著者は、原稿上のコメントジェフリー·ファレル、ジェームズガニオン、そしてジェニファーバーグマンに感謝したいと思います。 KWRはFDAPアッセイの開発中に国立科学財団大学院研究フェローシッププログラムによってサポートされていました。この作品は、AFSへとPMにドイツ研究財団（エミー·ネータープログラム）、マックス·プランク協会、とヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラム（キャリア開発賞）からの補助金によってNIHからの助成金によってサポートされていました。

1. Photoconvertible融合構築し、ジェクトする絨毛膜を​​除去ゼブラフィッシュ胚の生成<ol><li>ミュラーらのように、融合タンパク質をコードするキャップされたmRNAを生成するために、インビトロ転写を使用し、その後、（説明を参照）緑色〜赤色photoconvertibleタンパク質に融合された関心対象のタンパク質を含有する機能性構築物を生成する。、2012 19。 </li><li> 1細胞期で約30ゼブラフィッシュ胚から絨毛膜を除去するためのプロナーゼを使用してください。あるいは、手動で鉗子28を使用して胚をdechorionate。 注：胚は、その後の画像化のために絨毛膜を除去する必要があります。所望ならば、胚は、撮像直前に、後で絨毛膜を通して注入及び絨毛膜を除去することができる。 <ol><li>標準のゼブラフィッシュ胚培地19中でストレプトミセス·グリセウスからプロナーゼの5mg / mlのストック溶液を作る。プロテアーゼを溶解させるために室温で10分間静かに解決策を揺する。アリコート2メートル-20℃でマイクロチューブにLと凍結。 </li><li> 〜8ミリリットル胚培地を含む直径5cmのガラスまたはアガロースでコーティングされたプラスチック製のペトリ皿に移し1細胞期胚。皿に解凍したプロナーゼ原液の2ミリリットルを追加し、5から10分間、室温でインキュベートする。 </li><li>絨毛膜を除去胚が破裂する原因となりますのいずれかとの接点として、空気やプラスチックに胚を近づけないようにしてください。胚培地で200ミリリットルのガラスビーカーを埋める。媒体中に沈めながら、シャーレを傾けてビーカーに胚を転送します。 </li><li>胚がビーカーの底に沈殿した後、その後ビーカーに新鮮胚培地を注ぐ、胚培地のほとんどを注ぐ。ビーカーに注ぐ媒体の穏やかな旋回は、胚は彼らの弱体化絨毛膜を失うことになります。 </li><li>手順を繰り返し1.2.4。 </li></ol></li><li>フレームド先端がガラスパスツールピペットを用いてアガロースでコーティングされた注射ディッシュ29に絨毛膜を除去した胚を転送します。燃えるようなピペットチップは、負傷の胚からぎざ​​ぎざのエッジを防ぎます。 </li><li> mRNA及び3 kDaのAlexa488標識デキストランコンジュ29,30（;提案されたmRNAとのAlexa488デキストラン金額についての議論を参照してください。図1B）を共同注入する。切断が開始されるとさえmRNAの分布及び蛍光色素を確実にするために、細胞（卵黄ない）の中心に直接注入する。 注：Alexa488標識シグナルは、細胞内および細胞外の蛍光を区別するために、コンパートメントのマスクを生成するために、データ解析中に使用される。 </li><li>転送は、1〜2％アガロースでコーティングされたウェルの胚培地で満たされた6ウェルプラスチック皿に胚を注入した。胚が後半球ステージ31（約5時間後に受精）に到達するまで28℃の暗所でインキュベートする。実体顕微鏡下で胚ごとに1〜2時間をチェックして、死亡した胚によって生成された破片を除去。 </li></ol> P 2.取付ゼブラフィッシュ胚倒立共焦点顕微鏡上hotoconversionとイメージング<ol><li>一から五健全な胚を特定し、皿からそれらを削除するフレームド先端にガラスパスツールピペットを使用するために実体顕微鏡を使用してください。 </li><li>穏やかに1×Danieauの胚培地中で溶融し、1％低融点アガロース（材料リストを参照のこと）（ 図2A）の約1 mlを含むマイクロ遠心チューブに胚を取り出す。 注：アガロースを40と42℃の間の温度を有するべきである。より高い温度は、胚を損傷する恐れがあります。 </li><li>いくつかのアガロースと一緒に戻ってピペットに胚を描画します。静かにグラスボトムディッシュ（ 図2B）のカバーガラス上にアガロースおよび胚を取り出してください。カバーガラスの厚さは共焦点顕微鏡上の目的と互換性があることを確認してください。 <ol><li>必要に応じて、ガラスピペットを再利用。ピペットの外に残留アガロースをきれいにし、上下にすばやく目詰まり、ピペット胚培地を防ぐために。この目的のための実体顕微鏡の隣にある胚培地の〜5ミリリットルで満たされた15ミリリットルチューブを置きます。 </li></ol></li><li>動物極（胚盤葉）はカバーガラスに対向するように胚を位置決めする金属プローブを使用する。アガロースは20〜30秒で固化するので、すぐに作業。胚のポジションを監視し、アガロースが硬化するまで、必要に応じて再調整する実体顕微鏡を使用してください。 </li><li>胚の所望の数がマウントされるまで繰り返します2.1から2.4を繰り返します。 注：典型的な実験において、4つ、または5つの胚をそれぞれ含む4アガロース滴をカバーガラス上に容易に収まる。約16の胚を単理想的実験（ 図2C）中に撮像することができる。 </li><li>アガロースが固化した場合には、1X Danieauの胚培地とガラスボトムディッシュを埋める。 </li></ol> 3. PhotoconvertingとPhotoconverted信号の減少を測定する 25Xまたは40X水客観Iゼブラフィッシュ胚の大きさ及び屈折率の適切な秒。水は5時間の実験中に蒸発するので、それは、水ではなく、実際の水と同じ屈折率液浸油を使用するのが最適です。イマージョンオイルを水（しない油）目的で使用するように設計されていることを確認。 <ol><li>対物レンズとカバーガラスとの間に油膜がイメージング中に異なる胚の位置にステージを移動するように破壊しないことを確実にする目的に液浸油の大滴を置く。ステージが移動したときの皿がずれないように、確実に、ステージ上にガラスボトムディッシュを置く。可能な場合は、28℃、ゼブラフィッシュの開発に最適な温度で加熱されたステージを使用しています。 </li><li>共焦点顕微鏡のソフトウェアパッケージ内の各胚の位置を定義します。各胚のためのZ深度を調整し、各胚にほぼ同じ平面をターゲットにしようとします。 注：約30μm動物極からは、外出先でこの深さで、胚の被覆層を回避することができるので、外径の深さは、撮像領域が最大化され、光の散乱は最小である。 〜3.3ミクロンの厚さの単一の光スライスは十分なデータを提供します。 zスタック（セクション5を参照）を取得する必要はない。 </li><li>実験中に2つの信号を収集する：Alexa488標識デキストラン共役がphotoconvertedされた後の融合タンパク質からの細胞外および細胞内の蛍光及び「赤」信号を分離するために、データ解析中に使用されるから「グリーン」信号を出力する。 <ol><li> 488nmレーザーを使用してAlexa488エキサイト、および〜500と540nmの間で放出される蛍光を収集します。注：光変換した後、多くの緑色〜赤色photoconvertibleタンパク質（ 例えば 、Dendra2）は、543 nmのレーザーで励起すると、〜550〜650nmの蛍光を発することができる。使用photoconvertibleタンパク質に基づいて、必要に応じて調整します。 </li></ol></li><li>取得する「事前光変換「イメージ、および（5節を参照してください5時間の時間のコースに適した撮像条件と（ステップ3.2から）以前に定義された位置の各々ごとに10または20分間の映像に共焦点顕微鏡のソフトウェアを設定し、 考察）。 </li><li> 、融合タンパク質をphotoconvert 10X対物レンズに切り替えて、2分間100％出力で〜300-400 nmの励起フィルターとの水銀アークランプからのUV光に胚のグループを露出させる。 （セクション5を参照）均一の光変換を促進するためのz軸に沿って焦点を移す。液浸油は、光変換時の10倍の目的上に滴り落ちていないことを確認してください。 注：光変換時のフォーカスの移動は実験者の間で変動性を回避するために自動化することができる。 </li><li>すぐに光変換した後25Xや40X客観的に切り替えます。ステップ3.2から以前に定義された位置は正確であることを確認してください。料理はphotoconv中にシフトした場合ERSION、胚の位置を再定義します。 <ol><li>ステップ3.4で作成したプログラムを起動し、イメージングは​​5時間続けることができる。光変換し、各胚のために撮影開始の間の経過時間に注意してください。 </li></ol></li><li>時折実験に確認してください。 Danieauの媒体のレベルを監視し、必要に応じてさら​​に追加する。それが失速している場合は、ソフトウェアを再起動します。 </li><li>指数関数的に減少するモデルの漸近線を推定するデータ解析中に使用されるバックグラウンドの蛍光値を決定するために、実験にAlexa488標識デキストランはなく、mRNAを注入されたいくつかの胚を含む。また、その後のデータ解析中に使用される装置のノイズを決定するために、サンプルの非存在下での画像を取得する。 </li></ol> 4. PyFDAPを使用したデータの分析<ol><li>視覚的に各胚からの時間経過データセットを検査します。虚部中に死亡した胚からのデータセットを破棄photoconverted信号の非常に低いレベルを持っている、またはそれは珍しい見て、移動すると、（負傷または病気の胚の典型的な）で除停止した細胞の領域を含む大幅にシフトしたING、、。 注：時々、液浸油中の気泡またはその他のアーチファクトがそうでなければ、使用可能なデータ·セットに1つまたは2つの画像に表示されます。アーティファクトを含むすべての画像を注意してください。彼らは、後に破棄され、そのようなデータセットからの残りの時点では、まだ分析することができる。 </li><li> FDAPデータを分析するPythonベースのソフトウェアパッケージPyFDAPを使用してください。 PyFDAPは、各画像の平均細胞内および細胞外の赤色蛍光強度を測定し、指数関数的に減少する関数56（ 図3）を使用してデータをフィッティングすることにより半減期を算出する。 <ol><li> PyFDAPをダウンロード（見る マテリアルリスト）。 </li><li>細胞内および細胞外photoconverted信号（ 図3A、B）を分離するPyFDAP使用。私達細胞内のマスクを作成するために、厳密に細胞内でのAlexa488信号を、メール。平均外強度を計算する際に考慮されてからの細胞内のピクセルを防止するために、対応する赤色チャンネル画像にこのマスクを適用します。平均細胞内の強度を測定するために、マスクを反転。 </li><li> PyFDAPでは、ステップ4.2.2で生成されたマスクされた画像を表示する。視覚的にこれらの画像を検査し、マスクが正確に細胞外空間から細胞内（これは稀であるべきで区別しないでデータセットを破棄し、その細胞膜は、細胞外空間がマスクされた画像に含まれることに注意し、それらは、閾値を変化させることによって除去することができアルゴリズムまたはメンブレンマスクを導入することにより（ 例えば 、用いた膜-CFP））。また、ステップ4.1で識別された成果物（ 例えば 、浸漬油中の気泡）を含む任意の単一のイメージを捨てる。 </li><li> EACの平均外および細胞内の蛍光強度を計算するPyFDAPを使用H画像。 PyFDAPが合計の総画素数で除算マスクの外側にある画素の強度を合計することによって、これらの平均値を算出する。 </li><li>以下の指数関数との蛍光データ（ 図3C）を取り付け： <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52266/52266eq1.jpg" width="159" /> tは時間後の光変換であり、C（t）は、tの任意の値での強度であり、c 0はを t = 0での強度であり、kは一定のクリアランス速度であり、y 0は、関数が蛍光として近づく漸近線である減少した（ 図1D）。Y 0は、ステップ3.8 19における測定結果に基づいて制約することができる。 </li><li>以下の関係を用いてクリアランス速度定数（k）をから細胞外および細胞内タンパク質の半減期（τ）を計算するために使用PyFDAP。 <img fo:contENT-幅= &quot;1インチ&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52266 / 52266eq2.jpg&quot;幅= &quot;153&quot; /&gt; </li></ol></li></ol>退色、不注意による光変換、および光変換均一性を評価するために5.制御実験<ol><li>評価退色 注：光退色は、目的のタンパク質のクリアランスに加えて、蛍光タンパク質の漂白特性を反映した蛍光強度のアーティファクトの減少を引き起こす可能性がある。 <ol><li>可能な光退色を評価するために、撮像と撮像の間に20分間隔（ 図4）を有する第二の組の間に10分間隔でFDAPの一組の実験を行う。第4節で説明したようにPyFDAPを用いた実験の両方のセットからのデータを分析します。 </li><li> 10と20分間隔実験から半減期を比較してください。長い半減期20分間隔の実験からは、重要な光退色を示している。両実験からの半減期が同一である場合、photobleachingは重要な問題ではない。 </li><li>あるいは、すぐに光変換した後〜30一連の画像を取得することにより退色評価する。蛍光強度の有意な減少が有意な光退色を示している。 </li><li>退色が検出された場合、より低いレーザーパワーを使用する撮像時間を減少させる、またはそれ以上の光安定photoconvertibleタンパク質32の使用を検討してください。 </li></ol></li><li>不注意な光変換を評価する。 注：Dendra2は488nmの照明27を用いphotoconvertedすることができる。 488nmレーザーで励起のAlexa488、目的のタンパク質の見かけの半減期段階3.3.1、不注意光変換ので、人為的な増加で説明するように、可能な場合である。しかし、我々は、他の33は、488nmの照明は、ゼブラフィッシュ胚における光変換の非効率的な方法であることを見出した。 <ol><li>不注意な光変換を検出するために、ステップ5.1.1で説明した対照実験を使用して。 10と20分間隔実験から半減期を比較してください。 20分間隔の実験から、より短い半減期は大幅な不注意光変換を示している。両方の実験からの半減期が同一である場合には、不注意による光変換は重要な問題ではない。 </li><li>不慮の光変換が検出された場合、誤ってDendra2をphotoconverting避けるために、下部488のレーザパワーより短い撮像時間を使用する。 </li></ol></li><li>光変換均一性を評価する。 注：光変換胚の動物極に向かって付勢されている場合、蛍光の減少は、より深い面（ 図5A）へのタンパク質の拡散または細胞運動によって影響される。 <ol><li>光変換が均一であるかどうかを判断するには、（細胞外融合タンパク質を用いた実験のために）分泌さphotoconvertibleタンパク質または（細胞内の融合タンパク質を用いた実験のために）細胞質photoconvertibleタンパク質を発現する。いつものようにPhotoconvert、T鶏を80分間、20分毎に、胚盤葉のほとんどを包含するzスタックを取得する。 </li><li>光変換は、動物極に向かって付勢されている場合は、より深い面での蛍光強度は、拡散または細胞運動（ 図5B）に経時的に増加します。不均一な光変換が検出された場合、光変換の間、胚に深い焦点を当てる。 </li></ol></li></ol>

