Name: measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (fdap)
Uploaded: 2015-01-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP at JoVE.com

Die Autoren bedanken sich bei Jeffrey Farrell, James Gagnon, und Jennifer Bergmann für Kommentare zum Manuskript danken. KWR wurde von der National Science Foundation Graduate Research Fellowship-Programm bei der Entwicklung des FDAP Test unterstützt. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH, um AFS und durch Zuschüsse von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Emmy Noether-Programm), das Max-Planck-Gesellschaft und des Human Frontier Science Program (Career Development Award) an PM unterstützt.

1. Erstellen eines Photokonvertierbare Fusionskonstrukt und Spritzen dechorionated Zebrafischembryonen <ol><li> Erzeugen Sie eine funktionale Konstruktion des Proteins von Interesse zu einer grünen-to-rot Photokonvertierbare Protein (siehe Diskussion) fusioniert enthält, dann verwenden Sie in vitro-Transkription zur mRNA mit Cap erzeugen das Fusionsprotein kodiert, wie in Müller et al., 2012 19. </li><li> Verwenden Pronase die Chorion von etwa 30 Zebrafischembryonen im Ein-Zell-Stadium zu entfernen. Alternativ manuell dechorionate Embryonen mit einer Pinzette 28. Hinweis: Die Embryonen für spätere Bild dechorionated werden. Falls gewünscht, kann Embryos durch das Chorion später injiziert werden und dechorionated, nur vor der Bilderzeugung. <ol><li> Machen Sie eine 5 mg / ml Stammlösung von Pronase aus Streptomyces griseus in Standard Zebrafischembryo Medium 19. Rock the Lösung vorsichtig bei Raumtemperatur für 10 Minuten, damit der Protease, sich aufzulösen. Aliquot 2 ml in Mikrozentrifugenröhrchen übertragen und bei -20 ° C. </li><li> Transfer eines Zellstadium Embryonen zu einem Durchmesser von 5 cm Glas oder Agarose-beschichteten Kunststoffpetrischale mit ~ 8 ml Embryo Medium. 2 ml aufgetaute Pronase Stammlösung in die Schale und Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 bis 10 min. </li><li> Vermeiden Sie es, Embryonen, um Luft oder Kunststoff, wie Kontakt mit entweder verursacht dechorionated Embryonen zu Bruch. Füllen Sie ein 200 ml Becherglas mit Embryo Medium. Transfer der Embryonen in den Becher durch Kippen der Petrischale beim Eintauchen in das Medium. </li><li> Nachdem die Embryonen mit dem Boden des Becherglases angesiedelt, gießen Sie die meisten der Embryo Medium, dann gießen Sie frisch Embryo Medium in das Becherglas. Das milde Verwirbelung des Mediums Gießen in das Becherglas verursacht Embryonen, ihre geschwächten Chorion zu verlieren. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 1.2.4. </li></ol></li><li> Übertragen Sie die dechorionated Embryonen auf einem Agarose-beschichtetes Spritzgussschale 29 mit einer Glaspasteurpipette mit einer Riegelspitze. Lodernddie Pipettenspitze verhindert gezackten Kanten von Embryonen zu verletzen. </li><li> Co-Injektion der mRNA und eine 3 kDa Alexa488-Dextran-Konjugat 29,30 (1B; siehe Diskussion für vorgeschlagen mRNA und Alexa488-Dextran Mengen). Injizieren direkt in der Mitte der Zelle (nicht das Eigelb) eine gleichmäßige Verteilung von mRNA und Fluoreszenzfarbstoff zu gewährleisten, wenn die Spaltung beginnt. Anmerkung: Die Alexa488 Signal während der Datenanalyse verwendet werden, um Masken Kompartment um zwischen der intrazellulären und extrazellulären Fluoreszenz unterscheiden erzeugen. </li><li> Übertragungs injizierten Embryonen auf ein 1-2% Agarose-beschichtete Vertiefung einer Sechs-Well-Kunststoffschale mit Embryomedium gefüllt. Inkubation im Dunkeln bei 28 ° C bis Embryonen späten Sphäre Stufe 31 (ca. 5 Stunden nach der Befruchtung) erreicht. Überprüfen Embryonen jeglicher in 2 Stunden unter einem Stereomikroskop und entfernen Sie jeglichen Schmutz von Embryonen, die gestorben sind, erzeugt. </li></ol> 2. Montage Zebrafischembryonen für Photoconversion und Imaging auf einem Inverted Konfokalmikroskop <ol><li> Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um 04.59 gesunde Embryonen zu identifizieren und mit einem Glas Pasteurpipette mit einer Riegelspitze, um sie aus der Schale zu entfernen. </li><li> Vorsichtig die Embryonen