PSG, 1% (v / v), 1% (v / v) פירובט של חומצות אמינו חיוניות נתרן, ו -5% (v / v) huסרום אדם (לsiRNA) או 20% (v / v) בסרום אנושי (לפלסמיד), 2.5 ng / ml PMA, ו50 מיקרומטר β-mercaptoethanol; להכין נפח סופי של שני 3 מ&quot;ל / מדגם לצלחת אחת 6 היטב או 4 מ&quot;ל / מדגם לשתי 12 גם צלחות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השעיה תא צנטריפוגה במשך 5 דקות ב XG 300 בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים לשאוב Accutase אני וגלול ב 1 מ&quot;ל של מדיום RPMI מחומם מראש ל37 ° C; לספור תאים כדי לקבוע מספר תא. הערה: כאשר נהלי ספירת תאים אוטומטיים מהירים משמשים, על שלבים 2.4 ו2.5 עשויים להיות מושמטים וניתן לספור תאים מייד לאחר ניתוק ובלבד שחשיפה ממושכת לAccutase אני נמנעת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל דגימת transfection להכין aliquots בצינורות צנטריפוגה מכילים 2.0-2.5 x 10 6 תאים. </li></ol> .3 Nucleofection של המקרופאגים THP-1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה כל aliquots 10 דקות ב 250 XG בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל פלסמיד דנ&quot;א או siRNA בnuclease ללא<html> מים או מאגר מתאים. שמור את הנפח הנדרש של פלסמיד דנ&quot;א או siRNA קטן ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן אחד קובט Nucleofector גם עם 1 מיקרוגרם של siRNA או 0.5 מיקרוגרם של פלסמיד דנ&quot;א לכל transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע transfection אחד בכל פעם. supernatant לשאוב מaliquot התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאי pelleted בפתרון Nucleofector להניב היקף כולל של של DNA / siRNA ופתרון Nucleofector 100 μl. שמור את הזמן של חשיפה לפתרון Nucleofector הטהור למינימום ולהבטיח שזמן חשיפה אינו עולה על 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים תאי resuspended וDNA / siRNA בקובט Nucleofector על ידי הקשה עדינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Transfect על ידי ביצוע תכנית Y-001 במכשיר 2b Nucleofector. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את תאי transfected לתוך בקבוקון תגובה באמצעות טפטפות פסטר מפלסטיק חד פעמי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד להוסיף 500 μl של מדיום transfection מוכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 3.4-3.9 עבור כל דגימת transfection. </li></ol>ילדה = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. פוסט nucleofection טיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן צלחות או 6 גם או 12 גם לתאי transfected. פיפטה 2.5 מ&quot;ל של מדיום transfection לבאר כל צלחת 6 היטב (1 היטב / transfection) או 1.75 מ&quot;ל של מדיום transfection לבאר כל צלחת 12 גם (2 בארות / transfection). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים השעיות תא ביסודיות עם micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את תאי transfected לתוך הבארות מוכנות (או גם אחד בצלחת 6 היטב או שתיים בצלחת גם 12). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות במשך 4 שעות בחממה humidified (5% CO 2, 37 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק שחיבור של תאים מיקרוסקופיים. הערה: רוב התאים צריכים להיות חסיד שוב. מדי פעם, הארכת תקופת הדגירה על ידי שעה 1 מגדילה את מספר התאים חסיד במקרה של חיבור מחדש מספיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהירות לשאוב בינוני transfection עם micropipette ולהחליף עם כמות שווה של מדיום גידול. לשאוב היטב רק אחד בכל פעם. </li> &lt;li&gt; דגירה תאים לתקופת זמן דרושה לאפקט מקסימאלי של פלסמיד או siRNA (24-72 hr). אם תקופות דגירה יעלו 48 שעות, להחליף בינוני לאחר 48 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטיפול נוסף עם effectors (למשל., ציטוקינים, אגוניסטים, יריבים ומעכבים) להשתמש בינוני בסרום חופשי ללא PMA וβ-mercaptoethanol. זמן סוף תקופת הדגירה של מפעיל עם הזמן של אפקט המקסימאלי של פלסמיד או siRNA ולתכנן את השינוי של מדיום ותוספת של מפעיל בהתאם. אל לשמור על תאים בתנאים חופשיים בסרום למשך זמן ארוך יותר מאשר 24 שעות. </li></ol>

<ol>
	<li>Ricardo, S. D., van Goor, H., Eddy, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+diversity+in+renal+injury+and+repair.">Macrophage diversity in renal injury and repair.</a> J Clin Invest. 118 (11), 3522-3530 (2008).</li><li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation.">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).</li><li>Morille, M., Passirani, C., Vonarbourg, A., Clavreul, A., Benoit, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+developing+cationic+vectors+for+non-viral+systemic+gene+therapy+against+cancer.">Progress in developing cationic vectors for non-viral systemic gene therapy against cancer.</a> Biomaterials. (24-25), 3477-3496 (2008).</li><li>Schnoor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+non-viral+transfection+of+THP-1+cells.">Efficient non-viral transfection of THP-1 cells.</a> J Immunol Methods. 344 (2), 109-115 (2009).</li><li>Mae&#223;, M. B., Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+protocol+for+efficient+nonviral+transfection+of+premature+THP-1+macrophages.">Improved protocol for efficient nonviral transfection of premature THP-1 macrophages.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2011 (5), (2011).</li><li>Ma, W., Liu, Y., Ellison, N., Shen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+C-X-C+chemokine+receptor+type+7+(CXCR7)+switches+stromal+cell-derived+factor-1+(SDF-1)+signaling+and+phagocytic+activity+in+macrophages+linked+to+atherosclerosis.">Induction of C-X-C chemokine receptor type 7 (CXCR7) switches stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling and phagocytic activity in macrophages linked to atherosclerosis.</a> J Biol Chem. 288 (22), 15481-15494 (2013).</li><li>Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+localization+of+ABCG1+does+not+require+LXR+activation.">Cell surface localization of ABCG1 does not require LXR activation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (11), 143-144 (2006).</li><li>Buers, I., Robenek, H., Lorkowski, S., Nitschke, Y., Severs, N. J., Hofnagel, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP47,+a+lipid+cargo+protein+involved+in+macrophage+triglyceride+metabolism.">TIP47, a lipid cargo protein involved in macrophage triglyceride metabolism.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 29 (5), 767-773 (2009).</li><li>Robenek, H., Buers, I., Hofnagel, O., Lorkowski, S., Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-tagged+proteins+visualized+by+freeze-fracture+immuno-electron+microscopy:+A+new+tool+in+cellular+and+molecular+medicine.">GFP-tagged proteins visualized by freeze-fracture immuno-electron microscopy: A new tool in cellular and molecular medicine.</a> J Cell Mol Med. 13 (7), 1381-1390 (2009).</li><li>Guh, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+novel+adenosine+monophosphate-activated+protein+kinase+activators.">Development of novel adenosine monophosphate-activated protein kinase activators.</a> J Med Chem. 53 (6), 2552-2561 (2010).</li><li>Park, E. K., Jung, H. S., Yang, H. I., Yoo, M. C., Kim, C., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+THP-1+differentiation+is+required+for+the+detection+of+responses+to+weak+stimuli.">Optimized THP-1 differentiation is required for the detection of responses to weak stimuli.</a> Inflamm Res. 56 (1), 45-50 (2007).</li><li>Mae&#223;, M. B., Wittig, B., Cignarella, A., Lorkowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+PMA+enhances+the+responsiveness+of+transfected+THP-1+macrophages+to+polarizing+stimuli.">Reduced PMA enhances the responsiveness of transfected THP-1 macrophages to polarizing stimuli.</a> J Immunol Methods. 402 (1-2), 76-81 (2014).</li><li>Angosto, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+inflammasome+functions+in+vertebrates:+Inflammasome+and+caspase-1+trigger+fish+macrophage+cell+death+but+are+dispensable+for+the+processing+of+IL-1b.">Evolution of inflammasome functions in vertebrates: Inflammasome and caspase-1 trigger fish macrophage cell death but are dispensable for the processing of IL-1b.</a> Innate Immun. 18 (6), 815-824 (2012).</li><li>Latz, E., Xiao, T. S., Stutz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+and+regulation+of+the+inflammasomes.">Activation and regulation of the inflammasomes.</a> Nat Rev Immunol. 13 (6), 397-411 (2013).</li><li>Muruve, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inflammasome+recognizes+cytosolic+microbial+and+host+DNA+and+triggers+an+innate+immune+response.">The inflammasome recognizes cytosolic microbial and host DNA and triggers an innate immune response.</a> Nature. 452 (7183), 103-107 (2008).</li></ol>