著者らは、開示する競合がない。

FDAP実験の成功は、機能的なphotoconvertible融合タンパク質の生成に依存している。タンパク質をタグ付けすると、その局在性、溶解性、および安定性36-41を含む、その生物学的活性および/ ​​または生物物理学的特性に影響を与えることができる。アクティブなものを見つけるために、いくつかの異なる融合構築物の活性を試験するために調製すること。本発明者らは、目的のタンパ?...

細胞および生物中のタンパク質のレベルは、製造及びクリアランス形成速度によって決定される。タンパク質半減期は数分から数日1-4の範囲とすることができる。多くの生物学的システムでは、重要なタンパク質の安定化またはクリアランスは、細胞活性に重要な影響を有している。細胞内のタンパク質の安定性の調節は、細胞周期の進行5,6、発達シグナリング7-9、アポトーシス10、および正常な機能およびニューロン11,12の維持に必要である。細胞外タンパク質の安定性は、組織内のモルフォゲン13,14、などの分泌タンパク質の分布と可用性に影響を与えます。 過去数十年にわたって、タンパク質の安定性は、主に放射パルス標識またはシクロヘキシミドチェイス実験15を使用して、細胞培養において評価されている。このようなパルスチェイス実験において、細胞を一過放射性アミノ酸の「パルス」に露出されている新たに合成されたタンパク質に組み込まれているか、又はそれらは、タンパク質合成を阻害するシクロヘキシミド、にさらされている酸前駆体。培養された細胞は、その後の異なる時点で、そしていずれかの免疫沈降は、（放射パルスチェイス実験において）、続いてオートラジオグラフィーまたはウェスタンブロッティング（シクロヘキシミド実験で）収集され、経時的タンパク質のクリアランスを定量化するために使用される。 従来のタンパク質安定性アッセイは、いくつかの欠点を有する。まず、これらのアッセイにおけるタンパク質は、しばしば、それらの内因性の環境において発現されるのではなく、異なる種由来の細胞組織培養において、時には。その安定性はコンテキスト依存であるタンパク質については、このアプローチには問題がある。第二に、時間をかけて、個々の細胞または生物におけるタンパク質のクリアランスに追従することができず、これらのアッセイからのデータは、異なる時点で細胞の異なる集団の平均を反映している。個々の細胞が開始している可能性があるのでタンパク質の異なる量、異なる時間に放射性標識またはシクロヘキシミドを取り上げてもよいし、異なるクリアランス速度を有していてもよく、そのような集計データは誤解を招く可能性がある。最後に、シクロヘキシミドチェイス実験の場合、タンパク質合成阻害剤の添加は、人為的にタンパク質の安定性16-18を変えることができ、意図しない生理学的効果を有することができる。これらの欠点は、光変換（FDAP）後に蛍光減衰を使用して（FDAP技術の限界のための説明を参照）、生物19-25で動的にタンパク質クリアランスを測定するためにphotoconvertibleタンパク質を利用して技術を避けることができる。 Photoconvertibleタンパク質は、その励起および発光特性は、光26の特定の波長に暴露された後に変更蛍光タンパク質である。 1つの一般的に使用される変形はDendra2、最初にEXを持つ「グリーン·ツー·赤」photoconvertibleタンパク質である緑色蛍光タンパク質と同様の引用及び発光特性が、UV光- 「光変換」 -そのへの曝露後に、励起/発光特性は、赤色蛍光タンパク質23,27と同様になる。重要なことは、光変換後に生成新しいタンパク質はphotoconvertedタンパク質の唯一のプールの光変換時の生産とクリアランスのデカップリングと観察を可能にphotoconvertedタンパク質と同じ励起/発光特性を持っていません。 photoconvertibleタンパク質と目的のタンパク質にタグを付けるため、そのまま、光学的にアクセス可能な生物中のタンパク質ラベルのパルスに便利な方法を提供します。 FDAPアッセイ（ 図1A）において、目的タンパク質はphotoconvertibleタンパク質でタグ付けされ、生体（ 図1B）で表さ。融合タンパク質はphotoconvertedされ、経時photoconvertedシグナルの減少はfluorescenによって監視されているCE顕微鏡（ 図1C）。データは、その後、融合タンパク質（ 図1D）の半減期を決定するために適切なモデルが取り付けられている。 ここで説明FDAPアッセイは、初期胚発生19時のゼブラフィッシュ胚における分泌されたシグナル伝達タンパク質の細胞外半減期を決定するために設計されました。しかし、このアプローチは、ライブイメージングを許容し、かつ任意のタグ付け、細胞内または細胞外タンパク質のクリアランスを監視するために使用することができる任意の透明なモデル生物に適合させることができる。ここに記載の技術の変形は、培養細胞20,23およびショウジョウバエ 22及びマウス21胚で行われている。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit (Life Technologies, AM1340)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To generate capped mRNA for injection into embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa (Life Technologies, D34682)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plastic dish (BD Falcon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>250 mg/l Instant Ocean salt, 1 mg/l methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease from Streptomyces griseus (Sigma, P5147)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Make a 5 mg/ml stock and use at 1 mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 cm diameter glass petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml glass beaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For embryo dechorionation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microinjection apparatus</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For injecting and mounting embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Danieau&#39;s medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO4, 0.3 mM CaCl2, 5 mM HEPES pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure low melting point agarose (Invitrogen, 16520-100)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau&#39;s medium: add 200 mg to 20 ml Danieau&#39;s medium, microwave until dissolved, then aliquot 1 ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 &#176;C, re-melted at 70 &#176;C, and cooled to 40 - 42 &#176;C when ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Pasteur pipette (Kimble Chase (via Fisher), 63A53WT)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal probe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For positioning embryos during mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bottom dishes (MatTek, P35G-1.5-14-C)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tube (BD Falcon) filled with ~5 ml embryo medium&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted laser scanning confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A mercury arc lamp, 488 nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated stage</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>To maintain embryos at the optimal temperature of 28 &#176;C during the experiment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal software capable of time-lapse imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25x or 40x water objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x air objective</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Objective for photoconversion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Immersion oil with the same refractive index as water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (fdap)