in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit ~ 1 ml geschmolzen 1% niedrigschmelzender Agarose in 1x Danieau der Embryo Medium auswerfen (siehe Materialliste) (Abbildung 2A). Anmerkung: Agarose sollte eine Temperatur zwischen 40 und 42 ° C haben; höheren Temperaturen könnte die Embryonen schädigen. </li><li> Zeichnen Sie die Embryonen wieder in die Pipette zusammen mit einigen Agarose. Vorsichtig werfen Sie die Agarose und Embryonen auf dem Deckglas eines Glasbodenschale (2B). Sicherzustellen, dass die Dicke des Deckglases mit dem Ziel auf dem Konfokalmikroskop kompatibel ist. <ol><li> Wiederverwenden Glaspipette, falls gewünscht. Um aus der Pipette reinigen Sie die restliche Agarose und Verstopfung, schnell Pipette Embryo Medium nach oben und unten zu verhindern.An der 15-ml-Röhrchen mit ~ 5 ml Embryomedium gefüllt neben dem Stereomikroskop für diesen Zweck. </li></ol></li><li> Verwenden Sie eine Metallsonde, um die Embryonen zu positionieren, so dass das Tier Pol (Blastoderm) dem Deckglas. Arbeiten Sie schnell, da die Agarose wird in 20-30 sec verfestigt. Verwenden Sie das Stereomikroskop der Embryonen Positionen überwachen und anpassen, bis das Agarose erhärtet. </li><li> Die Schritte 2,1-2,4 bis die gewünschte Anzahl von Embryonen montiert wurde. Hinweis: In einem typischen Experiment werden vier Tropfen Agarose mit je vier oder fünf Embryonen einfach auf dem Deckglas passen. Über 16 Embryonen während eines einzigen ideale Experiment (Abbildung 2C) abgebildet werden. </li><li> Beim Erstarren der Agarose, füllen die Glasbodenschale mit 1x Danieau der Embryo Medium. </li></ol> 3. Photoconverting und Messung der Abnahme des photokonvertiertem Signal A 25X oder 40X Wasser Ziel is für die Größe und Brechungsindex von Zebrafischembryonen geeignet. Es ist am besten, um Immersionsöl mit dem gleichen Brechungsindex wie Wasser statt tatsächliche Wasser verwenden, da Wasser wird im Laufe der fünfstündigen Experiments verdampfen. Sicherzustellen, dass das Immersionsöl ist zur Verwendung mit einem Wasser (kein Öl) Ziel verwendet werden. <ol><li> Platzieren Sie einen großen Tropfen Immersionsöl auf das Ziel, sicherzustellen, dass der Ölfilm zwischen Objektiv und Deckglas wird nicht wie die Bühne bewegt, um verschiedene Positionen Embryo während der Bildgebung zu brechen. Sicher stellen Sie den Glasbodenschale auf die Bühne, so dass das Gericht nicht zu verschieben, wenn die Bühne bewegt. Verwenden Sie nach Möglichkeit einen beheizten Phase bei 28 ° C, die optimale Temperatur für die Zebrafisch-Entwicklung. </li><li> Definieren Sie die Position jedes Embryo im Software-Paket des konfokalen Mikroskops. Stellen Sie die Z-Tiefe für jeden Embryo und versuchen, etwa in jedem Embryo Ziel in der gleichen Ebene. Hinweis: Über 30 &amp; mgr; m aus dem Tier Pol ist ein good Tiefe da in dieser Tiefe die Hüllschicht des Embryos vermieden wird Bildgebungsbereich maximiert wird, und die Lichtstreuung ist minimal. Eine einzelne optische Scheibe mit einer Dicke von ~ 3,3 um ausreichend Daten; es gibt keine Notwendigkeit, eine Z-Stapel (siehe Abschnitt 5) zu erwerben. </li><li> Sammeln Sie zwei Signale während des Experiments: die &quot;grüne&quot; Signal von der Alexa488-Dextran-Konjugat-die während der Datenanalyse verwendet werden, um extra- und intrazellulären Fluoreszenz-und die &quot;rote&quot; -Signal aus dem Fusionsprotein zu isolieren, nachdem es photokonvertiertem wird wird. <ol><li> Excite Alexa488 mit einem 488 nm Laser, und sammeln emittierte Fluoreszenz zwischen ca. 500 und 540 nm. Anmerkung: Nach Photo viele grün nach rot Photokonvertierbare Proteine ​​(zB Dendra2) angeregt mit einem 543 nm Laser und Fluoreszenz emittieren zwischen ~ 550 und 650 nm. Passen Sie bei Bedarf auf der Grundlage der Photokonvertierbare Protein verwendet. </li></ol></li><li> Erwerben &quot;pre-Photo&quot;Bilder, und konfigurieren Sie die Software der konfokalen Mikroskop zur Bild jedem der zuvor festgelegten Positionen (aus Schritt 3.2) mit den entsprechenden Abbildungsbedingungen alle 10 oder 20 Minuten für ein Fünf-Stunden-Zeitverlauf (siehe Abschnitt 5 und Diskussion). </li><li> Um das Fusionsprotein photoconvert zu einem 