Our research program is funded through the Emmy Noether-Program of the German Research Foundation (DFG), grant PR1132/3-1. Further support by the M&#252;ller-Fahnenberg Foundation of the University of Freiburg is gratefully acknowledged. This study was supported in part by the Excellence Initiative of the German Research Foundation (GSC-4, Spemann Graduate School).

1.神経細胞の回収<ol><li>顕微鏡による評価： <ol><li>実験を開始する前に、明視野または位相差顕微鏡による培養物の状態を確認。 注：解剖から得られた一次神経組織ではあるが、原則的に、均等に影響を受けやすいサイトメトリー分析14,28を流れるように、プロトコルの焦点はインビトロ神経細胞システムから得られた細胞であることに注意してください。 </li></ol></li><li>収穫細胞7： <ol><li> RT（ 例えば 、T75フラスコに5 mlの6ウェルプレートにウェル当たり3ミリリットル、または10 mlの優しく/ Ca 2+のMgを有する接着細胞の皿/フラスコを洗浄2+を含まないリン酸緩衝生理食塩水（PBS） 10cmディッシュ）。 注：PBSをプロトコル全体で使用さは、Mg 2+ / Ca 2+の自由である。 <ol><li>ビデオ例えば、80％のコンフルエンシーでSH-SY5Y神経芽細胞腫細胞のT75フラスコを使用する。例ここで追加の洗浄工程を適用しますかなりの破片が皿の中の存在である。 </li><li>血清アルブミンを含むPBS 48を 、パーコール、またはフィコール49遠心分離勾配および/ ​​または市販のビーズ50,51との洗浄を考慮してください。ミエリンおよび他の脂質または他の汚染物質の除去は、成人原発組織源が使用されている場合は特に重要である。 </li></ol></li><li>組織培養容器の表面全体を覆​​って適切な音量で予め温めておいた（37℃）トリプシン置換を加える。 注：あるいは、のAccutaseまたは他の酵素消化のオプションを検討してください。この重要な工程は、負（7参照）表面エピトープの発現に影響を及ぼし得る。 </li><li>細胞は切り離すことができるように（細胞型に応じて）を5分間2 - 37℃で皿/フラスコをインキュベートする。静かに細胞を取り除くために、血清学的ピペットで組織培養容器またはフラッシュをタップします。 （このように、後の工程での細胞の損失および凝固を引き起こす可能性があります）消化の上は避けてください。 </li><li> Q二回フローバッファー（PBS中の2％FBS）の体積を添加することによりトリプシン交換uenchし、15mlコニカルチューブ中で細胞を集める。 </li><li>単一細胞懸濁液を調製するために - （1,000μlの100）または5ミリリットルの血清学的ピペットを穏やかにマイクロピペットを用いて細胞懸濁液を粉砕する。 </li><li> 25℃で5分間、220×gで細胞を集める。慎重に後ろにペレットを残して上清を吸引除去する。 </li><li>フローバッファの適切な体積でペレットを再懸濁ペレット（ 例えば、サイズに応じて、SH-SY5Y細胞の一つコンフルエントT75フラスコのための典型的な収率は、少なくとも10×10 6個の細胞を、ケース内のセルであるフロー緩衝液5ml）中に再懸濁する。 注： - 100μmのメッシュ大きなチャンクまたは凝固が認められた場合、30を介してフィルタリングする。 </li></ol></li><li> 52を数えるセル： <ol><li> trは、体積で定義された比率で微量遠心管に細胞懸濁液の少量のアリコートを移し、希釈血球計または自動細胞計数システムへの転送前にypan青または代替可能性染料。 </li><li> （CFSE標識に進む場合）0.1％BSAでフローバッファーまたはPBSの適切な体積を添加することによって、1×10 6生細胞/ mlの濃度の細胞懸濁液を希釈する。 NOTE：ヨウ化プロピジウム、7-アミノD、アネキシンV及び市販の固定可能な生存率アッセイキットは、細胞の生存率を評価するための代替オプションを表す。また、先に記載53のようにカスパーゼ3蛍光を用いてアポトーシスアッセイを使用することができる。蛍光チャネルは、すべてのサンプルに含まれている場合、後続のステップのためのオプションが制限される場合があり、これらの試薬により「占有」されます。 </li></ol></li></ol> CFSEを使用して2細胞内の色素の標識（図3） <ol><li>容易に使用することができ、所望のストック濃度にCFSE希釈する。 注：これらの実験のためのストック濃度0.01ミリモルを用いた。経験的にCFSEの最適な使用濃度を決定します。 </li><li> 0.1μMの最終濃度のために細胞（ セクション1.3.2、PBS + 0.1％BSA中1×10 6細胞/ mlの濃度）の1mlあたり0.01 mMのCFSE溶液10μlを追加します。簡単に言えば渦はよく混合する。 注：ここで使用CFSE濃度は、一般的に増殖アッセイに適用されるものよりも約10倍低い、染料のため、細胞毒性は最小限に抑えられます。我々は、細胞の生存率にマイナスの効果を観察しないでください。 </li><li>絶えず振盪（200rpm）しながら室温で5分間インキュベートする。光から保護します。 </li><li>チューブに流れバッファの5ボリュームを追加することで染料を消光。 RTで5分間94×gで遠心分離する。 </li><li>背後にペレットを残して上澄みを捨てる。フロー·バッファの5ボリュームで細胞を再懸濁する。 </li><li> RTで5分間94×gで遠心分離する。 / 1×10 6細胞の濃度で上清を、フロー緩衝液中の再懸濁細胞を捨てる<html>ミリリットル。 </li><li>染色された細胞懸濁液に興味のある非染色細胞の数と同じ数を追加します。抗原染色プロトコル（ 第3節 ） を表面に進みます。 </li></ol><img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" width="700" /> CFSE色素標識を介して2つの細胞株の間の差動CD表面抗原発現の図3の検出。SH-SY5Y神経芽腫細胞を非標識BJ線維芽細胞と比較して、後続の識別のためCFSEで予め標識されている。表面マーカーCD24またはCD54（APCへの結合の両方）との混合試料（右パネル）の共染色は、細胞株によりCFSE染色（;矢頭= BJ線維芽細胞の矢印= SH-SY5Y）に容易に識別可能であることを示している。 SH-SY5Y細胞の大多数は、CD24ではないCD54（ICAM-1）を発現する。これとは対照的に、BJ線維芽細胞（CFSE陰性）は、CD54陽性であるが、CD24のための大部分はネガティブ。「https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 3.細胞表面染色<ol><li>サンプルおよびクリティカルコントロールを含むラベルチューブ（ 表1参照）。 </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>チューブなし。 </td><td>サンプル名</td><td>抗原フォア</td><td>希釈</td></tr><tr><td> 1 </td><td>非染色細胞</td><td> - </td><td></td></tr><tr><td> 2 </td><td>シングルステンド</td><td> CD24-APC </td><td>午前1時50分</td></tr><tr><td> 3 </td><td>シングルステンド</td><td> TUJ1-アレクサフルオロ488 </td><td> 1：2000 </td></tr><tr><td> 4 </td><td>ステンドダブル</td><td> CD24-APC </td><td>午前1時50分</td></tr><tr><td></td><td></td><td> TUJ1-アレクサフルオロ488 </td><td> 1：2000 </td></tr><tr><td> 5 </td><td>シングルステンド</td><td>セカンダリのみ：アレクサフルオロ488 </td><td> 1：2000 </td></tr></tbody></table> 典型的なフローサイトメトリー実験に含まれるチューブの表1. Lイスト。表には、このビデオの記事で説明した共染色実験に必要なサンプル管の最小セットを示しています。理想的な実験は、得られた結果の正確な解釈のために必要なすべての（正、負、ならびに補償制御）の制御を含む必要がある。 <ol start="2"><li> （ セクション2.7または1.3.2からの）各1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに100μlの細胞懸濁液を追加します。 注：必ず、0.1×10 6細胞の最小値は、細胞懸濁液100μlあたり存在していることを確認します。 </li><li>適切な希釈でサンプルにフォアコンジュゲートした抗体を追加します。 注：実験前に各抗体の作業希釈を決定します。リストOについては、表2を参照してくださいF神経表面抗原。 </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>抗原</td><td>細胞型</td><td>リファレンス</td></tr><tr><td> CD15 </td><td>神経幹細胞</td><td> [28、67] </td></tr><tr><td> CD24 </td><td>神経細胞</td><td> [28、68] </td></tr><tr><td> CD29 </td><td>神経幹細胞</td><td> [28、69、70] </td></tr><tr><td> CD44 </td><td>グリア細胞</td><td> [25] </td></tr><tr><td>たCD49f </td><td>神経幹細胞</td><td> [38] </td></tr><tr><td> CD56（NCAM） </td><td>神経細胞</td><td> [71] </td></tr><tr><td> CD133 </td><td>神経幹細胞</td><td> [27] </td></tr><tr><td> CD184 </td><td>神経幹細胞およびグリア細胞</td><td> [25] </td></tr><tr><td> CD200 </td><td>神経細胞</td><td> [38] </td></tr><tr><td> CD271 </td><td>神経堤幹細胞</td><tD&gt; [25] </td></tr><tr><td> A2B5 </td><td>グリア細胞</td><td> [31] </td></tr><tr><td>コリン</td><td>ドーパミン作動性前駆体</td><td> [35、36] </td></tr><tr><td> FORSE1 </td><td>神経幹細胞（NSC） </td><td> [72] </td></tr><tr><td> GLAST </td><td>グリア細胞</td><td> [33] </td></tr><tr><td> NG2 </td><td>グリア細胞</td><td> [32] </td></tr></tbody></table> 神経表面抗原の表2の選択。この表は、神経系統を特徴づけるために使用される表面抗原の増加パネルを例示するために、様々な神経細胞タイプによって発現されることが見出され、表面エピトープのリストを提供する。この選択が完了し、これらのマーカーのほとんどは、他の神経および非神経細胞の範囲で表現されていることをほど遠いであることに注意してください。したがって、いくつかのマーカーの組み合わせは、より良い示さ神経サブセットを定義し、単離するために必要とされる。 <ol stアート= &quot;4&quot;&gt; <li>暗闇の中でオービタルシェーカー（200 rpm）で30分間インキュベートする。 </li><li>フロー緩衝液洗浄<ol><li>チューブに流れ緩衝液1mlを追加します。 4℃で4分間380×gで遠心し。 </li><li>背後にペレットを残して上澄みを捨てる。 </li></ol></li><li>再び洗浄ステップを繰り返します。 </li><li> 2回目の洗浄の後、上清をデカントし、100μlの最終容量に流れバッファー中で細胞を再懸濁する。 </li><li>フローサイトメトリー分析のためのサンプルを使用してください。また、 第4節と5に進みます。 注：細胞が選別し、培養後のFACSに戻されるべきである場合（ つまり、固定または透過処理せずに実行可能な細胞懸濁液）は、収穫、染色および分析ステップの間に無菌技術を適用します。 </li></ol> 4.固定および透過38 <ol><li>パラホルムアルデヒド（PFA）を使用して固定。 <ol><li> PBS中の2％PFAを含む固定バッファを準備します。 <br/&gt;注：PFAは人間や環境に有害である。適切な個人保護具を使用して、地域の規制に従って廃棄物を捨てる。 </li><li>細胞懸濁液100μlに固定緩衝液500μlを追加。 </li><li>暗闇の中でオービタルシェーカー（100 rpm）の上で室温で15分間チューブをインキュベートします。 </li></ol></li><li> PBS洗浄。 <ol><li>チューブに1mlのPBSを追加します。 4℃で3分間380×gで遠心し。 </li><li>チューブに約100μlのを残して上清をデカント/捨てる。 </li></ol></li><li> Tween-20を持つ透過化： <ol><li> PBS中の0.7％のTween-20を含む透過化バッファを準備します。 </li><li>細胞懸濁液100μlに透過化緩衝液500μlを追加。 </li><li>暗闇の中でオービタルシェーカー（100 rpm）の上で室温で15分間チューブをインキュベートします。 </li></ol></li><li> （4.2節で説明したように）をPBSで細胞を1回洗浄し、チューブのcoから上清を除去mpletely、背後にある唯一のペレットを残す。 </li></ol> 5.細胞内抗原染色38（図4） <ol><li>一次抗体溶液の調製： <ol><li> 1％ウシ血清アルブミン、10％血清（ 例えば、正常ロバ又はヤギ血清）および0.5％Tween-20をPBS中に含有する希釈緩衝液中の一次抗体を希釈する。 注：二次抗体がで提起された種に応じて、使用する血清を選択してください。 </li><li>また、メーカーの指示に従って、一次抗体のゼノンフルオレセイン標識を使用しています。 <ol><li>適切な希釈（20μlの≤総量）でPBS中に一次抗体1μgのを準備します。 </li><li>抗体溶液にゼノンフルオレセインのIgG標識試薬（成分A）の5μlを添加する。 </li><li> RTで5分間混合物をインキュベートする。 </li><li>反応混合物にゼノンブロッキング試薬（成分B）の5μlを添加する。 </li><li>インキュベートRTで5分間混合。 30分以内にサンプルに抗体を適用します。 </li></ol></li></ol></li><li>一次抗体染色： <ol><li>細胞ペレットに一次抗体溶液100μlを加え、穏やかに混合するために粉砕する。 </li><li>また、適切な希釈で細胞懸濁液にゼノンのフルオレセイン標識抗体を追加。 </li><li>光から保護し、オービタルシェーカー（200rpm）し、上で室温で30分間チューブをインキュベートします。 （セクション4.2で説明したように）、PBSで細胞を1回洗浄し背後にある唯一のペレットを残して、完全にチューブから上清を除去。 </li></ol></li><li> （ゼノンフルオレセイン標識抗体には必要ありません）二次抗体染色： <ol><li>適切な濃度でPBS中に二次抗体を希釈する。 </li><li>細胞ペレットに二次抗体溶液100μlを加え、穏やかに混合するために粉砕する。暗闇の中でシェーカー（200 rpm）の上で、室温で30分間チューブをインキュベートします。 </li></ol></li><li> （4.2節で説明したように）PBSでサンプルを2回洗浄します。 </li><li>フロー緩衝液で1回洗浄する（3.5節を参照）。 </li><li>フロー·バッファの約150μlの細胞を再懸濁し、フローサイトメーターで分析する。 </li></ol><img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" width="700" /> 表面および細胞内タンパク質の、図4の共染色。フローサイトメトリーのデータの一次+二次抗体ベースの表面染色と組み合わせたゼノンフルオレセインベースの細胞内染色の対の間の比較を例示する。 y軸（左上象限）及びx軸（右下象限）の排他的陽性はそれぞれ、MAP2およびCD24について染色した細胞を示す。共染色した後、共有MAP2及びCD24の発現は、右上象限（右パネル）に見ることができる。使用しての比較アレクサフルオロ488。MAP2標識利回り同様の結果のためのゼノンフルオレセイン（下）対（上AF488） <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 6.フローサイトメトリー分析<ol><li>信号検出のための適切なフィルターを、フローサイトメーターを用いて染色プロトコルの完了直後にフローサイトメトリー分析を行う。 FL-1（30分の533）、FL-2（40分の585）、およびFL-4（25分の675）バンドパスフィルタと488nmの青と640nmの赤色レーザーを使用してください。 </li><li>破片および死細胞を除く前方および側方散乱に基づいて主ゲートを設定します。 </li><li>未染色標本とシングルステンドコントロールを使用して、スペクトルの重複のための補償に基づく≤0.5％に表面と細胞内抗原のための蛍光ゲートを設定します。 </li></ol>