עלויות פרסום למאמר וידאו זה אינן ממומנים על ידי Lonza גרופ בע&quot;מ

הפרוטוקול המתואר כאן מציג דרך אמינה ויעילה לtransfect THP-1 מקרופאגים אשר בדרך כלל די קשים transfect. Transfection ניתן להשיג עם יעילות transfection של 90% מעל לsiRNA ללא הפחתה משמעותית של חיוניות תא. יעילות לפלסמידים עשויה להיות פחות בשל יעילות הגודל אבל transfection של כ -70% בדרך כלל ניתן להשיג. היעילות של מציאה בתיווך siRNA יכולה להגיע 80 90% בהתאם לsiRNA מיושם. יתרון עיקרי של פרוטוקול זה הוא שזה לא מפריע להתמיינות תאים. לאחר transfection התאים עדיין מגיבים בדרך כלל לסוכן בידול (איור 1 א ל1B ואיור 4) PMA 12. בקיטוב סלולארי בנוסף על ידי גירויי ציטוקינים כגון IL10 או LPS / IFNγ הוא 12 מושפעים, אם כי זה גם תלוי במידה רבה במדיום שנבחר לטיפוח לאחר transfections מוצג באיור 4. ישנן מספר אפשרויות בהליך שיכול להיות שונה כדי להתאים את הפרוטוקול לדרישות ספציפיות. כפי שניתן לראות באיור 4 התאים מגיבים באופן שונה לאותו הגירוי IL10 תלוי במדיום התרבות שנבחר לאחר transfection. זה מצביע על כך שיש בהרכב הבינוני השפעה חזקה על התנהגות סלולרית. כאפקט שהוטל על ידי המדיום עשוי להיות שונה לגירויים ניסיוניים שונים, זה אפשרי, כי המדיום האופטימלי עשוי להשתנות ולכן יש צורך לבדוק את התאמתו של המדיום לניסויים שונים באופן עצמאי. עם זאת בינוני RPMI-1640, המהווה את ברירת המחדל &#39;בינוני המשמש לטיפוח THP-1 תאים, הוכיח את עצמו לא מתאים לעיבוד חקלאי לאחר transfection כהפסד משמעותי בחיוניות תא נצפה. יתר על כן הפרוטוקול יכול להיות מיושם גם לTHP-1 מונוציטים ללא בידול מושרה PMA לפני, זהברור שמסיר את הצורך בניתוק תא במהלך ההליך, אבל אין לי כל השלבים הנותרים להיות מותאמים. יכולים להיות מובחנים מונוציטים THP-1 לאחר מכן במידת צורך. האלמנטים הקריטיים ביותר של הפרוטוקול הם קודם כל הניתוק ושנית הזמן הנדרש לtransfection. הניתוק חייב להתבצע בעדינות ככל האפשר, על מנת לשמור על כדאיות תא גבוהות. לכן אנו ממליצים על הניתוק האנזימטית יחסית קל על ידי Accutase עליי שיטות די אגרסיביות כגון trypsinization. שיטות ניתוק נוספות כגון טיפול בLidocain או גירוד נמצאו ולא מזיקה ולא אמור לשמש. במקרה ש30 דקות של Accutase אני טיפול לא צריכה להיות מספיק כדי לנתק את כל התאים כמו שצריך זה הוא בדרך כלל אינדיקציה לאופן שגוי מאוחסן או שפג תוקף פתרון Accutase אני או של להקפיא להפשיר מחזורים רבים מדי. יש לנו להשיג תוצאות טובות על ידי אחסון aliquots הקטנים של Accutase אני ב-20 °C כדי להפחית את מספר מחזורי ההפשרה הקפאה. עם זאת, כאשר יש ניתוק מספק או להחליף Accutase אני עם Accutase הטרי או להגדיל את זמן דגירה עד שעה 1. בהקשה עדינה בנוסף או שטיפה של הבקבוק או צלחת יכול לסייע ניתוק. לגבי הזמן הדרוש לtransfection את זמן החשיפה של התאים לפתרון Nucleofector טהור יש לי השפעה גבוהה על הישרדות תא ובכך צריך להיות קצר ככל האפשר. הדרך הטובה ביותר להשיג זאת היא לבצע כל transfection בכל פעם (2.10-2.15 השלבים) ולא transfections מרובה במקביל. אם יעילות מציאה היא נמוכה, זה בדרך כלל לא נגרם על ידי יעילות transfection נמוכה, אבל זה יכול להיות מאומת בקלות באמצעות cytometry זרימה או מיקרוסקופ פלואורסצנטי ושכותרתו fluorescently siRNA או פלסמיד קידוד GFP. בעיקר הסיבה היא DNA siRNA או פלסמיד לא יעיל. בנסיבות אלה יש לשקול להגדיל (עד 2-3 מיקרוגרם) הסכום של siRNA אופלסמיד דנ&quot;א (עד 1-2 מיקרוגרם) או להשתמש וקטור siRNA או ביטוי שונה אם הוא זמין. לחלופין, תוצאות משביעות רצון יכולות גם להיות מושגת על ידי שימוש בברכה של כמה siRNAs שונה המכוונים נגד אותו היעד. יתר על כן, ניסויים כמובן זמן ייתכן שיהיו צורך לקבוע את התקופה של אפקט מקסימאלי, שהוא בדרך כלל הגיע לאחר 24 עד 72 שעות לאחר transfection במדויק. מלבד transfection ידי electroporation יש עוד טכניקות מבוססות היטב על transfection של תאי יונקים. לעתים קרובות מערכות מיושמות סוכני transfection כימיים אשר יכולה ליצור קומפלקסים עם חומצות גרעין מטען ולאחר מכן להקל על התחבורה אל