10X-Objektiv ein- und ausgesetzt werden Gruppen von Embryonen mit UV-Licht aus einer Quecksilberbogenlampe mit einer ~ 300-400 nm Anregungsfilter mit 100% Leistung für 2 min. Den Schwerpunkt entlang der z-Achse, um eine einheitliche Photo (siehe Abschnitt 5) zu fördern. Stellen Sie sicher, dass das Immersionsöl nicht auf die 10-fach Objektiv während der Photo tropfen. Anmerkung: Die Verschiebung des Fokus während Photo könnte, um die Variabilität unter den Experimentatoren zu vermeiden automatisierbar. </li><li> Wechseln Sie wieder zu der 25X oder 40X-Objektiv sofort nach Photokonversion. Stellen Sie sicher, dass die zuvor definierten Positionen aus Schritt 3.2 sind noch genau. Wenn das Gericht während photoconv verschobenersion, re-definieren die Positionen der Embryonen. <ol><li> Start des Programms in Schritt 3.4 angelegt und ermöglichen Abbildungs ​​für 5 h fortgesetzt. Die verstrichene Zeit zwischen den Photo und dem Beginn der Bildgebung für jeden Embryo verstrichen. </li></ol></li><li> Überprüfen Sie gelegentlich auf das Experiment. Überwachung des Umfangs Danieau-Medium und fügen Sie mehr, wenn nötig. Starten Sie die Software, wenn sie ins Stocken geraten ist. </li><li> Um die Hintergrund-Fluoreszenz-Werte, die während der Datenanalyse verwendet, um die Asymptote der exponentiell abnehm Modells schätzen wird bestimmen, umfassen einige Embryonen, die mit Alexa488-Dextran nicht jedoch mRNA in dem Experiment injiziert wurden. Zur Ermittlung der Geräterauschen, das auch während der anschließenden Datenanalyse verwendet werden, erfassen eines Bildes in der Abwesenheit einer Probe. </li></ol> 4. Die Analyse der Daten mit Hilfe von PyFDAP <ol><li> Sichtprüfung der zeitliche Verlauf Datensätze von jedem Embryo. Entsorgen Sie Datensätze aus Embryonen, die bei imag gestorbention, die wesentlich verschoben, die sehr geringe Mengen an photokonvertiertem Signals haben, oder dass die Regionen von Zellen, die ungewöhnlich aussehen und stillstehen und Division (typisch verletzter oder kranker Embryonen) enthalten. Hinweis: Gelegentlich, Blasen in der Immersionsöl oder andere Artefakte in ein oder zwei Bilder in einem ansonsten verwendbaren Datensatzes angezeigt. Beachten Sie alle Bilder, die Artefakte enthalten; sie werden später verworfen, und die verbleibenden Zeitpunkten von einer solchen Datensatzes immer noch untersucht werden. </li><li> Verwenden Sie den Python-basierte Softwarepaket PyFDAP die FDAP Daten analysieren. PyFDAP berechnet Halbwertszeit durch die Bestimmung der durchschnittlichen intrazellulären und extra rote Fluoreszenz-Intensität in jedem Bild und Anpassen der Daten mit einer exponentiell abnehmenden Funktion 56 (Abbildung 3). <ol><li> Laden Sie PyFDAP (siehe Materialliste). </li><li> Verwenden PyFDAP zu trennen intra- und extrazellulären photokonvertiertem Signal (3A, B). Unse die Alexa488-Signal, das strikt intrazellulär ist, um eine intrazelluläre Maske erstellen. Wenden Sie diese Maske auf das entsprechende Bild Rot-Kanal, um intrazelluläre Pixel aus, die bei der Berechnung der extrazellulären durchschnittliche Intensität zu verhindern. Um durchschnittliche intrazellulären Intensität zu messen, drehen Sie die Maske. </li><li> In PyFDAP, zeigen die maskierte Bilder in Schritt 4.2.2 erzeugt. Sichtprüfung der Bilder und entsorgen Datensätzen, in denen Masken nicht genau zu unterscheiden intrazellulären von extrazellulären Raum (dies sollte selten sein; beachten Sie, dass die Zellmembranen sind in Bilder, in dem extrazellulären Raum maskiert ist enthalten, aber sie konnten durch die Veränderung der Schwellen entfernt werden Algorithmus oder durch die Einführung einer Membranmaske (beispielsweise unter Verwendung von Membran-GFP)). Verwerfen auch alle Einzelbilder, die Artefakte (zB Blasen im Immersionsöl) in Schritt 4.1 identifiziert. </li><li> Verwenden PyFDAP durchschnittlichen extra- und intrazellulären Fluoreszenzintensitäten für eac berechnenh Bild. PyFDAP berechnet diese Mittelwerte durch Summieren der Intensitäten der Bildpunkte, die außerhalb der Maske und Teilungs fallen durch die Gesamtzahl von Pixeln summiert. </li><li> Montieren Sie die Fluoreszenzdaten (3C) mit folgender