The authors declare no potential conflicts of interest.

ここに提示されたプロトコルがよくヒト幹細胞由来の神経細胞培養のために確立されているが、同様の一次組織または神経細胞株を含む他の神経細胞供給源に適用することができる。胚のソースに加えて、神経幹細胞または前駆細胞は、成人の脳27の神経原性領域から抽出することができる。また、フローサイトメトリーおよびFACSが成熟ニューロン54、アストロ33、ミ...

フローサイトメトリーを広範囲に固有の散乱特性、細胞表面抗原の発現、および他の蛍光パラメーター1-3を介して細胞集団を定義するために、免疫学、血液学および腫瘍学に ​​おいて利用されてきた。血液系統の開発および疾患に私達の洞察は、その初期の実装4,5の後にこの方法論の連続洗練の有意な程度の結果である。フローサイトメトリーの定量的および全体的な分析的な潜在意識の高まりは、最近、幹細胞研究におけるそのより広範な使用を奨励している短い時間枠6と同様に深い進歩を可能にすることができる。しかし、特に神経集団を分析し、単離するためのフローサイトメトリーの適用は、長い挑戦として認識されている。当然、懸濁液中に存在する造血細胞とは対照的に、神経細胞型は、典型的には、グリアおよび様々Oを含んでいてもよい過度に複雑なソースから収穫するTHER周囲の細胞ならびにプロセス有利子ニューロンの複雑なネットワーク。したがって、神経生物学、毎日研究ルーチンでの完全な電位にフローサイトメトリーの多様性を実現するために至っていない。しかし、神経生物学における分析レパートリーの貴重な要素とみなすことができる限り、生存単一細胞懸濁液を生成することができる（およびプロトコルは、その目的の7のために考案し、最適化されている）として、フローサイトメトリーおよび蛍光活性化細胞選別（FACS） 8-11。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" width="600" /> 。流体工学、光学、エレクトロニクス： フローサイトメトリー分析フローサイトメーターの構成要素の、図1の原理フローサイトメーターは、3つの主要な系を含む。 （一次組織から、またはインビトロ培養中で調製）懸濁液中の細胞の層流をシースfluiによって達成される流体力学経由dは、その中心コアにサンプルを限定フォーカシング。光学部品は、適切な検出器に信号を導く細胞および光学フィルタのストリームを照らすレーザーで構成されている。検出された光信号は、電気信号に変換し、その後、コンピュータで処理し、データ分析とゲーティングのためのモニター上で可視化されている<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig1highres.jpg" target="_blank">。この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> サイトメーターのビルディングブロックを含む根本的なファンダメンタルズの少なくとも基本的な理解から、フローサイトメトリー法利益のユーザーは、（レビューのために12,13を参照してください。また、 図1を参照）。レーザビームは、次に、「単一のファイル」次々レーザビームを通過懸濁液中の細胞を含み、流体力学的に集束流体の流れと交差する。 interceptiこの呼掛け点からの光の散乱レーザ結果と細胞（またはそのことについては、他の粒子）の上。散乱光は、レーザー方向（粒の大きさに関連付けられた前方散乱）、ならびにその方向に垂直な（;粒子/細胞のgranulosityを反映する側方散乱）を連続して検出することができる。これらの前述の散乱特性は、（またまたは細胞破片、空気の泡、 など ）、非標識試料は、一般的に最初のゲーティングのために使用される側方散乱プロット変量前方散乱の信号（イベント）が生成されますなぜ特異的標識を必要としない。適切なレーザ及び対応する励起および発光スペクトルのために特定のフィルタを使用することにより、細胞は、その陽性、強度のレベル、または蛍光マーカーの非存在について分析することができる。フローサイトメトリー用途の大部分は、細胞表面抗原を介して特性評価に焦点を当てている。造血lineagとは異なり、eは、神経系統は、表面エピトープの発現パターン5によれば以下広く定義されて残っている。表面抗原を利用することの利点の一つは、生きている細胞は、FACSなどのパラダイムを選別細胞を施すことができることである。これとは対照的に、細胞内抗原の染色は、生細胞を必要とする下流の適用を排除する、エピトープ - 抗体相互作用を媒介するために固定および透過手順が必要です。注目すべきは、このようなアプローチは、まだ数多くの定量的アッセイ14だけでなく、RNAとタンパク質発現の15のための下流の分析を可能にします。血液学、免疫学および腫瘍学は、多くの場合、特定の部分集団16を定義するために連携してダース以上のマーカーを使用してきた。さらに、質量フローサイトメトリーまたはCyTOFは現在30のパラメータを同時に17,18まで分析することができる。 神経幹細胞の用途、ならびに初代培養物における細胞の不均一性のために14,19,20体外は一般的な現象で21-23です。興味のある標的集団を代表していない細胞は、実験的な読み出し24,25のための潜在的交絡因子を具現化。好都合には、不均一な細胞懸濁液中に存在する異なる細胞のサブセットは、これらの様々な集団を定義するために利用することができる抗原の発現プロファイル、（既知の、またはまだ解読する）別個に耐える。したがって、細胞の不均一性を解決する際に重要な役割を果たし、それによって、（in vitroアッセイ 、細胞療法における ）生物医学的適用を容易にし、最も関連性のサブセット24,26に着目して定量的な読み出しを最適化することができるフローサイトメトリー。種々の表面抗原の組み合わせは、特定の神経細胞型の定量および単離を可能にするために、過去数年にわたって確認されている。これは、神経幹細胞27、NSCの単離のためのCD15 / CD24 / CD29表面抗原の組み合わせの濃縮にCD133を含み、差異他の署名29,30の中で、神経およびグリアサブセット25を分離するためのテッドニューロンと神経堤細胞28またはCD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271。ニューロンを超えて、グリアマーカーは、A2B5 31、CD44 25、NG2 32とGLAST 33が含まれています。最近の出版物は、パーキンソン細胞移植におけるドーパミン作動性前駆体を濃縮するために、中脳底板前駆体マーカーコリン34,35を36パラダイムに利用している。 CD分子は、マーカーが、細胞-細胞相互作用および細胞外マトリックス分子および成長因子37からの合図に応答する細胞の能力の機能的に関連するメディエーターだけではない。さらに、神経系統の発達を特徴づけるために、コンビナトリアルCD抗原の武器を強化する一つの戦略は、目的の特定の細胞型のためのCD抗原の組み合わせをスクリーニングし、定義することが知られている細胞内マーカーを使用することである。我々は最近、このようなアプローチを悪用し、CD4を特定した9F - / CD200神経に分化誘導された多能性幹細胞培養系38からのニューロンのサブセットを豊かにするための新しいアプローチとして高い組合せ発現パターン。ここでは、表面染色および細胞内染色は、フローサイトメトリーにより神経細胞の亜集団を定義するために同時に使用することができる後者のプロトコル（およびその任意の変形）を議論する。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" width="300" /> 実験プロトコルオプションの図2のフロー図は図は、プロトコルに関与する主要な工程の概略図を示している。任意の工程（CFSE色素または細胞内抗原の標識は）ライトグレーのボックスで示されます。収穫後、細胞表面染色の前に、神経細胞懸濁液の生存度および細胞数を評価することが不可欠である。陽性と同様にネガティブコントロールは、対象のサンプルに加えて、含まれる必要がある。サンプルは、フローサイトメトリー分析によって分析および/ ​​または細胞ソーティングパラダイムで使用することができる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> 我々は以前に細胞内染色38二次抗体と組み合わせて一次抗体を使用しているが、我々は今、それによって細胞操作39のステップを減らす、わずかな変化などの蛍光Fab断片（Zenon標識）を介して一次抗体の非共有結合標識を導入する。また、プロトコルの汎用性のさらなる例としては、抗原染色表面の前スクシンイミジルエステル（CFSE）のカルボキシフルオレセインずつの実験のサブセットの任意の標識を使用する。このようなCFSEプレ標識は（2つの細胞株または実験条件の即時の直接比較を可能にする対 CFSE標識。分散またはインキュベーション時間の微妙な違いを削減し、抗体を保存する、単一のサンプルチューブ内で）標識されていない。 CFSEは、一般的に増殖41,42及びバーコード実験43,44において、細胞追跡40のために使用される確立された蛍光色素である。最後に、ここで説明収穫とラベル付けの手順は実行し、実際のソート·ステップ（FACS、免疫磁気細胞分離またはイムノ）は原則的に、このプロトコルの一部ではありませんが、降伏抗原表面受けることができるサンプルまたは細胞内のラベルベースの​​並べ替えのアプリケーション15 25,28。 この記事では、我々はを目指し：として細胞内のCFSE色素標識工程41,45を提示し 、細胞内の標的の検出のためのプロトコルとしてだけでなく、組み合わせた表面と細胞内の抗原解析38をまとめ、実行可能な表面抗原染色プロトコル25,28をまとめるcomのための実験的なオプションparativeは、神経細胞集団の解析、およびサイトメトリー分析を（適切なコントロール13,46、戦略およびデータプレゼンテーション47をゲート制御）流れるようにアプローチをまとめる。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:456px;">DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)</td>
