This work was supported by the United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C and the United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.

健康な個体からの匿名化血液サンプルは、コロラド大学病院（オーロラ、コロラド州）からのものでした。検証研究のためだけでなく、キャリブレータおよび品質管理サンプルの調製のための非識別血液バンクサンプルの使用は、コロラド多施設内倫理委員会（COMIRB、オーロラ、コロラド州）によって「免除」と考えられました。 参照とソリューションの作製<ol><li>タクロリムスと内部標準のD 2を購入し、材料リストに記載されているベンダから13 C-タクロリムス。 <ol><li>タクロリムス1 mg / mlの濃度とD 2のために10μg/ mlの、13 C-タクロリムスの濃度で純粋なメタノール中のストック溶液を準備します。三つの独立した重みに基づいて、標準物質のストック溶液を作ります。小分けストック溶液とストア-70℃以下です。 </li></ol></li><li>タンパク質を沈殿させるために溶液を調製します（：、3 V：7 v）を、水にメタノール/ 0.2 MのZnSO 4を使用して、タクロリムスを抽出します。この溶液は、内部標準D 2、2.5 ngの/ mlの濃度の13 C-タクロリムスを含有し、ブランク試料の抽出を除くすべてのサンプル（1.3.3を参照）の抽出のために使用されます。 <ol><li>各抽出日に新鮮にこのタンパク質沈殿溶液を調製し、12時間で溶液の有効期限を設定します。 </li></ol></li><li>検量線および品質管理（QC）サンプルの作製<ol><li>純メタノールを使用したスト​​ック溶液の適切な希釈を行うことにより、タクロリムスのス​​トック溶液を調製します。 </li><li> 、キャリブレータおよび品質管理サンプルの調製EDTA全血の中に適切に希釈されたストック溶液20μlをスパイクするために、20分およびアリコートのための細胞の血液成分へのタクロリムスの均一な分布を可能にするために、水浴中で穏やかに振盪下、37℃でインキュベート1.5ミリリットルポリープへ円錐形の底部を有するr​​opyleneチューブとスナップオンふた。有機溶剤の相対量が5％を超えないことを確認してください。 </li><li>スポットピペットを使用してフィルタカード上の各円の中央にスパイクの全血50μlの。 </li><li> 3時間室温でのフィルタカードの血液スポットを乾燥させます。 </li><li> 1、2.5、5、10、25、および50 ngの/ mlのタクロリムスの濃度で人間のEDTA全血中タクロリムス校正標準を準備します。内部標準D 2、13 C-タクロリムス（「ゼロサンプル」）を含むタンパク質沈殿溶液と較正基準のような抽出のためのブランク試料を準備します。 </li><li> 0、2、4、20、40 ngの/ mlの濃度のヒトEDTA全血にQCサンプルを準備します。ブランク試料を準備します。内部標準D 2を含む沈殿を用いて抽出されたQCサンプルとは対照的に、13 C-タクロリムス、ないタンパク質沈殿溶液とこのブランクサンプルを抽出します内部標準D 2、13 C-タクロリムス（「ブランク試料」）を含みません。 </li></ol></li><li>臨床サンプルの採取<ol><li> 43,44で説明したように乾燥した血液スポットを収集します。 </li></ol></li></ol> 2.タクロリムスの抽出乾燥血液スポットサンプル<ol><li>視覚的に許容可能なサンプルの品質とボリューム45を確実にするために、乾燥血液スポットを検査します。 </li><li> 6 mmの穴パンチとフィルタカード上の血液スポットのパンチ中心。 注：パンチの品質を秤量することによってモニターすることができます。パンチ飽和フィルターディスクは、0.09ミリグラム（：4.83- 5.14 mgであり、N = 12の範囲）±平均5.02ミリグラムで重量を量ります。 </li><li>円錐形の底部及びスナップオン蓋付き1.5ミリリットルポリプロピレンチューブに置きディスク。 </li><li>各チューブに20〜30箇条書きを追加します。 </li><li>各チューブにタンパク質沈殿溶液（2.5 ngの/ mlの内部標準とV：0.2 MのZnSO 4、7：3、Vメタノール）の500μlのを追加します。 EXTRについてブランクサンプルの動作は、内部標準なしでタンパク質沈殿溶液を使用しています。 </li><li> （「10」を設定し、最高速度）1分間の弾丸ブレンダーでディスクを均質化します。 </li><li> 10分間（「10」を設定し、最高速度）マルチチューブボルテックスに室温でサンプルを振ります。 </li><li> 10分間16,000×gで4℃で遠心分離サンプル。 </li><li> 300μlのインサートを備えたガラス製HPLCバイアルに上清を移します。前スリットテフロンシールを使用してください。 注：抽出したサンプルは、-20℃以下でLC-MS / MS分析まで保存することができます。 </li></ol> 3. LC-MS / MS分析<ol><li> C8カートリッジ抽出カラム上に負荷抽出されたサンプルの上清100μlを、図7を用いて洗浄する：水中の0.1％ギ酸の比率3：1分間5 ml /分の流量でアセトニトリル。切替弁の接続は、 図2に示されており、勾配は、 表1の抽出ポンプによって実行されます</st&gt;栄。 </li><li>以下、分析カラム上に、プレカラムからの検体のバックフラッシュの結果、切替弁を作動させます。 </li><li> 65°Cまでのカラムサーモスタットを設定します。 </li><li> 表1に示す流量と勾配を用いて分析カラムから分析物を溶出します。 </li><li>ターボエレクトロスプレーイオン化源を介してタンデム質量分析計に分析カラムを接続します。 表2に記載の質量分析装置の主要なパラメータを調整します。 </li><li>複数の反応モード（MRM）中の正イオン（[M +のNa] +）を検出します 。定量化のために、次のイオンの移行を使用して：タ ​​クロリムス：m / z（質量/電荷）= 616.2→826.6とD 2、13 C-タクロリムスた：m / z = 829.6→619.2。 注：総実行時間は4.6分です。 </li></ol> 4.定量<ol><li>各実験について、1.3.5で製造したキャリブレーターに基づいて検量線を作成し、各分析の実行に含めます。 <ol><li>質量分析計ソフトウェアを使用して、分析物（ピーク面積[検体] /ピーク面積[内部標準]）の応答係数対名目濃度をプロットすることにより検量線を作成します。 </li><li> 1 / Xの重み付けと組み合わせて二次フィットを用いてキャリブレータを取り付けます。 </li></ol></li><li>乾燥血液スポットにおける量タクロリムスタクロリムス抽出のMRMクロマトグラムにおける内部標準のピークを統合することができます。タクロリムスの応答係数（ピーク面積[検体] /ピーク面積[内部標準]）を計算し、質量分析ソフトウェアを使用して検量線と比較します。 </li></ol> 5.検証手続<ol><li>検出（LLOD）及び定量化（LLOQ）の下限値の下限。 <ol><li>検出（LLOD）の下限として1：4のピーク対雑音比で最低のタクロリムス濃度を考えてみましょう。定量化（LLOQ）の下限を定義します。等しいか、または名目濃度に等しいか、またはより良好な20％の精度（変動係数）から±20％の偏差よりも良好な精度で較正曲線の最低濃度です。 </li></ol></li><li>内および間日間の精度と精度。 <ol><li> 2 ng / mlで（QC1）、4 ng / mlで（QC2）、20 ng / mlで（QC3）および40 ng / mlで（QC4）の4濃度レベルで正確さと精度をテストします。 </li><li>フィルタカード、エキスの乾燥、人間のEDTA全血に各バリデーション日にQCサンプルを用意し、上記のように分析します。 </li><li> QC濃度レベルごとに6つのサンプルでイントラデイの正確さと精度を決定します。 </li><li> 20日間の間日間の正確さと精度を評価します。 4サンプルを毎日各QCレベルを測定します。 </li><li>毎日のQCサンプルと一緒に2つの較正曲線を分析します。 </li><li>名目上の濃度の％（濃度レベルごとに6つのサンプルは、5.2.2を参照してください）​​などのイントラデイ精度を計算します。 Calcの分散係数（CV％）としてulate精度。 </li><li>それは名目濃度の115％に許容限界に85％を下回る場合には許容可能なイントラデイ精度を考えてみましょう。それは15％のCV（変動係数）と同等かそれ以上の場合、許容できるならばイントラデイの精度を考慮してください。 </li><li> 20検証日間にわたって分析各QC濃度レベルの平均としてインター日間の正確さと精度を計算します。 </li><li>それは名目濃度の115％に許容限界に85％低下した場合に許容できるインター日間の精度を意味することを検討してください。それは15％のCV（変動係数）と同等かそれ以上の場合、許容できる場合インター日間の精度を考慮してください。 </li></ol></li><li>マトリックス干渉の排除。 <ol><li>マトリクス信号によって引き起こされることがある干渉を排除するために、空白の乾燥血液スポット（8異なる個体、好ましくは4人の男性と4人の女性）を分析。 </li><li>視覚イオンクロマトグラムを検査します。もし保持時間内にピークタクロリムスのウィンドウがLLOQでタクロリムスでスパイク統合し、ブランク試料におけるタクロリムスピークのものと曲線下その面積を比較し、検出されました。