Exponentialfunktion: <img fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52266/52266eq1.jpg" width="159" /> wobei t die Zeit nach dem Photo, c (t) die Intensität bei einem bestimmten Wert von t ist, c 0 die Intensität bei t = 0, k die Clearance-Rate konstant ist und y 0 die Asymptote, das die Funktion nähert als Fluoreszenz abnimmt (Figur 1D). y 0 ist, können basierend auf den Messungen in Schritt 3.8 19 eingeschränkt werden. </li><li> Verwenden PyFDAP die extra- und intrazellulären Proteinhalbwertszeiten (τ) von den Freiraum Geschwindigkeitskonstanten (k) unter Verwendung der folgenden Beziehung berechnet: <img fo:content-width = &quot;1in&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 52.266 / 52266eq2.jpg&quot; width = &quot;153&quot; /&gt; </li></ol></li></ol> 5. Kontrolle Experimente zur Photobleaching, versehentliche Photokonversion, und Photo Uniformity Beurteilen <ol><li> Die Beurteilung Bleichen Hinweis: Das Photobleichen könnte artifactual Abnahme der Fluoreszenzintensität, die die Bleicheigenschaften des fluoreszierenden Proteins neben der Clearance des Proteins von Interesse reflektiert verursachen. <ol><li> Um mögliche Photobleaching zu bewerten, führen Sie eine Reihe von FDAP Experimente mit 10-Minuten-Intervallen zwischen Bildgebung und einen zweiten Satz mit 20-Minuten-Intervallen zwischen Bildgebung (Abbildung 4). Analysieren Sie die Daten aus beiden Versuchsreihen mit PyFDAP wie in Abschnitt 4 beschrieben. </li><li> Vergleichen Sie die Halbwertszeiten von den 10 und 20 min Intervall Experimente. Längere Halbwertszeiten von 20 Minuten Intervall Versuche lassen eine erhebliche Bleichen. Wenn die Halbwertszeiten von beiden Versuchen identisch sind, Photobleaching ist kein signifikantes Problem. </li><li> Alternativ zu bewerten Bleichen durch den Erwerb einer Reihe von ~ 30 Bilder sofort nach Photokonversion. Eine signifikante Abnahme der Fluoreszenzintensität zeigt signifikante Photobleichen. </li><li> Wenn Ausbleichen erkannt wird, verwenden Sie eine niedrigere Laserleistung, Belichtungszeit zu verringern, oder verwenden Sie eine photo Photokonvertierbare Protein 32. </li></ol></li><li> Die Beurteilung unbeabsichtigte Photokonversion. Hinweis: Dendra2 kann mit 488 nm Beleuchtung 27 photokonvertiertem werden. Bei Anregung Alexa488 mit 488-nm-Laser, wie in Schritt 3.3.1 unbeabsichtigte Photo und damit einer artifactual Zunahme der scheinbaren Halbwertszeit des Proteins von Interesse beschrieben möglich. Allerdings haben wir und andere 33 festgestellt, dass 488 nm Beleuchtung ist eine ineffiziente Methode der Photokonversion in Zebrafischembryonen. <ol><li> Verwenden Sie die in Schritt 5.1.1 Kontrollexperiment, um eine versehentliche Photo erkennen. Vergleichen Sie die Halbwertszeiten von den 10 und 20 min Intervall Experimente. Kürzere Halbwertszeiten von 20 Minuten Intervall Experimente zeigen wesentliche unbeabsichtigte Photokonversion. Wenn die Halbwertszeiten von beiden Experimenten identisch sind, ist eine versehentliche Photo relativ wirkungslos. </li><li> Falls versehentlichen Photo erkannt wird, verwenden Sie eine niedrigere 488 nm Laserleistung und kürzere Aufnahmezeiten zu vermeiden, versehentlich photoconverting Dendra2. </li></ol></li><li> Die Beurteilung Photo Uniformität. Hinweis: Wenn Photo zu der animalen Pol des Embryos vorgespannt ist, wird die Abnahme der Fluoreszenz, die durch Proteindiffusion oder Zellbewegung in tiefere Ebenen (5A) beeinflusst werden. <ol><li> Um festzustellen, ob Photo gleichmäßig ist, drücken eine abgesondert Photokonvertierbare Protein (für Experimente mit extrazellulären Fusionsproteine) oder eine cytoplasmatische Photokonvertierbare Protein (für Experimente mit intrazellulären Fusionsproteine). Photoconvert wie üblich, tHenne erwerben ein Z-Stapel umfasst die meisten der Blastoderm alle 20 min für 80 min. </li><li> Wenn Photo zu der animalen Pol vorgespannt ist, wird die Fluoreszenzintensität in den tieferen Ebenen der Zeit aufgrund von Diffusion oder Bewegung der Zellen (5B) zu erhöhen. Wenn ungleichmäßige Photo erkannt wird, konzentrieren sich tiefer in die Embryonen während der Photokonversion. </li></ol></li></ol>