タンパク質の安定性は、生物学の多くの側面に影響を与える、タンパク質のクリアランス速度を測定することは、生物学的システムへの重要な洞察を提供することができる。 FDAP実験では、生物内のタンパク質のクリアランスを測定することができる。目的のタンパク質は、photoconvertible蛍光タンパク質でタグ付けされ、インビボで発現され、photoconverted、経時photoconvertedシグナルの減少がモニターされる。データは、その後、タンパク質の半減期を決定するための適切なクリアランスモデルが取り付けられている。重要なのは、生物の異なる区画におけるタンパク質の集団のクリアランス動態コンパートメントマスクを適用することによって、別々に検査することができる。このアプローチは、ゼブラフィッシュの開発中に分泌されたシグナル伝達タンパク質の細胞内および細胞外の半減期を決定するために使用されてきた。ここでは、ゼブラフィッシュ胚におけるFDAP実験のためのプロトコルについて説明します。それのクリアランス速度を決定するFDAPを使用することが可能であるべきであるすべての光学的にアクセス可能な生物内の任意のタグ付けタンパク質。

FDAPはゼブラフィッシュ胚19における細胞外シグナル伝達タンパク質の半減期を決定するために使用されてきた。これらのタンパク質のいずれか、スクイントは、胚形成34中胚葉遺伝子の発現を誘導する。目を細め-Dendra2は定量RT-PCRによっておよびin situハイブリダイゼーションアッセイ19 で示したように 、タグの付いていない目を細め同様のレベル...