ブランク試料中のピークの面積は、LLOQでタクロリムスのものの15％を超えることが想定されていません。 </li></ol></li><li>イオン抑制/イオン強化。 <ol><li>共溶出マトリクス成 ​​分によるイオン抑制/イオン強化の潜在的な干渉を評価するために45を説明するようにポストカラム注入プロトコルを使用してください。 </li><li> 10μL/分の速度でメタノール（30：70、v / v）のポストカラム：0.1％ギ酸に溶解した10μg/ mlの濃度のタクロリムスを注入。 <ol><li>分析カラムと質量分析計のエレクトロスプレー源との間にTピースを経由してシリンジポンプを接続します。 </li><li>タクロリムスのためのMRMトランジションのMS / MSシグナル強度を監視し、その内部標準（のm / z = 616.2とのm / z = 829.6→619.2→826.6）extracの注射後テッドのブランクサンプル（N =異なる個体から8サンプル）。 注意：イオン抑制が信号とイオン増強ピークのディップが発生している間イオン抑制/イオン強化がない場合には検体の注入によって引き起こされる連続信号は、ブランクマトリックスの注入によって影響されるべきではありません。 </li></ol></li></ol></li><li>持ち越す。 <ol><li>最高キャリブレーター後に抽出ブランク試料を分析することにより、潜在的なキャリーオーバーを評価する（50 ngの/ mlの、N = 6）。 </li><li>視覚イオンクロマトグラムを検査します。タクロリムスの保持時間ウィンドウ内のピークが検出された場合、LLOQでタクロリムスをスパイクブランクサンプル中のタクロリムスのピークのものと曲線の下のそれらの領域を統合し、比較します。ブランク試料中のピークの面積は、LLOQでタクロリムスのものの15％を超えることが想定されていません。 </li></ol></li><li>抽出回収。 <ol><li> QC SAMの抽出後の検体の信号を比較することにより、回収を決定しますブランクの乾燥血液スポットのものとすべての4つの濃度レベルでples（N =濃度につき6）は、抽出後のタクロリムスの対応する量でスパイク。 </li><li> 4のQCのセット（：2、4、20、40 ngの/ mlの濃度レベル）を準備します。 </li><li>ろ紙のカードに空白のEDTA全血50μlのをスポッティングし、2時間乾燥させることにより、「回復試験サンプル」に対応する他の4セットを準備します。 </li><li>以下、QCとブランク」回収試験サンプル」の両方のために、はさみでフィルタカードの全体の血液スポットを切り出し、円錐状の底部とのスナップ式の蓋付きポリプロピレンチューブに生じたディスクを配置します。 </li><li>すべてのサンプルを抽出します。 </li><li>ガラスHPLCバイアルに上清（400μl）を転送します。 </li><li> 2、4、20、および40 ng / mlで（200、400、2000、4000 ngの/ mlのタクロリムスストックゾルの4μLの濃度に到達するまでの空白」が抽出回収試験サンプル」にタクロリムス原液を追加上清400μlにutions）。 </li><li> LC-MS / MS分析の後、QC試料及び対応する濃度の「回収試験試料」の両方の信号を比較する（抽出/信号サンプルを抽出X 100の後にスパイクする前に、回復％=信号サンプルをスパイク）。 </li></ol></li><li>希釈の整合性。 <ol><li>サンプルを使用して希釈の整合性を確立ng / mlで500、250および100での検体でスパイク。 </li><li>抽出後、タンパク質沈殿溶液を用いて、サンプル希釈（1:10、n = 3の濃度レベルにつき）。 </li><li>名目濃度からの偏差を計算します。 85％の範囲内の公称許容できるの-115％減の結果を考慮してください。 </li></ol></li><li>安定性。 <ol><li>すべての4つの濃度レベルでQCサンプルを使用して安定性を調査した（n =濃度あたり4）異なる時点で、異なる貯蔵条件下で分析しました。 </li><li>公称値で保存した後の結果を比較してください。 Rを考えてみましょう85％の範囲内の公称許容できるの-115％減esults。 </li><li> 4℃、-20℃で1ヶ月間、-80℃で1ヶ月に1週間、室温で1週間のサンプルの安定性を確立します。 </li><li> 3サイクルにわたってテスト凍結融解安定性（-20℃）。試験は、4℃に調節サーモスタットオートサンプラーにサンプルを配置することによって、サンプル及びオートサンプラー安定性を抽出しました。 72時間後にサンプルを注入します。 </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

