神経変性疾患を治療するための選択的遺伝子および薬物送達ツールの開発には、細胞標的化の定量化および特性評価、再投与時、またはウイルスベクター、またはナノ粒子が必要である。それらは流れのサイトメトリーの多重性および多重化機能を有し、マウスの脳および脊髄からの複数の細胞タイプの簡単で、同時の識別を可能にする。手順を実証するフランシスコ・ハビエル・モリーナ・エステベス, アレクサンダー研究所のポストドキュメント.
生後8週間のC57ブラック6マウスから脳と脊髄を採取した後、氷の上の井戸あたり2ミリリットルの氷冷HPSSを含む6ウェルプレートの個々の井戸に組織を入れる。収穫した各組織を2つの等しい部分に分けます。そして、各組織サンプルの半分を1〜2ミリメートルの厚さにミンチするためにはさみを使用してください。
すべての組織が断片化されたら、HPSSで改変された1,000マイクロリットルピペットチップをプレリンスし、ピペットを使用して各組織懸濁液を個々の15ミリリットルの円錐管に移す。井戸ごとにHPSSの追加の2ミリリットルで井戸をすすい。そして、対応する15ミリリットルの円錐管でのすきを引っ張ります。
遠心分離によりサンプルを沈下する。そして、サンプル当たりのキットから1,900マイクロリットルのバッファXと神経組織解離キットから酵素Pの50マイクロリットルを混合します。酵素ミックスを摂氏37度で少なくとも10分間温めます。
そして各組織採取管から上清を吸引する。酵素混合物の準備ができたら、各サンプルに溶液の1.95ミリリットルを追加します。そして、ペレットを再中断するために穏やかに渦。
次に、ホイール上のサンプルを摂氏37度で15分間インキュベートし、10マイクロリットルの酵素Aを1サンプル当たり20マイクロリットルのバッファーYと混合します。2番目の酵素溶液を摂氏37度で予熱し、振盪インキュベーションの終わりに各組織溶液に30マイクロリットルの溶液を加える前に。HPSSでプレリンスした1,000マイクロリットルのピペットチップを使用して、各サンプルを穏やかに混合します。
そして、37°Cで15分間ホイールに標本を戻します。インキュベーションの終わりに、氷冷HPSSの10ミリリットルで酵素反応を逮捕する。そして遠心分離によってサンプルを沈下する。
遠心分離の終わりに、チューブあたり7ミリリットルの氷冷HPSSでペレットを再懸濁する。そして、氷の上にチューブを保持する前に、各サンプルを穏やかに渦。組織均質化の場合は、冷やしたHPSSを、日当りのある組織グラインダーの前チルガラスモルタルに3ミリリットル加え、収穫された脳または脊髄組織サンプルの1つの後半をモルタルに移す。
10ストロークのペスレAで組織を穏やかに浸漬し、続いて10ストロークのペストルB.を新しい15ミリリットル円錐形チューブに移します。チューブを10ミリリットルの最終体積に、遠心分離のためにあらかじめ冷やしたHPSSで満たします。そして、氷の上にサンプルを保持する前に、渦を持つ新鮮なHPSSの7ミリリットルでペレットを再中断します。
破片除去の場合は、消化または均質化されたサンプルごとに、冷やされた等張性パーコール溶液を3ミリリットル加えます。そして、サンプルが均一に混合されていることを確認するために、サンプルを穏やかに渦巻きます。次に、サンプルを遠心分離し、溶液の表面に浮かぶ破片およびミエリンの白っぽい円盤を慎重に取り除く。
破片が廃棄されたら、ペレットを邪魔することなく、各チューブから上澄みの最後の100マイクロリットルを除くすべてを収集します。個々の1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移すFACS BL溶液の1ミリリットルの各ペレットを再中断します。Percollソリューションとの統合後、サンプル損失を避けるために細胞ペレットを取り外すことなく、非常に慎重に破片ディスクと上澄を除去することが重要です。
遠心分離後、各チューブから上清を慎重に吸引し、1管当たり350マイクロリットルの新鮮なFACS BLでペレットを再懸濁します。単離された細胞タイプのフローサイトメトリック解析の場合、表に概説されている定常プロトコルに従って各チューブに適切な抗体を加える前に、チューブ当たりFCブロック当たり5マイクログラムのFCブロックを摂氏4度で10分間インキュベートします。各チューブを5秒間渦を混ぜ合わせます。
そして、光から保護された15分間、サンプルを摂氏4度に置きます。インキュベーションの終わりに、チューブあたり1ミリリットルのPBSと遠心分離機でサンプルを洗浄します。チューブ当たりのストレプトアビジンの適切な量でペレットを再中断します。
混合するボルテックスの後、光から保護された摂氏4度で10分間サンプルをインキュベートします。そして、実証されているように、チューブあたりPBSの1ミリリットルで細胞を洗います。上清を捨て、チューブあたり300マイクロリットルの新鮮なFACS BLでペレットを再懸濁します。
そして、各サンプルに7-AADの5マイクロリットルのラベルを付けます。次に、光から保護された4°Cで、細胞蛍光測定分析までサンプルを保存します。ホモジナイゼーション法は、脳と脊髄の両方からより高い細胞収量を生成するが、取り出される細胞の大部分は、典型的には死んでしまい、その結果、脳から生じる細胞の治癒は約14%であり、約10%は脊髄から治癒する。
対照的に、パパイン消化法は、細胞生存率の全体的により良い保存をもたらす。9色のバイフローサイトメトリーを用いた脳および脊髄細胞懸濁液の分析は、CD45+CD11b+ミクログリア、およびマクロファージの存在を明らかにする。そして、両方の組織のCD45 +CD11bリンパ球。
CD45細胞集団は、その後、アストロサイト、オリゴデンドロサイトマーカー、またはフェリオンおよび内皮表面マーカー発現の陽性に従って識別することができる。均質化法を用いて、生存細胞の32〜38%が造血起源である。酵素消化法は非造血性CD45細胞の非常に大きな割合の取得をもたらす一方で.
驚くべきことに、CD45+CD11b+ミクログリアおよびマクロファージは、均質化法を用いた最も豊富な生存細胞分率を表す。しかし、消化法は、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、内皮細胞、ニューロンを含む細胞タイプのより異種的な表現を生み出す。このプロトコルは汎用性が高く、特定の細胞の亜集団の定量化または単離、一次培養、生化学的、RNAシーケンシング分析など、いくつかの下流アプリケーションに利用される可能性があります。
我々は、この進行の間、または内視鏡的側索硬化症のマウスモデルにおける治療後に、異なるCNS集団の遺伝子発現および機能的シグネチャを評価するためにこのプロトコルを実施した。