תוך התאים. הנפוץ ביותר ריאגנטים מבוססים גם על מיני שומנים שונים או ניתן לבחור ממספר של הפולימרים קטיוני 3. עבור שני גישות מבחר מגוון זמין באופן מסחרי. ריאגנטים transfection אלה מציעים יתרון שהם בדרך כללקל לשימוש, אינו דורש הרבה זמן, ולעבוד עם תאים חסיד, כמו גם, ובכך להסיר את הצורך בניתוק. לרוע המזל, מקרופאגים הם די קשים transfect בשיטות אלה כפי שהם אינם מתרבים באופן משמעותי במבחנה ויש מנגנוני הגנה מכוונים נגד DNA cytosolic הזר 13-15. לפיכך, גישות transfection הכימי לעתים קרובות לגרום לירידה חמורה ביכולת הקיום של תאים. עם זאת, כפי שמוצג באיור 2 יש סוכני transfection כימיים אשר יכול להעביר בהצלחה siRNA לתוך מקרופאגים, אלא כזרימה cytometric (איור 2 א) ומיקרוסקופי ניאון (איור 2) מניתוחי הם לא מצליחים להשיג את אותה חלוקה הומוגנית של siRNA בתוך התאים כ מתקבל על ידי nucleofection. למעשה, נתוני הזרימה cytometric, עולים כי שתי אוכלוסיות שונות של תאי transfected להתרחש, קודם כל אוכלוסייה עם הקרינה דומה לזו של תאים לאחר Nucleofectiבמזוהה ושנית יש אוכלוסייה עם הקרינה חזקה יותר. אישור ברור עדיין נדרש אבל אנחנו מניח שהאוכלוסייה הראשונה היא במיקרוסקופ פלואורסצנטי הזהה לאלה תאים שמראים חלוקה הומוגנית של siRNA ניאון בתוך cytosol בעוד האוכלוסייה השנייה צפויה תואמת את התאים עם agglomerates בהיר מאוד. נתוני הזרימה cytometric שמוצגים באיור 2 א עולים כי תוצאות nucleofection בפחות siRNA לכל תא מגישת lipofection החלופית. עם זאת הנתונים בתרשים 3 מראה כי אפילו הכמות הקטנה יחסית של siRNA שולבה על ידי nucleofection היא כבר מספיק ל80 עד 90 מציאה% מגן המטרה. לכן הסכום נוסף של siRNA שולב על ידי האוכלוסייה השנייה לאחר transfection הכימי סביר מאוד עודף ולכן סיכוי גבוה יותר לגרום לתופעות לוואי לא רצויים מאשר לעלייה נוספת יעילות מציאה. חוץ מזה<html> היווצרות של agglomerates תאיים היא כבר לא רצויה בעצמו מאז מולקולות siRNA אלה הן כנראה לא פונקציונליים או לפחות פחות יעיל מאשר מולקולות siRNA חופשיות ועלולה לגרום לתופעות את היעד. יתר על כן טבעו האמיתי של agglomerates אלה עדיין לא ברור. יתכן כי כתמים אלה בהירים מייצגים endosomes מצביע על כך שsiRNA הופנם על ידי התאים אך לאחר מכן לשחרר מendosomes נכשל וsiRNA נותר לכוד ולכן לא יעיל. לחלופין הכתמים יכולים להיות agglomerates אשר נוצרים intracellularly. הערכות תפקודיות של transfection הכימי תלויות ועומדות, ולכן אין הצהרות חד משמעיות על יעילות מציאה יכולות להתבצע עדיין, עדיין קיומם של שתי אוכלוסיות מובחנות הוא כבר שלילי כמו זה אומר שכל התוצאות לתאר הממוצעת של שני האוכלוסיות, זה לכן לא מתאים ל אחת מהאוכלוסיות. מסיבה זו nucleofection הוא הגישה מעולה. התחת = &quot;jove_content&quot;&gt; ובכל זאת יש גם מגבלות להליך transfection המתוארים כאן. מאז התאים צריכים להיות בהשעיה לתאים חסיד nucleofection צריכים להיות מנותקים, המציג גורם לחץ נוסף לתאים. יתר על כן כל הפרוטוקול זמן רב למדי. מאז לא ניתן לבצע בו זמנית transfections, אך יש לבצע במהירות על מנת למנוע נזק לתאים, במספר הדגימות מוגבל לכ 8 - 10 לכל ניסוי. לפיכך, פרוטוקול זה אינו מתאים לפרויקטי הקרנת תפוקה גבוהה. עבור יישומי תפוקה גבוהים מערכות Nucleofector שונות זמינות. ראשית, יש את מערכת 4D-Nucleofector שמציעה פורמט רצועה 16 גם. עבור תפוקה גדולה עוד יותר, יש מערכת הסעות 96 היטב ומערכת HT Nucleofector 384 גם. עם זאת כפי שמערכות חדשות יותר אלה לעבוד עם אלקטרודות מוליך פולימר במקום אלומיניום ולכן תנאים חשמליים, תוכניות כלומר ויערותition של פתרון Nucleofector, השתנה בהתאם, זה צריך להיקבע אם הפרוטוקול שלנו יכול להיות מועבר למערכות אלה. עם זאת, למרות מגבלות אלה הפרוטוקול מובא כאן אינו להניב transfection אמין והיעיל של THP-1 תאים אשר הוא עדיף על כל הגישות שאינן נגיפיות האחרות. פרוטוקול זה מאפשר החקירה של האפקטים של ביטוי גנים שעבר שינוי בתאי THP-1, אשר להבדיל ובכל ההיבטים האחרים לקטב בדרך כלל ובכך להראות מעט תופעות לוואי כמו של transfection ככל האפשר.