上述のように、乾燥血液スポットに基づいて、タクロリムスの治療薬及び遵守監視の概念は魅力的であるが、一般的に静脈EDTA全血サンプル中のタクロリムスのLC-MS / MS分析に関連するものを超えた分析課題があります。これらには、マトリックスは、ここで使用されるフ​​ィルタカード材料と低血液量（20μL）のコットンリンターの材料に浸漬毛細血管全血であるという事実が、これらに限...

タクロリムスは、マクロライド構造8（ 図1）を持つ強力なimmonosuppressant 1-7です。 653グラム/ L、エタノール： - シスのためにCN結合のトランス異性それを逆相高速液体クロマトグラフィーによって分離することができる液9中の2つの回転異性体を形成する（HPLC）は、タクロリムスは、アルコール（メタノール中の親油性と可溶性である355 G / L）、ハロゲン化炭化水素（クロロホルム：573グラム/ L）およびエーテル。 9分子は、任意の発色団を含んでいないし、その紫外線吸収極大が192 nmである0.0047グラム/ L）タクロリムスの行為カルシニューリンの阻害を介して：0.1グラム/ Lおよび水（pHは3：それは（ヘキサン脂肪族炭化水素に難溶性です。 。その作用機序は、参考文献10,11に概説されている。これは、現在、米国において12固形臓器移植患者の80％以上に使用されています。 タクロリムスの治療指数はconsidereですdは13狭くします。また、タクロリムスの投与量と血中濃度との相関が悪く、薬物動態変数14,15あります。移植患者におけるタクロリムスの投与をガイドするための治療薬モニタリングは、したがって、一般的な臨床実践16-20です。目標は、事前定義された治療範囲内タクロリムスの血中濃度を維持することです。治療の窓を超える濃度が過剰免疫抑制、癌や、腎毒性、神経毒性、高血圧、および糖尿病などの毒性のリスクを増加させながら、治療範囲以下のタクロリムスの血中濃度は、慢性または急性同種免疫反応の活性の増加をもたらす可能性があります。タクロリムスの高い薬物動態個体内変動は、移植臓器と患者の生存21,22の両方に有害である可能性があります。タクロリムスの薬物動態の個体間変動は、主にCYP3A5の遺伝子多型、個体内の理由によって引き起こされている間可変性は、薬物-薬物、疾患、薬物および食品薬物相互作用は、14,15、含まれるが、これらに限定されません。また、免疫抑制治療薬レジメンの遵守の欠如が要因と移植片喪失の23,24の主な理由です。 これらの考慮事項は、頻繁に家の治療薬やタクロリムス全血濃度の遵守の監視は、患者が常に所望の治療ウィンドウ内タクロリムスエクスポージャーを持っていることを確認することが有益であり得ることを示唆しています。しかし、それは現在の臨床実践15であるように、より頻繁な治療薬モニタリングの物流コストは法外です。理由の一つは、患者が瀉血専門医が描画に必要な静脈血のサンプルを持って見る必要があることです。乾燥血液スポットは最近、魅力的なコンセプト25-28として浮上しています。簡単な指の後、患者は特別なろ紙カードに血液滴を収集し、血液スポットの後にdを有するスティックリート、患者が現在服用してもよいことタクロリムス及び他の免疫抑制剤の分析のための中央検査室に郵送することができます。これは、そのような乾燥血液スポット（血液の一般的に20μl）を25,29-43のような非常に少量の血液量のタクロリムスおよび他の免疫抑制剤の定 ​​量化のための高感度かつ特異的LC-MS / MSアッセイの開発が可能となっています。別の利点は、乾燥血液スポットとして低侵襲性、低容量のサンプル収集戦略が大きく小さな子供28中の治療薬のモニタリングおよび薬物動態学的研究を促進することです。 タクロリムスは、通常、静脈のEDTA全血15で測定されます。理由は、タクロリムスは、広範囲の血液細胞に分配することと臨床研究は、臨床イベント15,18のプラズマに比べて血液中のタクロリムストラフ濃度との間のより良好な相関関係を報告しているということです。比較では、TAの分析乾燥血液スポットにおけるcrolimusを濾紙マトリックスと混合される毛細管血に基づいています。これは、タクロリムスおよびLC-MS / MS分析での潜在的な干渉の可溶化の点で課題を提示。ここでは、高流量のオンラインコラムサンプルクリーンアップの手順とLC-MS / MS分析と組み合わせて、箇条書きのブレンダーを用いて乾燥血液スポットの均質化に基づいて設立され、確認されたアッセイを提示します。今日のように、このアッセイは成功し、臨床試験における遵守を監視するための以上5000タクロリムス乾燥血液スポットサンプルの定量に使用されています。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reference Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacrolimus</td>
			<td>U.S. Pharmacopeial Convention</td>
			<td>1642802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2,13C-Tacrolimus</td>
			<td>Toronto Research Chemicals Inc.</td>
			<td>F370002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cells</td>
			<td>University of Colorado Hospital</td>
			<td>W20091305500 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma</td>
			<td>University of Colorado Hospital</td>
			<td>W2017130556300Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone CHROMASOLV, HPLC, &#8805; 99,9 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439126-4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/ MS, UHPLC- UV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 99.9 %, HPLC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2632-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol Optima LC/ MS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Optima LC/ MS, UHPLC- UV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A118P-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Z68-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Instruments and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 &#8211; 10 &#181;l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5 mL- Eppendorf tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-550</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#8211; 100 &#181;L pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008651</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT 10XLS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#8211; 1000 &#181;l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008653</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Multimax</td>
			<td>2940</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 &#8211; 20 &#181;L pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL- Eppendorf tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-258</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#8211; 200 &#181;L pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1237-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L- pipet tips with filter</td>
			<td>Multimax</td>
			<td>2938T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Multimax</td>
			<td>2936J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL- Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L inserts for&#160; HPLC vials</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>ARO-9973-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance PR2002</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>1117050723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balances AX205 Delta Range</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>1119343379</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Biofuge Fresco</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>290395</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Wipes</td>
			<td>PDI</td>
			<td>Q55172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass v ials, 4 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-334</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials, 20 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B7800-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves, nitrile</td>
			<td>Titan Brand Gloves</td>
			<td>44-100S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC vials, 9 mm, 2 mL, clear</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>ARO- 9921-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lids for HPLC vials</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>ARO- 8952-13-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 18G 1.5</td>
			<td>Precision Glide</td>
			<td>305196</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for HPLC Vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-541-29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel beads 0.9 &#8211; 2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB14B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage boxes for freezers / refrigerators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-395-464</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard multi-tube vortexer</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>658816-115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK</td>
			<td>GE Whatman&#160;</td>
			<td>2016-05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Equipment and Columns</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler</td>
			<td>CTC PAL&#160;</td>
			<td>PAL.HTCABIx1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binary pump, Agilent 1260 Infinity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 G1312B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binary pump, Agilent 1290 Infinity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1290 G4220A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro vacuum degasser, Agilent 1260</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 G13798</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column oven,&#160; Agilent 1290 with 2 position&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1290 G1216C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1290 G1316C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 &#181;m particle size), 4.6 &#183; 12.5 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>820950-926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 &#181;m particle size), 4.6 &#183; 150 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>993967-906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tandem Mass Spectrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API5000 MS/MS with TurboIonspray source</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>4364257</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometry software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Analyst 1.5.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of the immunosuppressant tacrolimus on dried blood spots using lc-ms/ms