			<td style="width:207px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:124px;">11330057</td>
			<td style="width:149px;">www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">DPBS without Ca2+ Mg2+</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190169</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10270-106</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">MEM Non-essential amino acids (100 x)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140035</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">TrypLE Express</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12604013</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Trypan blue solution, 0.4%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250061</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>335.3</td>
			<td>www.carlroth.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Bovine serum albumin (BSA) Fraction V</td>
			<td>PAA Laboratories, Coelbe</td>
			<td>K41-001</td>
			<td>www.gelifesciences.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Tween-20 Detergent</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>655205</td>
			<td>www.merckmillipore.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>65-0850-84</td>
			<td>www.ebioscience.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">DMSO</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A1584</td>
			<td>www.applichem.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Bottle top filters express plus 0.22 &#181;m, 250 ml</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SCGPU02RE</td>
			<td>www.millipore.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Cell culture treated flasks (T 25)</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>156367</td>
			<td>www.thermoscientific.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Cell culture treated flasks (T 75)</td>
			<td>NUNC</td>
			<td>156499</td>
			<td>www.thermoscientific.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Conical tubes (15 ml)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>188271</td>
			<td>www.greinerbioone.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Conical tubes (50 ml)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>227261</td>
			<td>www.greinerbioone.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pasteur pipet, glass (150 mm)</td>
			<td>STEIN Labortechnik, Remchingen</td>
			<td>S03710150</td>
			<td>www.stein-labortechnik.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pipet tips (0.1-10 &#181;l)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4125</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pipet tips (1-200 &#181;l)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4126</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pipet tips (100-1000 &#181;l)</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4129</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Serological pipets, 5 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4051</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Serological pipets, 10 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4101</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Serological pipets, 25 ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>4251</td>
			<td>www.corning.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microcentrifuge tubes (0.5 ml)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,699</td>
			<td>www.sarstedt.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microcentrifuge tubes (1.5 ml)</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>616201</td>
			<td>www.greinerbioone.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microcentrifuge tubes (2.0 ml)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,695,500</td>
			<td>www.sarstedt.com</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0247-42</td>
			<td>www.ebioscience.com 