Die Autoren haben keine Konflikte offen zu legen.

Der Erfolg einer FDAP Experiments beruht auf der Erzeugung eines funktionellen Photokonvertierbare Fusionsprotein. Markierung eines Proteins kann seine biologische Aktivität und / oder biophysikalischen Eigenschaften, einschließlich der Lokalisierung, Löslichkeit und Stabilität 36-41 betreffen. Werden hergestellt, um die Aktivität von mehreren verschiedenen Fusionskonstrukte zu testen, um eine, die aktiv ist, zu finden. Wir haben festgestellt, dass eine Änderung der Position des Photokonvertierbare Prot...

Die Niveaus von Proteinen in Zellen und Organismen werden durch ihre Produktionsraten und Clearance bestimmt. Proteinhalbwertszeiten kann von Minuten bis Tagen 1-4 liegen. In vielen biologischen Systemen, die Stabilisierung oder Verrechnung von Schlüsselproteinen hat wichtige Auswirkungen auf die Zellaktivität. Modulation der intrazellulären Proteinstabilität ist für die Zellzyklusprogression 5,6, entwicklungsSignalisierungs 7-9, Apoptose 10, und die normale Funktion und Wartung der Neuronen 11,12 erforderlich. Extrazelluläre Proteinstabilität beeinflusst die Verteilung und Verfügbarkeit von sezernierten Proteinen, wie Morphogene 13,14, innerhalb eines Gewebes. Im Laufe der letzten Jahrzehnte, die Proteinstabilität wurde vor allem in der Zellkultur mit radioaktivem Pulsmarkierung oder Cycloheximid Chase-Experimente 15 bewertet. In solchen Pulse-Chase-Experimente werden die Zellen entweder transient zu einem &quot;Impuls&quot; von radioaktiven Aminosäure ausgesetztSäurevorläufer, die in den neu synthetisierten Proteine ​​eingebaut werden, oder sie können gegen Cycloheximid, das die Proteinsynthese hemmt, ausgesetzt sind. Die kultivierten Zellen werden dann zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt und entweder Immunfällung, gefolgt von Autoradiographie (radioaktive Pulse-Chase-Experimente) oder Western Blot (in Cycloheximid Versuchen) wird verwendet, um die Clearance des Proteins über die Zeit quantifiziert. Herkömmliche Proteinstabilität Tests haben mehrere Nachteile. Zuerst Proteine ​​in diesen Assays werden häufig nicht in ihrer endogenen Umgebungen exprimiert, sondern in der Gewebekultur und manchmal in Zellen aus unterschiedlichen Spezies. Für Proteine, deren Stabilität ist kontextabhängig, ist dieser Ansatz problematisch. Zweitens ist es nicht möglich, Proteinclearance in einzelnen Zellen oder Organismen mit der Zeit zu folgen, und die Daten aus diesen Tests reflektiert ein Durchschnitt der verschiedenen Populationen von Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten. Da einzelne Zellen begonnen habenmit unterschiedlichen Mengen an Eiweiß, kann die radioaktive Markierung oder Cycloheximid zu unterschiedlichen Zeiten aufgenommen wurden, oder können unterschiedliche Clearance-Kinetik, wie aggregierte Daten irreführend sein können. Schließlich wird in dem Fall von Cycloheximid Chase-Experimente, Zugabe der Proteinsynthese-Inhibitor kann unbeabsichtigte physiologischen Wirkungen, die Proteinstabilität 16-18 künstlich verändern könnten. Diese Mängel können mit Fluoreszenz Decay Nach Photokonversion (FDAP), eine Technik, die Photokonvertierbare Proteine ​​zu Protein-Clearance dynamisch in lebenden Organismen 19-25 messen nutzt vermieden werden (siehe Diskussion für Beschränkungen des FDAP Technik). Photokonvertierbare Proteine ​​fluoreszierende Proteine, deren Anregungs- und Emissionseigenschaften zu ändern nach der Exposition auf bestimmte Wellenlängen des Lichts 26. Eine häufig verwendete Variante ist Dendra2, eine &quot;grüne-to-rot&quot; Photokonvertierbare Protein, das anfangs abZitat und Emissionseigenschaften ähnlich wie das grün fluoreszierende Proteine, aber nach der Einwirkung von UV-Licht- &quot;Photo&quot; -seine Anregungs- / Emissionseigenschaften werden ähnlich denen der rote fluoreszierende Proteine ​​23,27. Wichtig ist, dass neue Protein nach Photo erzeugt nicht denselben Anregungs- / Emissionseigenschaften wie die photokonvertiertem Proteins ermöglicht Entkoppelung der Produktion und Clearance auf Photo und Beobachtung von nur einem Pool von photokonvertiertem Protein. Kennzeichnen von interessierenden Proteine ​​mit Photokonvertierbare Proteine ​​stellt somit eine bequeme Möglichkeit, impuls Label Proteinen in intakten, optisch zugänglichen lebenden Organismen. In FDAP Assays (Abbildung 1A) ist ein Protein von Interesse mit einem Photokonvertierbare Protein markiert und ausgedrückt in einem lebenden Organismus (1B). Das Fusionsprotein wird durch Photo, und die Abnahme der photokonvertiertem Signals über die Zeit ist durch fluorescen wachtence-Mikroskopie (Abbildung 1C). Die Daten werden dann mit einem geeigneten Modell angebracht, um die Halbwertszeit des Fusionsproteins (1D) zu bestimmen. Die hier beschriebene FDAP Assay wurde entwickelt, um die extrazelluläre Halbwertszeiten von sekretierten Signalproteinen in Zebrafischembryos der frühen Embryogenese 19 bestimmen. Allerdings kann dieser Ansatz für jeden transparent Modellorganismus, die Live-Bildgebung toleriert, und könnte verwendet werden, um den Abstand von jedem taggable intrazelluläre oder extrazelluläre Protein zu überwachen angepasst werden. Variationen der hier beschriebenen Technik wurden in kultivierten Zellen 20,23 und Drosophila 22 und der Maus 21 Embryos durchgeführt.