カルシニューリン阻害剤タクロリムスは、米国の固形臓器移植後の免疫抑制ほとんどの治療プロトコルの基礎となるものです。タクロリムスは、狭い治療指数薬であり、そのようなものとして、その全血トラフ濃度に基づく治療薬モニタリングおよび用量調節を必要とします。家庭治療薬と遵守の監視を容易にするために、乾燥した血液スポットのコレクションは魅力的な概念です。フィンガースティックの後、患者は自宅でろ紙上の血液滴を収集します。血液が乾燥した後、それは、タクロリムスは、単純な手動のタンパク質沈殿工程およびオンラインカラム抽出と組み合わせた高速液体クロマトグラフィー - タンデム質量分析（HPLC-MS / MS）を用いて定量された分析研究室に郵送されます。 タクロリムスの分析のために、6 mmのディスクは、血液スポットの飽和中央から打ち抜かれます。血液スポットは、弾丸ブレンダーaを使用して均質化され、ND次いでタンパク質は、内部標準D 2、13 C-タクロリムスを含むメタノール/ 0.2 MのZnSO 4で沈殿させます。ボルテックス及び遠心分離後、上清100μlをオンライン抽出カラムに注入し、5 mlの0.1ギ酸/アセトニトリル/分（7：3、V：V）で洗浄し、1分間。以降、切替弁が活性化され、分析物は、分析カラム上にバックフラッシュ（0.1％ギ酸/アセトニトリル勾配を用いて分離されます）。タクロリムスは、タンデム質量分析計を用いて、正の反応マルチモード（MRM）で定量化されます。 アッセイは、1〜50 ng / mlでの直線です。アッセイ間の変動（3.6％-6.1％）と精度（91.7パーセント-101.6％）20日間にわたって評価として受け入れ基準を満たしています。平均抽出回収は95.5％です。キャリーオーバー、マトリックス干渉とマトリックス効果該当はありません。タクロリムスは、室温で1週間4℃で乾燥した血液スポット中で安定です。で抽出したサンプルオートサンプラーは、少なくとも72時間4℃で安定しています。