			Working dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0549-42</td>
			<td>www.ebioscience.com 
			Working dilution 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:456px;">Neuronal Class III &#946;-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody</td>
			<td>Covance</td>
			<td>PRB-435P</td>
			<td>www.covance.com 
			Working dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A21206</td>
			<td>www.lifetechnologies.com 
			Working dilution 1:2000</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Zenon&#174; Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Z-25342</td>
			<td>www.lifetechnologies.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Neubauer-Improved counting chamber</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>0640010</td>
			<td>www.marienfeld-superior.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vortex</td>
			<td>Scientific Industries</td>
			<td>G560E</td>
			<td>www.scientificindustries.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Thermomixer comfort</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5355 000.001</td>
			<td>www.eppendorf.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Accuri C6 flow cytometer</td>
			<td>Becton Dickinson (BD)</td>
			<td align="right">653118</td>
			<td>www.bdbiosciences.com/instruments/accuri</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R</td>
			<td>Peqlab</td>
			<td>91-PSPIN-24R</td>
			<td>www.peqlab.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Orbital shaker, Unimax 1010</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>543-12310-00</td>
			<td>www.heidolph-instruments.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC</td>
			<td>Hettich</td>
			<td>4480-50</td>
			<td>www.hettichlab.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Class II Biological safety cabinet Safe 2020</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51026640</td>
			<td>www.thermoscientific.com</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 Incubator, Heracell 240i</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">51026331</td>
			<td>www.thermoscientific.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Vacuum system, Vacusafe comfort</td>
			<td>Integra Biosciences</td>
			<td align="right">158320</td>
			<td>www.integra-biosciences.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Microscope, Axiovert 40 CFL</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td align="right">451212</td>
			<td>www.zeiss.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Pipet controller, accu-jet pro</td>
			<td>Brand</td>
			<td align="right">26303</td>
			<td>www.brand.de</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 &#181;l)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144563</td>
			<td>www.gilson.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 &#181;l)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144565</td>
			<td>www.gilson.com</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;">Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 &#181;l)</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F144566</td>
			<td>www.gilson.com</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of protocols for flow cytometric analysis of the cluster of differentiation (CD) surface antigens and intracellular antigens in neural cell types. Our step-by-step description of the methodological procedures include: the harvesting of neural in vitro cultures, an optional carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeling step, followed by surface antigen staining with conjugated CD antibodies (e.g., CD24, CD54), and subsequent intracellar antigen detection via primary/secondary antibodies or fluorescently labeled Fab fragments (Zenon labeling). The video demonstrates the most critical steps. Moreover, principles of experimental planning, the inclusion of critical controls, and fundamentals of flow cytometric analysis (identification of target population and exclusion of debris; gating strategy; compensation for spectral overlap) are briefly explained in order to enable neurobiologists with limited prior knowledge or specific training in flow cytometry to assess its utility and to better exploit this powerful methodology.