<table><tbody><tr><td>PyFDAP (download from the following website: http://people.tuebingen.mpg.de/mueller-lab)</td><td></td><td></td><td>Install and operate using the instructions provided on the PyFDAP website; PyFDAP is compatible with Linux, Mac, and Windows operating systems.</td></tr><tr><td>mMessage mMachine Sp6 Transcription Kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td>To generate capped mRNA for injection into embryos</td></tr><tr><td>Alexa488-dextran conjugate, 3 kDa</td><td>Life Technologies</td><td>D34682</td><td>Co-inject with mRNA to create intracellular and extracellular masks</td></tr><tr><td>6-well plastic dish</td><td>BD Falcon</td><td></td><td>Incubate embryos in agarose-coated wells until ready for mounting</td></tr><tr><td>Embryo medium</td><td></td><td></td><td>250 mg/L Instant Ocean salt, 1&amp;nbsp;mg/L methylene blue in reverse osmosis water adjusted to pH 7 with NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Protease from &lt;em&gt;Streptomyces griseus&lt;/em&gt;</td><td>Sigma</td><td>P5147</td><td>Make a 5 mg/ml stock and use at 1&amp;nbsp;mg/ml to dechorionate embryos at the one-cell stage</td></tr><tr><td>5 cm diameter glass Petri dish</td><td></td><td></td><td>For embryo dechorionation</td></tr><tr><td>200 ml glass beaker</td><td></td><td></td><td>For embryo dechorionation</td></tr><tr><td>Microinjection apparatus</td><td></td><td></td><td>For injection of mRNA and dye into embryos at the one-cell stage</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td></td><td></td><td>For injecting and mounting embryos</td></tr><tr><td>1x Danieau&#039;s medium</td><td></td><td></td><td>Dilute low melting point agarose and perform imaging in this medium; recipe: 0.2 mm filtered solution of 58 mM NaCl, 0.7 mM KCl, 0.4 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.3 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5&amp;nbsp;mM HEPES pH 7.2</td></tr><tr><td>UltraPure low melting point agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16520-100</td><td>For mounting embryos; use at a concentration of 1% in Danieau&#039;s medium: add 200 mg to 20 ml Danieau&#039;s medium, microwave until dissolved, then aliquot 1&amp;nbsp;ml into microcentrifuge tubes; aliquots can be stored at 4 &amp;deg;C, re-melted at 70&amp;nbsp;&amp;deg;C, and cooled to 40&amp;#8211;42 &amp;deg;C when ready to use</td></tr><tr><td>Glass Pasteur pipette</td><td>Kimble Chase (via Fisher)</td><td>63A53WT</td><td>For mounting embryos; flame the tip to prevent jagged edges from injuring embryos</td></tr><tr><td>Metal probe</td><td></td><td></td><td>For positioning embryos during mounting</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Use the appropriate cover glass thickness for your objective; part number listed here is for cover glass No. 1.5</td></tr><tr><td>15 ml tube filled with ~5 ml embryo medium</td><td>BD Falcon</td><td></td><td>For rinsing residual agarose from the Pasteur pipette</td></tr><tr><td>Inverted laser scanning confocal microscope</td><td></td><td></td><td>A mercury arc lamp, 488&amp;nbsp;nm laser, 543 nm laser, and the appropriate filter sets are required</td></tr><tr><td>Heated stage</td><td></td><td></td><td>To maintain embryos at the optimal temperature of 28 &amp;deg;C during the experiment</td></tr><tr><td>Confocal software capable of time-lapse imaging</td><td></td><td></td><td>Must be able to define multiple positions and automatically image them at defined intervals&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>25X or 40X water objective</td><td></td><td></td><td>Objective for imaging</td></tr><tr><td>10X air objective</td><td></td><td></td><td>Objective for photoconversion</td></tr><tr><td>Immersion oil</td><td></td><td></td><td>Immersion oil with the same refractive index as water</td></tr></tbody></table>

measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (fdap)