בין המרכיבים התאיים של מערכת החיסון האנושית, מקרופאגים הם בעלי חשיבות רבה לתגובה החיסונית המולדת. משימותיהם שונות; הם מעורבים בphagocytosis של פתוגנים וחומר נימקי, הם משחקים תפקיד חשוב בהומאוסטזיס רקמה ולייצר ולהפריש כמות גדולה של ציטוקינים להסדיר ולתאם את התגובה החיסונית 1. לכן מקרופאגים, היו מעורבים בתהליכים פיסיולוגיים רבים ותנאי pathophysiological. בשל הגיוון של משימותיהם, מקרופאגים הם סוג תא מאוד הטרוגנית ורב פנים. זו מושגת על ידי קיטובים שונים; בהתאם למקרופאגים גירויים חיצוניים יכול להתפתח לפנוטיפים שונים 2. השתנות &#39;מקרופאגים והשפעה על התגובה החיסונית לגרום להם נושא מחקר מעניין מאוד. על מנת להבהיר את חילוף החומרים שלהם מורכבים ופונקציות רגולציה, מקרופאג המתאים במודלים חוץ גופית הוא required שבצורה נכונה משקף את ההטרוגניות מקרופאג והשתנות. Transfection של תאים עם וקטורי פלסמיד דנ&quot;א או RNAs התערבות קטן (siRNAs) כדי לשנות את ביטוי הגנים סלולארי הפך לכלי בשימוש וחזק באופן נרחב בביולוגיה של תא לחקירת שתי ויסות הגנים ותפקוד גן. כיום יש מבחר גדול של כלים שונים זמינים עבור transfection של תאים האיקריוטים. כלים אלה כוללים יישום של וקטורים ויראליים, שיטות מכאניות (כגון רובי גן), גישות כימיות (אשר מסתמכות על פולימרים או שומנים שיכולים ליצור קומפלקסים עם חומצות גרעין), וelectroporation של תאים 3. כל הגישות הללו יש יתרונות וחסרונות שלהם והבחירה המתאימה ביותר ממגוון רחב זה לסוג תא מסוים ויישום יכולה להיות תהליך גוזל קשה וזמן. המקרופאגים הם קשים לtransfect transfe כמו כמעט כל מבוסס היטבגישות ction להפחית באופן דרסטי את הכדאיות &#39;מקרופאגים או להפריע להתנהגות שלהם, כלומר אבחנה ובקיטוב מסוים. לכן, אנו מציגים כאן פרוטוקול יעיל, שאינו נגיפי לtransfect מקרופאגים THP-1 האנושיים באמצעות טכנולוגית Nucleofector מבוססת electroporation, המייצגת את גישת electroporation מותאמת הדורשת כמויות מופחתות של DNA. Nucleofection מתאים היטב לתאים רגישים כגון מונוציטים ומקרופאגים. פרוטוקול זה הוא עיבוד של גרסאות שפורסמו בעבר 4,5. בקיצור, phorbol 13 יצטט 12 myristate (PMA) משמש כדי להבדיל מונוציטים THP-1 בבני אדם ל48 שעות לתוך מקרופאגים מוקדמים לפני transfection עם siRNA או פלסמיד דנ&quot;א. לtransfection מקרופאגים predifferentiated מנותקים אנזימים ידי Accutase אני טיפול. Transfection מתבצע באמצעות מכשיר 2b Nucleofector electroporation של התאים. לאחר transfection, שונהentiation הוא המשיך ל24 עד 48 שעות נוספות כנדרש. לבסוף, מקרופאגים transfected הבוגרים מודגרת עם סוגים שונים של תרכובות ללימודים פונקציונליים שונים. גישה זו מאפשרת לtransfection של שורות תאים כגון מונוציטים THP-1 אנושיים ומקרופאגים ויושמה בהצלחה ב6-10 העבר. בניגוד לרוב גישות transfection הכימי, הליך nucleofection שונה שלנו באמצעות מקרופאגים מוקדמים מניב יעילה transfection גבוהה בשילוב עם כדאיות תא שאינו פגומות, ללא הצורך להשתמש בוקטורים ויראליים או להוסיף תרכובות מוביל נוספות עם תופעות לוואי ידועים. בנוסף, מקרופאגים לשמור את הפוטנציאל שלהם מלא לבידול, כמו גם קיטוב ובכך מאפשרים חקירות פונקציונליות ללא הפרעה הבאה transfection 11. יתר על כן, מדיום תרבות התא מיושם לאחר nucleofection מאוד משפיע מחקרים תפקודיים tran הבאsfection; בפרט, היכולת &#39;מקרופאגים לקיטוב יכולה להיות מושפעת בהתאם למדיום התרבות מיושם. הנה ארבעה סוגים שונים של תקשורת בתרבות התא (IMDM, X-VIVO 20, בינוני Nucleofector סלולארי LGM3 ועכבר T) נבדקו בתנאי כיבוי באמצעות interleukin (IL) 10. השימוש THP-1 מקרופאגים, שציינו כי היענות תא לIL10 היא החזק ביותר כאשר בינוני Nucleofector הנייד העכבר T משמש בהשוואה לתקשורת והתרבות האחרות שהוזכר לעיל. תוצאות אלו מראות כי אופטימיזציה המתאימה של כל תנאי תרבית התאים חיונית ללימודים פונקציונליים הבאים und transfection המוצלח כמו אלה עשויים לשפר באופן משמעותי את תוצאות ניסוי. כמקרופאגים מעורבים במחלות אנושיות שונות, הרבה מחקר מתמקד בהבהרת התנהגות מקרופאג כמו גם מנגנוני ויסות משפיעים מקרופאגים או בתורו נשלטו על ידי מקרופאגים. לכן, פרוטוקול זה הוא רלוונטי בתחומי מחקר רבים ושונים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="777">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Accutase I</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">A6964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Amino acids, nonessential</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">M11-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Centrifuge tubes (15 ml)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP91015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Fetal calf serum (FCS gold)</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">A15-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Human Monocyte Nucleofector Kit</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">VPA-1007</td>
			<td>Contains Nucleofector Solution, cuvettes and Pasteur pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Human serum off the clot</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">C11-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Isove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium (IMDM) with 25 mM HEPES and 25 mM L-glutamine</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">12-722F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Lymphocyte Growth Medium 3 (LGM3)</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">CC-3211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Mouse T Cell Nucleofector Medium</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">VZB-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Nucleofector 2b</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">AAD-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Penicillin / Streptomycin / L-glutamine (100&#215;)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">G1146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:145px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:145px;">BP685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium (RPMI 1640)</td>
			<td style="width:145px;">PAA</td>
			<td style="width:145px;">E15-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">siRNA / plasmid</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Sodium pyruvate (100 mM)</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">THP-1 human leukemia monocytes</td>
			<td style="width:145px;">CLS</td>
			<td style="width:145px;">300356</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tissue culture flasks (75 cm&#178;; 150 cm&#178;)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP90076/TPP90151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tissue culture plates (6-well; 12-well)</td>
			<td style="width:145px;">TPP</td>
			<td style="width:145px;">TPP92406/TPP92012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">Tubes (1.5 ml)</td>
			<td style="width:145px;">StarLab</td>
			<td style="width:145px;">S 1615-5500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:320px;">Water (nuclease-free) or appropriate siRNA/plasmid buffer</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">X-Vivo 20 with Gentamycin</td>
			<td style="width:145px;">Lonza</td>
			<td style="width:145px;">BE04-448Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:320px;">&#946;-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:145px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

highly efficient transfection of human thp-1 macrophages by nucleofection

המקרופאגים, כשחקני מפתח של תגובת החיסון המולדת, נמצאים במוקד של מחקר העוסק בהומאוסטזיס רקמה או פתולוגיות שונות. Transfection עם siRNA ופלסמיד דנ&quot;א הוא כלי יעיל לחקר תפקודם, אבל transfection של מקרופאגים הוא לא דבר טריוויאלי. למרות גישות רבות ושונות לtransfection של תאים האיקריוטים זמינות, רק מעטים מאפשרים transfection אמין והיעיל של מקרופאגים, אבל חיוניות תא מופחתת וקשה שעברה שינוי התנהגות תא כמו יכולת מופחתת לבידול או קיטוב נצפה לעתים קרובות. לכן נדרש פרוטוקול transfection כי הוא מסוגל להעביר siRNA ופלסמיד דנ&quot;א לתוך מקרופאגים מבלי לגרום לתופעות לוואי רציניות ובכך מאפשרות החקירה של ההשפעה של siRNA או פלסמיד בהקשר של נורמלי התנהגות תא. הפרוטוקול המובא כאן מספק שיטה לאמינות וביעילות transfecting THP-1 מקרופאגים אנושיים ומוnocytes עם חיוניות גבוהה תא, יעילות transfection גבוהה, והשפעות מינימליות על התנהגות תא. גישה זו מבוססת על nucleofection והפרוטוקול כבר מותאם כדי לשמור על היכולת המרבית לתא הפעלה לאחר transfection. הפרוטוקול הוא נאות לתאים חסיד לאחר הניתוק, כמו גם תאים בתרחיף, וניתן להשתמש בם לקטנות למספרים לדוגמה בינוניות. לפיכך, השיטה המוצגת היא שימושית לחקירת השפעות רגולציה גנים במהלך בידול מקרופאג וקיטוב. מלבד הצגת תוצאות אפיון מקרופאגים transfected על פי פרוטוקול זה, בהשוואה לשיטה כימית חלופית, את ההשפעה של בחירת מדיום תרבות תא לאחר transfection בהתנהגות תא גם דנה. הנתונים שהוצגו מצביעים על החשיבות של אימות הבחירה להגדרות ניסוי שונות.