ここで紹介するプロトコルは、汎用性の実験的アプローチ（ 図2）を可能にします。その短いバージョン（1、3、6ステップ ）においては、表面抗原の単純な染色のためのガイドと考えることができる。そのより複雑な形態において、細胞内抗原の範囲で共標識パラダイムの数は（2および/ ​​または4〜5の任意の工程 ）を追求す...

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Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

神経細胞型の表面のためのフローサイトメトリーのプロトコルおよび細胞内抗原解析

Flow cytometry has been extensively used to define cell populations in immunology, hematology and oncology. Here, we provide a detailed description of ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

51.8K ビュー.  University of Freiburg. We provide a detailed description of a protocol for flow cytometric analysis of surface antigens and/or intracellular antigens in neural cell types. Critical aspects of experimental planning, step-by-step methodological procedures, and fundamental principles of flow cytometry are explained in order to enable neurobiologists to exploit this powerful technology.

ビデオ: Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

ホールマウントマッスル分析による再現性のあるマウスの坐骨神経クラッシュと再生のその後の評価

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

神経科学

The Neuroblast Assay: An Assay for the Generation and Enrichment of Neuronal Progenitor Cells from Differentiating Neural Stem Cell Progeny Using Flow Cytometry

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of the central nervous system (CNS); namely, astrocytes, oligodendrocytes and neurons. These characteristics make neural stem and progenitor cells an invaluable renewable source of cells for in vitro studies such as drug screening, neurotoxicology and electrophysiology and also for cell replacement therapy in many neurological diseases. In practice, however, heterogeneity of NSC progeny, low production of neurons and oligodendrocytes, and predominance of astrocytes following differentiation limit their clinical applications. Here, we describe a novel methodology for the generation and subsequent purification of immature neurons from murine NSC progeny using fluorescence activated cell sorting (FACS) technology. Using this methodology, a highly enriched neuronal progenitor cell population can be achieved without any noticeable astrocyte and bona fide NSC contamination. The procedure includes differentiation of NSC progeny isolated and expanded from E14 mouse ganglionic eminences using the neurosphere assay, followed by isolation and enrichment of immature neuronal cells based on their physical (size and internal complexity) and fluorescent properties using flow cytometry technology. Overall, it takes 5-7 days to generate neurospheres and 6-8 days to differentiate NSC progeny and isolate highly purified immature neuronal cells.

This video protocol demonstrates a novel method for the generation and subsequent purification of neuronal progenitor cells from a renewable source of neural stem cells (NSCs) based on their physical (size and internal granularity) and fluorescent properties using flow cytometry technology.

神経芽細胞アッセイ：フローサイトメトリーを用いて神経幹細胞の子孫を差別から神経前駆細胞の生成と濃縮のためのアッセイ

Neural stem cells (NSCs) can be isolated and expanded in large-scale, using the neurosphere assay and differentiated into the three major cell types of ...

Isolation and Culture of Neural Crest Cells from Embryonic Murine Neural Tube

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to mesenchymal transition (EMT) and migrates throughout the embryo, giving rise to diverse cell types 1-3. NC also has the unique ability to influence the differentiation and maturation of target organs4-6. When explanted in vitro, NC progenitors undergo self-renewal, migrate and differentiate into a variety of tissue types including neurons, glia, smooth muscle cells, cartilage and bone. 
NC multipotency was first described from explants of the avian neural tube7-9. In vitro isolation of NC cells facilitates the study of NC dynamics including proliferation, migration, and multipotency. Further work in the avian and rat systems demonstrated that explanted NC cells retain their NC potential when transplanted back into the embryo10-13. Because these inherent cellular properties are preserved in explanted NC progenitors, the neural tube explant assay provides an attractive option for studying the NC in vitro. 
To attain a better understanding of the mammalian NC, many methods have been employed to isolate NC populations. NC-derived progenitors can be cultured from post-migratory locations in both the embryo and adult to study the dynamics of post-migratory NC progenitors11,14-20, however isolation of NC progenitors as they emigrate from the neural tube provides optimal preservation of NC cell potential and migratory properties13,21,22. Some protocols employ fluorescence activated cell sorting (FACS) to isolate a NC population enriched for particular progenitors11,13,14,17. However, when starting with early stage embryos, cell numbers adequate for analyses are difficult to obtain with FACS, complicating the isolation of early NC populations from individual embryos. Here, we describe an approach that does not rely on FACS and results in an approximately 96% pure NC population based on a Wnt1-Cre activated lineage reporter23. 
The method presented here is adapted from protocols optimized for the culture of rat NC11,13. The advantages of this protocol compared to previous methods are that 1) the cells are not grown on a feeder layer, 2) FACS is not required to obtain a relatively pure NC population, 3) premigratory NC cells are isolated and 4) results are easily quantified. Furthermore, this protocol can be used for isolation of NC from any mutant mouse model, facilitating the study of NC characteristics with different genetic manipulations. The limitation of this approach is that the NC is removed from the context of the embryo, which is known to influence the survival, migration and differentiation of the NC2,24-28.

Isolation of embryonic neural crest from the neural tube facilitates the use of in vitro methods for studying migration, self-renewal, and multipotency of neural crest.

胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

The embryonic neural crest (NC) is a multipotent progenitor population that originates at the dorsal aspect of the neural tube, undergoes an epithelial to ...

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

最適化されたNを使用して急性脳スライスの準備-メチル-D-glucamine 保護回復法

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Enumeration of Neural Stem Cells Using Clonal Assays

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. NSCs and neural progenitors (NPs) are commonly cultured in vitro as neurospheres. This protocol describes in detail how to determine the NSC frequency in a given cell population under clonal conditions. The protocol begins with the seeding of the cells at a density that allows for the generation of clonal neurospheres. The neurospheres are then transferred to chambered coverslips and differentiated under clonal conditions in conditioned medium, which maximizes the differentiation potential of the neurospheres. Finally, the NSC frequency is calculated based on neurosphere formation and multipotency capabilities. Utilities of this protocol include the evaluation of candidate NSC markers, purification of NSCs, and the ability to distinguish NSCs from NPs. This method takes 13 days to perform, which is much shorter than current methods to enumerate NSC frequency.

Neural stem cells (NSCs) refer to cells&#160;which can self-renew and differentiate into the three neural lineages. Here, we describe a protocol to determine NSC frequency in a given cell population using neurosphere formation and differentiation under clonal conditions.