Proteinstabilität beeinflusst viele Aspekte der Biologie und der Messung der Abstand Kinetik der Proteine ​​können wichtige Einblicke in biologische Systeme. In FDAP Experimenten kann die Clearance von Proteinen in lebenden Organismen zu messen. Ein Protein von Interesse wird mit einem Photokonvertierbare fluoreszierendes Protein markiert ist, ausgedrückt in vivo und Photokonversion und die Abnahme der photokonvertiertem Signals über die Zeit überwacht wird. Die Daten werden dann mit einem geeigneten Spaltmodell, um die Proteinhalbwertszeit zu bestimmen, ausgestattet. Wichtig ist, dass die Clearance-Kinetik der Proteinpopulationen in verschiedenen Kompartimenten des Organismus getrennt durch Anlegen compartmental Masken untersucht werden. Dieser Ansatz wurde verwendet, um die intra- und extrazelluläre Halbwertszeiten von sekretierten Signalproteinen während Zebrabärblingentwicklung bestimmen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für FDAP Experimente im Zebrafischembryonen. Es sollte möglich sein, FDAP verwenden, um den Abstand Kinetik bestimmenjede taggable Protein in jedem optisch zugänglich Organismus.

FDAP verwendet worden, um die Halbwertszeiten von extrazellulärer Signalproteine ​​in Zebrafischembryos 19 bestimmen. Eines dieser Proteine, Schielen, induziert die Expression von Genen während der Embryogenese mesendodermal 34. Schielen-Dendra2 aktiviert die Expression von Genen mesendodermal auf einem ähnlichen Niveau untagged Schielen, wie qRT-PCR und in situ-Hybridisierungsassays 19 demonstriert. Die Embryonen wurden mit Alexa488-Dextran und mRNA Schiel Dendra2 und au...

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Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Protein-Spiegel in Zellen und Geweben werden oft dicht durch das Gleichgewicht der Proteinproduktion und Freigabe geregelt. Verwendung Fluoreszenzabklingzeit Nach Photokonversion (FDAP) können die Clearance-Kinetik von Proteinen experimentell in vivo gemessen werden.

Mess Protein Stabilität in Wohnzebrafischembryonen unter Einsatz von Fluoreszenz Decay Nach Photokonversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

measuring-protein-stability-living-zebrafish-embryos-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

11.2K Aufrufe.  Harvard University.  Protein-Spiegel in Zellen und Geweben werden oft dicht durch das Gleichgewicht der Proteinproduktion und Freigabe geregelt. Verwendung Fluoreszenzabklingzeit Nach Photokonversion (FDAP) können die Clearance-Kinetik von Proteinen experimentell in vivo gemessen werden. 

Serie: Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Tracking-Zellen in GFP-transgenen Zebrafisch Mit dem Photokonvertierbare PSmOrange-System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Observing Mitotic Division and Dynamics in a Live Zebrafish Embryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin condensation, microtubule-kinetochore attachment, chromosome segregation, and cytokinesis in a small time frame. Errors in the delicate process can result in human disease, including birth defects and cancer. Traditional approaches investigating human mitotic disease states often rely on cell culture systems, which lack the natural physiology and developmental/tissue-specific context advantageous when studying human disease. This protocol overcomes many obstacles by providing a way to visualize, with high resolution, chromosome dynamics in a vertebrate system, the zebrafish. This protocol will detail an approach that can be used to obtain dynamic images of dividing cells, which include: in vitro transcription, zebrafish breeding/collecting, embryo embedding, and time-lapse imaging. Optimization and modifications of this protocol are also explored. Using H2A.F/Z-EGFP (labels chromatin) and mCherry-CAAX (labels cell membrane) mRNA-injected embryos, mitosis in AB wild-type, auroraBhi1045, and esco2hi2865 mutant zebrafish is visualized. High resolution live imaging in zebrafish allows one to observe multiple mitoses to statistically quantify mitotic defects and timing of mitotic progression. In addition, observation of qualitative aspects that define improper mitotic processes (i.e., congression defects, missegregation of chromosomes, etc.) and improper chromosomal outcomes (i.e., aneuploidy, polyploidy, micronuclei, etc.) are observed. This assay can be applied to the observation of tissue differentiation/development and is amenable to the use of mutant zebrafish and pharmacological agents. Visualization of how defects in mitosis lead to cancer and developmental disorders will greatly enhance understanding of the pathogenesis of disease.

Mitosis is critical to every living organism and defects often lead to cancer and developmental disorders. Using this imaging protocol and zebrafish as a model system, researchers can visualize mitosis in a live vertebrate organism and the multitude of defects that arise when mitotic processes are defective.

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Mitosis is critical for organismal growth and differentiation. The process is highly dynamic and requires ordered events to accomplish proper chromatin ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

<meta charset="utf8"></head><body>Fluoreszierende Proteinmarkierung in Zebrafischlarven mittels CRISPR/Cas9-Knock-in

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in vivo imaging due to its transparency during the early developmental stage. Here, we provide a detailed protocol for performing high-efficiency fluorescence gene KI, rapid screening for KI founders, and low-abundance protein tracing in zebrafish larvae, which will lay a critical foundation for subsequent physio-pathological studies in zebrafish. The current protocol includes complete steps for the sgRNA design for the gene of interest, sgRNA in vitro transcription, Cas9 mRNA in vitro transcription, in vivo sgRNA screen for the one with the highest efficiency, donor plasmid design and construction, microinjection in zebrafish larvae, KI founder screen and zebrafish live imaging. Critical steps, troubleshooting tips, quality control methods, and advantages and applications of this protocol are included and discussed. This protocol assures quick and accurate results at a low cost and has been validated by multiple trials.