השימוש בפרוטוקול זה לtransfection של THP-1 מקרופאגים עם siRNA אנחנו בדרך כלל להשיג שיעורי transfection של מעל 90% ללא הפחתה משמעותית של חיוניות תא. איור 1 מציג נתונים נציג המאפיינים את המדינה של התאים 24 שעות לאחר transfection עם fluorescently שכותרתו siRNA לעומת untransfected שליטה, שלא טופלו בחומרים כימיים nucleofection ודופק או siRNA אבל קיבל את כל השינויים של תקשורת בתרבות כדוגמאות transfected. באיור 1 א המורפולוגיה התאית מוצגת על פי מדידת cytometric זרימה. תמונות מיקרוסקופיות מוצגות באיור 1 ב 1C דמויות ו1D מייצגים את השיעורים נמוכים לאפופטוזיס (שליטה: 1.5%; nucleofection: 5.4%). ונימק (שליטה: 2.0%; nucleofection: .3.2%) המצביעים על חיוניות תא מושפעת. נמק ואפופטוזיס הם מעט גבוהים יותר למדגם transfected כמקרופאגים THP-1 transfected יותרקשה לנתק מאשר תאי untransfected, כך ההסתברות לניזק לתאים במהלך עליות ניתוק. לבסוף יעילות transfection מוצגת באיור 1E. ככל שאוכלוסיית transfected כל מוסטת נגד השליטה, זה מצביע על כך שכל התאים transfected אשר אושר על ידי תמונות הקרינה מיקרוסקופיות (איור 2). שני לזרום נתונים cytometric כמו גם תמונות מיקרוסקופיות הקרינה מצביעים על כך שכל תאי transfected באופן עקבי עם חלוקה הומוגנית של siRNA בין תאים, כמו גם בתוך תאים. זאת בניגוד לרבים ריאגנטים transfection כימיים, ל2A מספרי השוואה ו2B להציג את הנתונים בהתאמה התזרים cytometric ותמונות מיקרוסקופיות הקרינה לסוכן transfection הכימי תוך שימוש בגישה מבוססת שומנים. נתונים אלה מראים כי שתי אוכלוסיות נפרדות של תאי transfected ניתן לאתרם. האוכלוסייה הראשונה היא דומה לתאי transfected folloהאגף nucleofection. הם מאופיינים בקרינה כוללת נמוכה והפצה הומוגני של siRNA בתוך התאים. האוכלוסייה השנייה מתאפיינת בקרינה אינטנסיבית יותר שמקורו מagglomerates תאיים בהיר מאוד של siRNA. המורפולוגיה התאית נשארה ללא פגע לשני גישות transfection כפי שמוצג על ידי התערבות ההפרש לעומת זאת באיור 2 ג. Transfections באמצעות תשואת פלסמיד דנ&quot;א ביעילות תוצאות דומות, לדוגמאות עיין Robenek et al. (2009) 9 או שיה et al. (2006) 7. הבחירה של מדיום תרבית תאים לאחר transfection היא רלוונטית רב; לכן תקשורת תרבית תאים שונה נבדקו בהשוואה. המדיה שנבחרה כולם מתאימות לגידול של THP-1 תאים ונבחרו על פי המלצות של Lonza כאמצעי תקשורת רלוונטי עבור פוסט nucleofection טיפוח. איור 3 מייצגים את mediat siRNAעורך מציאה יעילות באמצעות siRNA המכוון נגד IL10RB (שרשרת β 10 קולט interleukin) mRNA. לכל אמצעי התקשורת שנבדקה הביטוי של IL10RB הופחת באופן משמעותי לכ -10 20% מרמת השליטה (איור 3). עם זאת תאי transfected להשתנות בהתאם למדיום התרבות בפוטנציאל שלהם לקיטוב. THP-1 מקרופאגים transfected עם siRNA או siRNA שליטה הנוקב או IL10RB הספציפי עובדו באמצעי תקשורת שונה לאחר transfection וטופלו בIL10. בהמשך לכך רמות הביטוי של גן SOCS3 המושרה IL10 (המדכא של ציטוקינים איתות 3) ברמת mRNA נמדדו על ידי RT-qPCR. הבדלים בין תקשורת והתרבות להתרחש בכל הנוגע להיקף הגיוס של ביטוי SOCS3 mRNA (איור 4), זירוזים לכל אחד מאמצעי התקשורת שנבדקה תא העכבר T Nucleofector בינוני, LGM3, X-VIVO 20 וIMDM היו 19.5 [17.7-21.5 ], 11.5 [8.5-15.7], 8.0 [4.6-14.2] ו7.2 [5.6-9.5] לקפל, בהתאמה.יישום refore של מדיום Nucleofector הנייד העכבר T הוא חיוני. בנוסף, הבדלים בהשפעה של מציאה של IL10RB על ביטוי SOCS3 לאחר טיפול IL10 היו נצפים, רמות ביטוי של SOCS3 mRNA הופחתו ל9.5 [8.8-10.3] בינוני Nucleofector לקפל בסלולרי העכבר T, 2.1 [1.1-4.1] לקפל בLGM3, 4.8 [3.2-7.2] לקפל בX-VIVO 20 ו3.3 [2.7-3.9] IMDM לקפל ב. ערכים אלה מתאימות להפחתה של ביטוי SOCS3 באמצעי התקשורת שונה ל49%, 18%, 60%, ו45%, בהתאמה. הפחתה של IL-induced 10 ביטוי SOCS3 לאחר transfection של IL10RB siRNA מאשרת את downregulation המוצלח של IL10RB ידי transfection. <img alt="איור 1" fo:content-width="3in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" width="300" /> אפיון איור 1 של THP-1 מקרופאגים transfected. המצב האופייני לתאים אינו מושפע כפי שנחשף על ידי מיקרוסקופי אור וזרימת cytometric ניתוחים של שיתוף untransfectedתאי ntrol לעומת THP-1 מקרופאגים transfected על פי הפרוטוקול שהוצג. THP-1 מקרופאגים הובדלו עם 10 ng / ml PMA ל48 שעות וtransfected עם (488 אלקסה) שליטה שכותרתו fluorescently נוקבת siRNA. 24 שעות לאחר transfection או תמונות של תאי חיים נלקחו (B), או התאים היו מנותקות על ידי Accutase אני טיפול ונותחו על ידי cytometry זרימה (). צביעת אפופטוזיס ונימק בוצעה באמצעות Annexin V-Phycoerythrin (PE) (ג) ו -7-aminoactinomycin (7-AAD) (D). יעילות transfection (E) נקבעה על ידי cytometry זרימה באמצעות תווית הקרינה המצורפת לsiRNA. אות הקרינה של תאי transfected (השחורה) מוצגת כנגד אות השליטה (האפור). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width = src &quot;4in&quot; = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 51,960 / 51960fig2highres.jpg&quot; width = &quot;400&quot; /&gt; תאי איור 2 השוואה של החלוקה תאית של siRNA לאחר nucleofection לעומת lipofection. THP-1 הובדלו ל48 שעות על פי פרוטוקול זה ולאחר מכן transfected או על ידי או על ידי nucleofection lipofection. תוצאות lipofection הציגו התקבלו באמצעות ערכת Xtremegene siRNA על פי המלצות היצרן עם יחס תשלום של מגיב לsiRNA של 4: 1. 24 שעות לאחר תאי transfection היו או מנותקים עם Accutase אני לניתוח התזרים cytometric או הערכה מיקרוסקופית בתאים חיים. (א) יעילות Transfection והפצה של siRNA לכל תא באוכלוסייה נקבעו על ידי cytometry זרימה באמצעות תווית הקרינה המצורפת לsiRNA, בקרות transfected ללא siRNA מוצגות באפור, דגימות transfected עם siRNA מוצגות בשחור. מיקרוסקופיה (B) פלואורסצנטיתמונות מראים הפצה תאית של fluorescently שכותרתו siRNA (אלקסה פלואוריד 488); סרגל קנה המידה מייצג 40 מיקרומטר. תמונת התערבות הפרש לעומת זאת מתאימה לתמונת הקרינה (C); סרגל קנה המידה מייצג 40 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" width="500" /> .3 איור siRNA בתיווך מציאה של IL10RB במקרופאגים THP-1 transfected. THP-1 מקרופאגים היו transfected על פי הפרוטוקול שתואר. לאחר transfection התאים עובדו בארבע מדיה שונה תרבות, כלומר תא העכבר T בינוני Nucleofector (), IMDM (B), LGM3 (C), וX-VIVO 20 (ד &#39;), בתוספת כפי שתוארו בסעיף הפרוטוקול. Cאמות היו transfected גם עם שליטה נוקבת siRNA (Ctrl) או IL10RB הספציפי siRNA (IL10RB). כבקרות נוספות דוגמאות הבאות נכללו: שליטת Pulse, כלומר. תאים שעברו transfection בהעדר siRNA (Pulse), ושליטה בינונית, כלומר. תאים שקיבלו רק את השינויים של תקשורת בתרבות אבל נשארו אחרת לא טופלו. 24 שעות לאחר transfection התאים הודגרו במדיום סרום ללא עם או בלי 50 ng / ml IL10 עבור שעות 24 נוספות. ביטוי IL10RB נמדד על ידי RT-qPCR; תרשימים מראים הממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים, ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע; * P &lt;0.05; ** P &lt;0.01; *** P &lt;0.001 לעומת Ctrl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" width= &quot;500&quot; /&gt; איור 4 תקנת IL10 תלויה של SOCS3 לאחר מציאה של IL10RB במקרופאגים THP-1 transfected. THP-1 מקרופאגים היו transfected על פי הפרוטוקול המתואר. לאחר transfection התאים עובדו בארבעה בינוני תרבות תקשורת סלולארי העכבר T שונה Nucleofector (), IMDM (B), LGM3 (C) וX-VIVO 20 (ד) בתוספת כפי שתואר בסעיף הפרוטוקול. תאים היו transfected גם עם שליטה נוקבת siRNA (Ctrl) או IL10RB הספציפי siRNA (IL10RB). כבקרות נוספות דוגמאות הבאות נכללו: שליטה דופק, תאים כלומר שעברו transfection בהעדר siNRA (Pulse), ושליטה בינונית, כלומר. תאים שקיבלו רק את השינויים של תקשורת בתרבות אבל נשארו אחרת לא טופלו. 24 שעות לאחר transfection התאים הודגרו במדיום סרום ללא עם או בלי 50 ng / ml IL10 עבור שעות 24 נוספות. expre SOCS3ssion נמדד על ידי RT-qPCR; תרשימים מראים הממוצע של שלושה ניסויים בלתי תלויים, ברים שגיאה מייצגים את שגיאת התקן של הממוצע; *, # P &lt;0.05; **, ## עמ &#39;&lt;0.01; ***, ### עמ &#39;&lt;0.001 לעומת Ctrl ולעומת Ctrl + IL-10, בהתאמה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51960/51960fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection at JoVE.com

Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה ואמינה לtransfect מקרופאגים THP-1 אנושיים עם siRNA או DNA פלסמיד על ידי electroporation עם יעילות transfection גבוהה תוך שמירה על חיוניות תא גבוהה ויכולת מקרופאג מלאה לבידול וקיטוב.

Transfection יעיל ביותר של של אדם המקרופאגים THP-1 על ידי nucleofection

Macrophages, as key players of the innate immune response, are at the focus of research dealing with tissue homeostasis or various pathologies. ...

highly-efficient-transfection-human-thp-1-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

46.3K Views.  Friedrich Schiller University Jena.  פרוטוקול זה מציג שיטה יעילה ואמינה לtransfect מקרופאגים THP-1 אנושיים עם siRNA או DNA פלסמיד על ידי electroporation עם יעילות transfection גבוהה תוך שמירה על חיוניות תא גבוהה ויכולת מקרופאג מלאה לבידול וקיטוב. 

Video: Highly Efficient Transfection of Human THP-1 Macrophages by Nucleofection

A Simple and Efficient Method to Isolate Macrophages from Mixed Primary Cultures of Adult Liver Cells

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although the isolation methods of liver macrophages have been well-described4-6, most of these methods require sophisticated equipment, such as a centrifugal elutriator and technical skills. Here, we provide a novel method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity from mixed primary cultures of adult rat liver cells, as schematically illustrated in Figure 1.
After dissociation of the liver cells by two-step perfusion method7,8,a fraction mostly composed of parenchymal hepatocytes is prepared and seeded into T75 tissue culture flasks with culture medium composed of DMEM and 10% FCS.Parenchymal hepatocytes lose the epithelial cell morphology within a few days in culture, degenerate or transform into fibroblast-like cells (Figure 2). As the culture proceeds, around day 6, phase contrast-bright, round macrophage-like cells start to proliferate on the fibroblastic cell sheet (Figure 2). The growth of the macrophage-like cells continue and reach to maximum levels around day 12, covering the cell sheet on the flask surface. By shaking of the culture flasks, macrophages are readily suspended into the culture medium. Subsequent transfer and short incubation in plastic dishes result in selective adhesion of macrophages(Figure 3), where as other contaminating cells remain suspended. After several rinses with PBS, attached macrophages are harvested. More than 106 cells can be harvested repeatedly from the same T75 tissue culture flask at two to three day intervals for more than two weeks(Figure 3).The purities of the isolated macrophages were 95 to 99%, as evaluated by flow cytometry or immunocytochemistry with rat macrophage-specific antibodies (Figure 4).The isolated cells show active phagocytosis of polystylene beads (Figure 5), proliferative response to recombinant GM-CSF, secretion of inflammatory/anti-inflammatory cytokines upon stimulation with LPS, and formation of multinucleated giant cells9.
In conclusion, we provide a simple and efficient method to obtain liver macrophages in sufficient number and purity without complex equipment and skills.This method might be applicable to other mammalian species.