サンプルは定量下限と患者試料にスパイクブランク試料の代表的なイオンクロマトグラムは、 図3に示されています。 検量線検出の下限値は、0.5 mlのNG /であり、定量化の下限はng / mlで1.0でした。より高い濃度は、通常の状況下では、診療所に到達されそうにないとして50ngの/ mlの最高キャリブレーターとして選ばれました。 <p class="jo...

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Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

LC-MS / MSを用いて乾燥血液スポット上で免疫抑制タクロリムスの定量化

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

quantification-immunosuppressant-tacrolimus-on-dried-blood-spots

Research

JoVE Journal

Medicine

16.7K ビュー.  University of Colorado, Anschutz Medical Campus. Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

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A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of spinal cord injury (SCI) in which the thoracic spinal cord is injured. Additionally, because most human cord injuries occur as the result of blunt, non-penetrating trauma (e.g. motor vehicle accident, sporting injury) where the spinal cord is violently struck by displaced bone or soft tissues, the majority of SCI researchers are of the opinion that the most clinically relevant injury models are those in which the spinal cord is rapidly contused.1 Therefore, an important step in the preclinical evaluation of novel treatments on their way to human translation is an assessment of their efficacy in a model of contusion SCI within the cervical spinal cord. Here, we describe the technical aspects and resultant anatomical and behavioral outcomes of an unilateral contusive model of cervical SCI that employs the Infinite Horizon spinal cord injury impactor.
Sprague Dawley rats underwent a left-sided unilateral laminectomy at C5. To optimize the reproducibility of the biomechanical, functional, and histological outcomes of the injury model, we contused the spinal cords using an impact force of 150 kdyn, an impact trajectory of 22.5&deg; (animals rotated at 22.5&deg;), and an impact location off of midline of 1.4 mm. Functional recovery was assessed using the cylinder rearing test, horizontal ladder test, grooming test and modified Montoya's staircase test for up to 6 weeks, after which the spinal cords were evaluated histologically for white and grey matter sparing.
The injury model presented here imparts consistent and reproducible biomechanical forces to the spinal cord, an important feature of any experimental SCI model. This results in discrete histological damage to the lateral half of the spinal cord which is largely contained to the ipsilateral side of injury. The injury is well tolerated by the animals, but does result in functional deficits of the forelimb that are significant and sustained in the weeks following injury. The cervical unilateral injury model presented here may be a resource to researchers who wish to evaluate potentially promising therapies prior to human translation.

A reliable and repeatable way to produce a cervical unilateral spinal cord injury using the Infinite Horizon impactor is described. The method takes advantage of a custom designed frame and clamp to stabilize the spine. The standardized procedure and biomechanical injury parameters result in sufficient and sustained injuries.