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

細胞および組織中のタンパク質レベルは、多くの場合、緊密にタンパク質産生及びクリアランスのバランスによって調節される。光変換した後、蛍光減衰（FDAP）を使用して、タンパク質のクリアランス速度は、実験的にin vivoで測定することができる。

光変換後の蛍光減衰を使用して生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の安定性の測定（FDAP）

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

measuring-protein-stability-living-zebrafish-embryos-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

11.1K ビュー.  Harvard University. 細胞および組織中のタンパク質レベルは、多くの場合、緊密にタンパク質産生及びクリアランスのバランスによって調節される。光変換した後、蛍光減衰（FDAP）を使用して、タンパク質のクリアランス速度は、実験的にin vivoで測定することができる。 

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Mechanical Vessel Injury in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes. External development and optical transparency make these embryos especially amenable to microscopy, and numerous transgenic lines that label specific cell types with fluorescent proteins are available, making the zebrafish embryo an ideal system for visualizing the interaction of vascular, hematopoietic, and other cell types during injury and repair in vivo. Forward and reverse genetics in zebrafish are well developed, and pharmacological manipulation is possible. We describe a mechanical vascular injury model using micromanipulation techniques that exploits several of these features to study responses to vascular injury including hemostasis and blood vessel repair. Using a combination of video and timelapse microscopy, we demonstrate that this method of vascular injury results in measurable and reproducible responses during hemostasis and wound repair. This method provides a system for studying vascular injury and repair in detail in a whole animal model.

This article describes a method for creating a mechanical vessel injury in zebrafish embryos. This injury model provides a platform for studying hemostasis, injury-related inflammation, and wound healing in an organism ideally suited for real-time microscopy.

ゼブラフィッシュ胚における機械的血管損傷

Zebrafish (Danio rerio) embryos have proven to be a powerful model for studying a variety of developmental and disease processes.  External development ...

発生生物学

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

分析<em&gt;インビボ</emゼブラフィッシュ胚における細胞移植とタイムラプスイメージングを使用して&gt;細胞移動

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

生きたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位のバイオセンシング

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. The observation of Tribolium embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has multiple advantages over conventional widefield and confocal fluorescence microscopy. Due to the unique properties of a light sheet-based microscope, three dimensional images of living specimens can be recorded with high signal-to-noise ratios and significantly reduced photo-bleaching as well as photo-toxicity along multiple directions over periods that last several days. With more than four years of methodological development and a continuous increase of data, the time seems appropriate to establish standard operating procedures for the usage of light sheet technology in the Tribolium community as well as in the insect community at large. This protocol describes three mounting techniques suitable for different purposes, presents two novel custom-made transgenic Tribolium lines appropriate for long-term live imaging, suggests five fluorescent dyes to label intracellular structures of fixed embryos and provides information on data post-processing for the timely evaluation of the recorded data. Representative results concentrate on long-term live imaging, optical sectioning and the observation of the same embryo along multiple directions. The respective datasets are provided as a downloadable resource. Finally, the protocol discusses quality controls for live imaging assays, current limitations and the applicability of the outlined procedures to other insect species.
This protocol is primarily intended for developmental biologists who seek imaging solutions that outperform standard laboratory equipment. It promotes the continuous attempt to close the gap between the technically orientated laboratories/communities, which develop and refine microscopy methodologically, and the life science laboratories/communities, which require 'plug-and-play' solutions to technical challenges. Furthermore, it supports an axiomatic approach that moves the biological questions into the center of attention.

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imaging the morphogenesis of insect embryos with light sheet-based fluorescence microscopy has become state of the art. This protocol outlines and compares three mounting techniques appropriate for Tribolium castaneum embryos, introduces two novel custom-made transgenic lines well suited for live imaging, discusses essential quality controls and indicates current experimental limitations.