A novel method to obtain macrophages from primary culture of rat liver cells is described. This method utilizes the proliferation of macrophages in the culture, followed by shaking of culture flasks and purification by selective attachment to plastic dishes. This technique efficiently provides liver macrophages without complex equipment and skills.

שיטה פשוטה ויעילה על מנת לבודד המקרופאגים מתרבויות ראשי מעורבות של תאים בכבד למבוגרים

Kupffer cells are liver-specific resident macrophages and play an important role in the physiological and pathological functions of the liver1-3. Although ...

Optimized Protocol for Efficient Transfection of Dendritic Cells without Cell Maturation

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection of pathogenic antigen by na&iuml;ve DCs is through pattern recognition receptors (PRRs) which are able to recognize specific conserved structures referred to as pathogen-associated molecular patterns (PAMPS). Detection of PAMPs by DCs triggers an intracellular signaling cascade resulting in their activation and transformation to mature DCs. This process is typically characterized by production of type 1 interferon along with other proinflammatory cytokines, upregulation of cell surface markers such as MHCII and CD86 and migration of the mature DC to draining lymph nodes, where interaction with T cells initiates the adaptive immune response2,3. Thus, DCs link the innate and adaptive immune systems. 
The ability to dissect the molecular networks underlying DC response to various pathogens is crucial to a better understanding of the regulation of these signaling pathways and their induced genes. It should also help facilitate the development of DC-based vaccines against infectious diseases and tumors. However, this line of research has been severely impeded by the difficulty of transfecting primary DCs4.
Virus transduction methods, such as the lentiviral system, are typically used, but carry many limitations such as complexity and bio-hazardous risk (with the associated costs)5,6,7,8. Additionally, the delivery of viral gene products increases the immunogenicity of those transduced DCs9,10,11,12. Electroporation has been used with mixed results13,14,15, but we are the first to report the use of a high-throughput transfection protocol and conclusively demonstrate its utility.
In this report we summarize an optimized commercial protocol for high-throughput transfection of human primary DCs, with limited cell toxicity and an absence of DC maturation16. Transfection efficiency (of GFP plasmid) and cell viability were more than 50% and 70% respectively. FACS analysis established the absence of increase in expression of the maturation markers CD86 and MHCII in transfected cells, while qRT-PCR demonstrated no upregulation of IFN&beta;. Using this electroporation protocol, we provide evidence for successful transfection of DCs with siRNA and effective knock down of targeted gene RIG-I, a key viral recognition receptor16,17, at both the mRNA and protein levels.

We present our optimized high-throughput nucleofection protocol as an efficient way of transfecting primary human monocyte-derived dendritic cells with either plasmid DNA or siRNA without causing cell maturation. We further provide evidence for successful siRNA silencing of targeted gene RIG-I at both the mRNA and protein levels.

פרוטוקול אופטימיזציה עבור transfection יעילה של תאים דנדריטים ללא ההבשלה Cell

Dendritic cells (DCs) can be considered sentinels of the immune system which play a critical role in its initiation and response to infection1. Detection ...

A Simple and Efficient Method to Detect Nuclear Factor Activation in Human Neutrophils by Flow Cytometry

Neutrophils are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first to appear at sites of inflammation and infection, thus becoming the first line of defense against invading microorganisms. Neutrophils possess important antimicrobial functions such as phagocytosis, release of lytic enzymes, and production of reactive oxygen species. In addition to these important defense functions, neutrophils perform other tasks in response to infection such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. Cytokines recruit other leukocytes that help clear the infection, and inhibition of apoptosis allows the neutrophil to live longer at the site of infection. These functions are regulated at the level of transcription. However, because neutrophils are short-lived cells, the study of transcriptionally regulated responses in these cells cannot be performed with conventional reporter gene methods since there are no efficient techniques for neutrophil transfection. Here, we present a simple and efficient method that allows detection and quantification of nuclear factors in isolated and immunolabeled nuclei by flow cytometry. We describe techniques to isolate pure neutrophils from human peripheral blood, stimulate these cells with anti-receptor antibodies, isolate and immunolabel nuclei, and analyze nuclei by flow cytometry. The method has been successfully used to detect NF-&kappa;B and Elk-1 nuclear factors in nuclei from neutrophils and other cell types. Thus, this method represents an option for analyzing activation of transcription factors in isolated nuclei from a variety of cell types.

Neutrophils are the most abundant leukocytes in blood. Neutrophils possess transcriptionally regulated functions such as production of proinflammatory cytokines and inhibition of apoptosis. These functions can be studied with the method presented here, which allows detection and quantification of nuclear factors by flow cytometry in isolated nuclei

פשוט ויעילה שיטה לגילוי הפעלת פקטור גרעינית בנויטרופילים אדם על ידי זרימת cytometry

Neutrophils  are the most abundant leukocytes in peripheral blood. These cells are the first  to appear at sites of inflammation and infection, thus ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable alternative to animal model systems for the study of a specific step of microbial pathogen infection. A human monocytic cell line THP-1 which, upon phorbol ester treatment, is differentiated into macrophages, has previously been used to study virulence strategies of many intracellular pathogens including Mycobacterium tuberculosis. Here, we discuss a protocol to enact an in vitro cell culture model system using THP-1 macrophages to delineate the interaction of an opportunistic human yeast pathogen Candida glabrata with host phagocytic cells. This model system is simple, fast, amenable to high-throughput mutant screens, and requires no sophisticated equipment. A typical THP-1 macrophage infection experiment takes approximately 24 hr with an additional 24-48 hr to allow recovered intracellular yeast to grow on rich medium for colony forming unit-based viability analysis. Like other in vitro model systems, a possible limitation of this approach is difficulty in extrapolating the results obtained to a highly complex immune cell circuitry existing in the human host. However, despite this, the current protocol is very useful to elucidate the strategies that a fungal pathogen may employ to evade/counteract antimicrobial response and survive, adapt, and proliferate in the nutrient-poor environment of host immune cells.

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

The current article outlines a protocol to establish an in vitro cell culture model system to study the interaction of a facultative intracellular human fungal pathogen Candida glabrata with human macrophages which will be a useful tool to advance our knowledge of fungal virulence mechanisms.