クローンのアッセイを用いて神経幹細胞の列挙

Neural stem cells (NSCs) have the ability to self-renew and generate the three major neural lineages &#8212; astrocytes, neurons and oligodendrocytes. ...

Development of a Refined Protocol for Trans-scleral Subretinal Transplantation of Human Retinal Pigment Epithelial Cells into Rat Eyes

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is characterized by the degeneration of retinal pigment epithelial (RPE) cells, which are a monolayer of cells functionally supporting and anatomically wrapping around the neural retina. Current pharmacological treatments for the non-neovascular AMD (dry AMD) only slow down the disease progression but cannot restore vision, necessitating studies aimed at identifying novel therapeutic strategies. Replacing the degenerative RPE cells with healthy cells holds promise to treat dry AMD in the future. Extensive preclinical studies of stem cell replacement therapies for AMD involve the transplantation of stem cell-derived RPE cells into the subretinal space of animal models, in which the subretinal injection technique is applied. The approach most frequently used in these preclinical animal studies is through the trans-scleral route, which is made difficult by the lack of direct visualization of the needle end and can often result in retinal damage. An alternative approach through the vitreous allows for direct observation of the needle end position, but it carries a high risk of surgical traumas as more eye tissues are disturbed. We have developed a less risky and reproducible modified trans-scleral injection method that uses defined needle angles and depths to successfully and consistently deliver RPE cells into the rat subretinal space and avoid excessive retinal damage. Cells delivered in this manner have been previously demonstrated to be efficacious in the Royal College of Surgeons (RCS) rat for at least 2 months. This technique can be used not only for cell transplantation but also for delivery of small molecules or gene therapies.

Subretinal injection has been widely applied in preclinical studies of stem cell replacement therapy for age-related macular degeneration. In this visualized article, we describe a less risky, reproducible and precisely modified subretinal injection technique via the trans-scleral approach to deliver cells into rat eyes.

強膜網膜移植ひと網膜色素上皮細胞のラットの目の洗練されたプロトコルの開発

Degenerative retinal diseases such as age-related macular degeneration (AMD) are the leading cause of irreversible vision loss worldwide. AMD is ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

マイクロ電極アレイにおけるニューロン細胞培養の刺激に対するネットワーク応答の時間依存的増加

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic tectum, is a popular model to study how neural circuits self-assemble. The ability to carry out whole cell patch clamp recordings from tectal neurons and to record RGC-evoked responses, either in vivo or using a whole brain preparation, has generated a large body of high-resolution data about the mechanisms underlying normal, and abnormal, circuit formation and function. Here we describe how to perform the in vivo preparation, the original whole brain preparation, and a more recently developed horizontal brain slice preparation for obtaining whole cell patch clamp recordings from tectal neurons. Each preparation has unique experimental advantages. The in vivo preparation enables the recording of the direct response of tectal neurons to visual stimuli projected onto the eye. The whole brain preparation allows for the RGC axons to be activated in a highly controlled manner, and the horizontal brain slice preparation allows recording from across all layers of the tectum.

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

In this paper, we discuss three brain preparations used for whole cell patch clamp recording to study the retinotectal circuit of Xenopus laevis tadpoles. Each preparation, with its own specific advantages, contributes to the experimental tractability of the Xenopus tadpole as a model to study neural circuit function.

準備やアフリカツメガエルの視蓋ニューロンの全体セル パッチ ・ クランプ記録のためのプロトコル

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized niches in vivo and can be isolated and expanded in vitro, serving as an important resource for cell transplantation to repair brain damage. However, NSPCs are heterogeneous and not clearly defined at the molecular level or purified due to a lack of specific cell surface markers. The protocol presented, which has been previously reported, combines a neural-endothelial co-culture system with a metabolic glycan labeling method to identify the surface sialoglycoproteome of primary NSPCs. The NSPC-endothelial co-culture system allows self-renewal and expansion of primary NSPCs in vitro, generating a sufficient number of NSPCs. Sialoglycans in cultured NSPCs are labeled using an unnatural sialic acid metabolic reporter with bioorthogonal functional groups. By comparing the sialoglycoproteome from self-renewing NSPCs expanded in an endothelial co-culture with differentiating neural culture, we identify a list of membrane proteins that are enriched in NSPCs. In detail, the protocol involves: 1) set-up of an NSPC-endothelial co-culture and NSPC differentiating culture; 2) labeling with azidosugar per-O-acetylated N-azidoacetylmannosamine (Ac4ManNAz); and 3) biotin conjugation to modified sialoglycan for imaging after fixation of neural culture or protein extraction from neural culture for mass spectrometry analysis. Then, the NSPC-enriched surface marker candidates are selected by comparative analysis of mass spectrometry data from both the expanded NSPC and differentiated neural cultures. This protocol is highly sensitive for identifying membrane proteins of low abundance in the starting materials, and it can be applied to marker discovery in other systems with appropriate modifications

Presented here is a protocol that combines an in vitro neural-endothelial co-culture system and metabolic incorporation of sialoglycan with bioorthogonal functional groups to expand primary neural stem and progenitor cells and label their surface sialoglycoproteins for imaging or mass-spectrometry analysis of cell surface markers.

シアログリカンの代謝標識による原発神経幹および前駆細胞の細胞表面マーカーの同定

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...