光シートベースの蛍光生活の顕微鏡または固定し、染色<em&gt;モドキTribolium castaneum</em&gt;胚

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system comprises a chamber featuring a simple setup that is nevertheless robust to induce and maintain a specific oxygen concentration and temperature in any experimental solution of choice. The presented system is very cost-effective but highly functional, it allows induction and sustainment of hypoxia for direct experiments in vivo and for various time periods up to 48 h.
To monitor and study the effects of hypoxia, we have employed two methods - measurement of levels of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1&#945;) in whole embryos or specific tissues and determination of retinal stem cell proliferation by 5-ethynyl-2&#8242;-deoxyuridine (EdU) incorporation into the DNA. HIF-1&#945; levels can serve as a general hypoxia marker in the whole embryo or tissue of choice, here embryonic retina. EdU incorporation into the proliferating cells of embryonic retina is a specific output of hypoxia induction. Thus, we have shown that hypoxic embryonic retinal progenitors decrease proliferation within 1 h of incubation under 5% oxygen of both frog and zebrafish embryos.
Once mastered, our setup can be employed for use with small aquatic model organisms, for direct in vivo experiments, any given time period and under normal, hypoxic or hyperoxic oxygen concentration or under any other given gas mixture.

We introduce a novel hypoxic chamber system for use with aquatic organisms such as frog and zebrafish embryos. Our system is simple, robust, cost-effective and allows the induction and sustainment of hypoxia in vivo and for up to 48 h. We present 2 reproducible methods to monitor the effectiveness of hypoxia.

生きた蛙およびゼブラフィッシュの胚における低酸素の誘導

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the field of developmental biology. The discovery and development of photoconvertible proteins have greatly aided our understanding of these dynamic changes by providing a method to optically highlight cells and tissues. However, while photoconversion, time-lapse microscopy, and subsequent image analysis have proven to be very successful in uncovering cellular dynamics in organs such as the brain or the eye, this approach is generally not used in the developing heart due to challenges posed by the rapid movement of the heart during the cardiac cycle. This protocol consists of two parts. The first part describes a method for photoconverting and subsequently tracking endocardial cells (EdCs) during zebrafish atrioventricular canal (AVC) and atrioventricular heart valve development. The method involves temporally stopping the heart with a drug in order for accurate photoconversion to take place. Hearts are allowed to resume beating upon removal of the drug and embryonic development continues normally until the heart is stopped again for high-resolution imaging of photoconverted EdCs at a later developmental time point. The second part of the protocol describes an image analysis method to quantify the length of a photoconverted or non-photoconverted region in the AVC in young embryos by mapping the fluorescent signal from the three-dimensional structure onto a two-dimensional map. Together, the two parts of the protocol allows one to examine the origin and behavior of cells that make up the zebrafish AVC and atrioventricular heart valve, and can potentially be applied for studying mutants, morphants, or embryos that have been treated with reagents that disrupt AVC and/or valve development.

This protocol describes a method for the photoconversion of Kaede fluorescent protein in endocardial cells of the living zebrafish embryo that enables the tracking of endocardial cells during atrioventricular canal and atrioventricular heart valve development.

ゼブラフィッシュ胚における細胞光電を介して次の心内膜組織運動

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. Although many immunohistochemistry protocols have been optimized for mammalian tissue and tissue sections, these protocols often require modification and optimization for non-mammalian model organisms. Zebrafish are increasingly used as a model system in basic, biomedical, and translational research to investigate the molecular, genetic, and cell biological mechanisms of developmental processes. Zebrafish offer many advantages as a model system but also require modified techniques for optimal protein detection. Here, we provide our protocol for whole-mount fluorescence immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. This protocol additionally describes several different mounting strategies that can be employed and an overview of the advantages and disadvantages each strategy provides. We also describe modifications to this protocol to allow detection of chromogenic substrates in whole mount tissue and fluorescence detection in sectioned larval tissue. This protocol is broadly applicable to the study of many developmental stages and embryonic structures.

Here, we present a protocol for fluorescent antibody-mediated detection of proteins in whole preparations of zebrafish embryos and larvae.

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

Brainbowとタイムラプス共焦点イメージングを用いた生きているゼブラフィッシュの発達脳の可視化

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...