הקמתה של<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת ללמוד את התנהגות תאית של<em&gt; קנדידה glabrata</em&gt; בהמקרופאגים THP-1 אדם

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to understand the underlying mechanisms of these diseases. We therefore present a straightforward protocol for the isolation of human monocytes from buffy coats, followed by a differentiation procedure which results in high macrophage yields. The technique relies mostly on commonly available lab equipment and thus provides a cost and time effective way to obtain large quantities of human macrophages. Briefly, buffy coats from healthy blood donors are subjected to a double density gradient centrifugation to harvest monocytes from the peripheral blood. These monocytes are then cultured in fluorinated ethylene propylene (FEP) Teflon-coated cell culture bags in the presence of macrophage colony-stimulating factor (M-CSF). The differentiated macrophages can be easily harvested and used for subsequent studies and functional assays. Important methods for quality control and validation of the isolation and differentiation steps will be highlighted within the protocol. In summary, the protocol described here enables scientists to routinely and reproducibly isolate human macrophages without the need for cost intensive tools. Furthermore, disease models can be studied in a syngeneic human system circumventing the use of murine macrophages.

We present a simple and efficient protocol for the generation of human macrophages. Buffy coats are processed by double density gradient centrifugation and isolated monocytes are then differentiated to macrophages in Teflon-coated cell culture bags. This maximizes macrophage yields and facilitates cell harvesting for subsequent experiments.

בידוד של אדם מונוציטים ידי זוגי Gradient צנטריפוגה והבידול שלהם להמקרופאגים בתיקי תרבית תאים מצופים טפלון

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Proteomic Profiling of Macrophages by 2D Electrophoresis

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The key role of macrophages has been shown in various pathological disorders such as inflammatory, immunological, and infectious diseases. In this protocol, we use primary cultures of human monocyte-derived macrophages that can be differentiated into the M1 (pro-inflammatory) or the M2 (anti-inflammatory) phenotype. This in vitro model is reliable for studying the biological activities of M1 and M2 macrophages and also for a proteomic approach. Proteomic techniques are useful for comparing the phenotype and behaviour of M1 and M2 macrophages during host pathogenicity. 2D gel electrophoresis is a powerful proteomic technique for mapping large numbers of proteins or polypeptides simultaneously. We describe the protocol of 2D electrophoresis using fluorescent dyes, named 2D Differential Gel Electrophoresis (DIGE). The M1 and M2 macrophages proteins are labelled with cyanine dyes before separation by isoelectric focusing, according to their isoelectric point in the first dimension, and their molecular mass, in the second dimension. Separated protein or polypeptidic spots are then used to detect differences in protein or polypeptide expression levels. The proteomic approaches described here allows the investigation of the macrophage protein changes associated with various disorders like host pathogenicity or microbial toxins.

Macrophages are the key cells involved in host pathogenicity. Macrophages display phenotypic and functional diversity that can be analysed and detected by proteomic analysis. This article describes how to perform 2D electrophoresis of primary cultures of human macrophages differentiated into M1 or M2 phenotype.

Proteomic פרופיל של המקרופאגים על ידי 2D אלקטרופורזה

The goal of the two-dimensional (2D) electrophoresis protocol described here is to show how to analyse the phenotype of human cultured macrophages. The ...

Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal disease. Macrophages are heterogeneous cells that have been implicated in kidney injury. Macrophages may be classified into two different phenotypes: classically activated macrophages (M1 macrophages), that release pro-inflammatory cytokines and promote fibrosis; and alternatively activated macrophages (M2 macrophages) that are associated with immunoregulatory and tissue-remodeling functions. These macrophage phenotypes need to be discriminated and analyzed to determine their contribution to renal injury. However, there are scarce studies reporting consistent phenotypic and functional information about macrophage subtypes in inflammatory renal disease models, especially in rats. This fact may be related to the limited macrophage markers used in rats, contrary to mice. Therefore, novel strategies are necessary to quantify and characterize the renal content of these infiltrating cells in a reliable way. This manuscript details a protocol for kidney digestion and further phenotypic and quantitative analysis of macrophages from rat kidneys by flow cytometry. Briefly, kidneys were incubated with collagenase and total macrophages were identified according to the dual presence of CD45 (leukocytes common antigen) and CD68 (PAN macrophage marker) in live cells.This was followed by surface staining of CD86 (M1 marker) and CD163 (M2 marker). Rat peritoneal macrophages were used as positive control for macrophage marker detection by flow cytometry. Our protocol resulted in low cellular mortality and allowed characterization of different intracellular and surface protein markers, thus limiting the loss of cellular integrity observed in other protocols. Moreover, this procedure allows the use of macrophages for further techniques, including cell sorting and mRNA or protein expression studies, among others.

This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.

אפיון פנוטיפי של מקרופאגים כליה עכברוש ידי cytometry זרימה

There is increasing evidence suggesting the important role of inflammation and, subsequently, macrophages in the development and progression of renal ...

Small RNA Transfection in Primary Human Th17 Cells by Next Generation Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated from na&#239;ve CD4+ T cells in vitro by activating them in the presence of the polarizing cytokines IL-1&#946;, IL-6, IL-23, and TGF&#946;. Th17 cells orchestrate immunity against extracellular bacteria and fungi, but their aberrant activity has also been associated with several autoimmune and inflammatory diseases. Th17 cells are identified by the chemokine receptor CCR6 and defined by their master transcription factor, ROR&#947;t, and characteristic effector cytokine, IL-17A. Optimized culture conditions for Th17 cell differentiation facilitate mechanistic studies of human T cell biology in a controlled environment. They also provide a setting for studying the importance of specific genes and gene expression programs through RNA interference or the introduction of microRNA (miRNA) mimics or inhibitors. This protocol provides an easy to use, reproducible, and highly efficient method for transient transfection of differentiating primary human Th17 cells with small RNAs using a next generation electroporation device.

Next generation electroporation is an efficient method for transfecting human Th17 cells with small RNAs to alter gene expression and cell behavior.

RNA הקטן Transfection ב ראשוני האדם TH17 תאים על ידי הדור הבא Electroporation

CD4+ T cells can differentiate into several subsets of effector T helper cells depending on the surrounding cytokine milieu. Th17 cells can be generated ...

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

זמן לשגות הדמיה תלת-ממדית של Phagocytosis על ידי העכבר מקרופאגים

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution of inflammation. Accumulation of apoptotic debris in the body may trigger chronic inflammatory responses that lead to systemic autoimmune diseases over time. Impaired apoptotic cell clearance has been implicated in a variety of autoimmune diseases. Apoptotic clearance is a complex process rarely detected under physiological conditions. It involves abundant surface receptors and signaling molecules. Studying the process of apoptotic cell clearance provides insightful molecular mechanisms and subsequent biological responses, which may lead to the development of new therapeutics. Here, we describe protocols for the induction of apoptotic thymocytes, the preparation of peritoneal macrophages, and the analysis of apoptotic cell clearance by flow cytometry and microscopy. All cells will undergo apoptosis at a certain stage, and many residential and circulating cells can uptake apoptotic debris. Therefore, the protocol described here can be used in many applications to characterize apoptotic cell binding and ingestion by many other cell types.

Here, we present a protocol to prepare apoptotic thymocytes and peritoneal macrophages and analyze the efficiency of efferocytosis and the specific inhibitor-mediated blocking of apoptotic thymocytes engulfment. This protocol has a broad application in cell-mediated clearance of other particles including artificial beads and bacteria.

אנליזה ניסויית של האפוטוטיק הפיקרוציט על ידי המקפאגים

Cell apoptosis is a natural process and plays a critical role in embryonic development, homeostatic regulation, immune tolerance induction, and resolution ...