<meta charset="utf8"></head><body>Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

Here, we present a protocol to label proteins with a fluorescence protein tag in zebrafish larvae, a newly developed and modified in vivo system especially useful for visualizing low-abundance proteins in zebrafish.

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

Genetik

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Biologie

A Simple and Effective Transplantation Device for Zebrafish Embryos

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex developmental processes. Zebrafish embryos are ideally suited for these manipulations since they are easily accessible, relatively large in size, and transparent. However, previously developed devices for cell removal and transplantation are cumbersome to use or expensive to purchase. In contrast, the transplantation device presented here is economical, easy to assemble, and simple to use. In this protocol, we first introduce the handling of the transplantation device as well as its assembly from commercially and widely available parts. We then present three applications for its use: generation of ectopic clones to study signal dispersal from localized sources, extirpation of cells to produce size-reduced embryos, and germline transplantation to generate maternal-zygotic mutants. Finally, we show that the tool can also be used for embryological manipulations in other species such as the Japanese rice fish medaka.

Embryological manipulations such as extirpation and transplantation of cells are important tools to study early development. This protocol describes a simple and effective transplantation device to perform these manipulations in zebrafish embryos.

Ein einfaches und effektives Transplantationsgerät für Zebrafischembryonen

Classical embryological manipulations, such as removing cells and transplanting cells within or between embryos, are powerful techniques to study complex ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Single Cell Fate Mapping im Zebrafisch

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

An Efficient Protocol to Assess ERK Activity Modulation in Early Zebrafish Noonan Syndrome Models via Live FRET Microscopy and Immunofluorescence

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. Despite a broad genetic heterogeneity, germline gain-of-function mutations in key regulators of the RAS-MAPK pathway underlie the majority of the cases, and, thanks to advanced sequencing techniques, potentially pathogenic variants affecting the RAS-MAPK pathway continue to be identified. Functional validation of the pathogenicity of these variants, essential for accurate diagnosis, requires fast and reliable protocols, preferably in vivo. Given the scarcity of effective treatments in early childhood, such protocols, especially if scalable in cost-effective animal models, can be instrumental in offering a preclinical ground for drug repositioning/repurposing. 
Here we describe step-by-step the protocol for rapid generation of transient RASopathy models in zebrafish embryos and direct inspection of live disease-associated ERK activity changes occurring already during gastrulation through real-time multispectral F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging. The protocol uses a transgenic ERK reporter recently established and integrated with the hardware of commercial microscopes. We provide an example application for Noonan syndrome (NS) zebrafish models obtained by expression of the Shp2D61G. We describe a straightforward method that enables registration of ERK signal change in the NS fish model before and after pharmacological signal modulation by available low-dose MEK inhibitors. We detail how to generate, retrieve, and assess ratiometric FRET signals from multispectral acquisitions before and after treatment and how to cross-validate the results via classical immunofluorescence on whole embryos at early stages. We then describe how, via examining standard morphometric parameters, to query late changes in embryo shape, indicative of a resulting impairment of gastrulation, in the same embryos whose ERK activity is assessed by live FRET at 6 h post fertilization.

RASopathies are multisystem genetic syndromes caused by RAS-MAPK pathway hyperactivation. Potentially pathogenic variants awaiting validation emerge continuously while poor preclinical evidence limits therapy. Here, we describe our in vivo protocol to test and cross-validate RASopathy-associated ERK activation levels and its pharmacological modulation during embryogenesis by live FRET imaging in Teen-reporter zebrafish.

Ein effizientes Protokoll zur Beurteilung der Modulation der ERK-Aktivität in frühen Modellen des Zebrafisch-Noonan-Syndroms mittels Live-FRET-Mikroskopie und Immunfluoreszenz

RASopathies are genetic syndromes caused by ERK hyperactivation and resulting in multisystemic diseases that can also lead to cancer predisposition. ...

Mess Protein Stabilität in Wohnzebrafischembryonen unter Einsatz von Fluoreszenz Decay Nach Photokonversion (FDAP)

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Tracking-Zellen in GFP-transgenen Zebrafisch Mit dem Photokonvertierbare PSmOrange-System

Beobachten Mitose und Dynamik in einer Live Zebrafischembryo

Einzellige Ladungszustand im lebendigen intakten Zebrafisch

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

Fluoreszenzmarkierung zur Visualisierung niedrig exprimierter Proteine im Zebrafisch

Zwei-Photonen-Based Photoaktivierung in Live Zebrafischembryonen

Ein einfaches und effektives Transplantationsgerät für Zebrafischembryonen

Single Cell Fate Mapping im Zebrafisch

Ein effizientes Protokoll zur Beurteilung der Modulation der ERK-Aktivität in frühen Modellen des Zebrafisch-Noonan-Syndroms mittels Live-FRET-Mikroskopie und Immunfluoreszenz