無限の地平線インパクターを用いた片側頚髄損傷の打撲のモデル

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

医学

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progress in prostate cancer research is severely limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems, which limit our ability to understand genetic and molecular events underlying prostate disease initiation. Toward developing better model systems for studying human prostate carcinogenesis, we and others have taken advantage of the unique pro-prostatic inductive potential of embryonic rodent prostate stroma, termed urogenital sinus mesenchyme (UGSM). When recombined with certain pluripotent cell populations such as embryonic stem cells, UGSM induces the formation of normal human prostate epithelia in a testosterone-dependent manner. Such a human model system can be used to investigate and experimentally test the ability of candidate prostate cancer susceptibility genes at an accelerated pace compared to typical rodent transgenic studies. Since Human embryonic stem cells (hESCs) can be genetically modified in culture using inducible gene expression or siRNA knock-down vectors prior to tissue recombination, such a model facilitates testing the functional consequences of genes, or combinations of genes, which are thought to promote or prevent carcinogenesis.
The technique of isolating pure populations of UGSM cells, however, is challenging and learning often requires someone with previous expertise to personally teach. Moreover, inoculation of cell mixtures under the renal capsule of an immunocompromised host can be technically challenging. Here we outline and illustrate proper isolation of UGSM from rodent embryos and renal capsule implantation of tissue mixtures to form human prostate epithelium. Such an approach, at its current stage, requires in vivo xenografting of embryonic stem cells; future applications could potentially include in vitro gland formation or the use of induced pluripotent stem cell populations (iPSCs).

To unravel the earliest molecular mechanisms underlying prostate cancer initiation, novel and innovative human model systems and approaches are desperately needed. The potential of pre-prostatic urogenital sinus mesenchyme (UGSM) to induce pluripotent stem cell populations to form human prostate epithelium is a powerful experimental tool in prostate research.

齧歯尿生殖洞間充織とヒト幹細胞の組織の組換えを用いたヒト前立腺上皮の形成

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Dried Blood Spot Collection of Health Biomarkers to Maximize Participation in Population Studies

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spots meet this need, and can be collected in the field with high response rates. These elements are particularly important in longitudinal study designs including interventions where attrition is critical to avoid, and high response rates improve the interpretation of results. Dried Blood Spot sample collection is simple, quick, relatively painless, less invasive then venipuncture, and requires minimal field storage requirements (i.e.&#160;samples do not need to be immediately frozen and can be stored for a long period of time in a stable freezer environment before assay). The samples can be analyzed for a variety of different analytes, including cholesterol, C-reactive protein, glycosylated hemoglobin, numerous cytokines, and other analytes, as well as provide genetic material. DBS collection is depicted as employed in several recent studies.

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease or health. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spot (DBS) collection meets this need, can be collected in the field with high response rates&#160;and analyzed for a variety of biomarkers.

集団研究への参加を最大化するために健康バイオマーカーの血液スポットコレクション乾燥させ

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, ...

Absolute Quantification of A&#946;1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the diagnosis of AD is based on cognitive tests and mental state exams, but the peptide amyloid-beta (A&#946;) in cerebrospinal fluid (CSF) is increasingly used in clinical trials and settings. As for most protein and peptide biomarkers, quantification is performed using antibody-based techniques, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, intra- and inter-laboratory variability in these assays hamper its use as a diagnostic marker in clinical routine.
An antibody-independent Reference Measurement Procedure (RMP) was developed based on solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography (LC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), where stable, isotope-labeled A&#946; peptides were used as internal standards, enabling absolute quantification. A high-resolution quadrupole-orbitrap hybrid instrument was used for the measurements. The method allows for the quantification of CSF A&#946;1-42 between 150-4,000 pg/mL.

Absolute Quantification of A&amp;#946;&lt;sub&gt;1-42&lt;/sub&gt; in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

A reference measurement procedure for the absolute quantification of A&#946;1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.

Aβの絶対定量<sub&gt; 1-42</sub&gt; CSFに質量分析リファレンス測定手順を使用して

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Ivacaftor、主要な代謝産物および嚢胞性線維症患者の体液中の Lumacaftor の臨床サンプルの高スループット分析のための最適化された LC-MS/MS 法

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but regardless of the approach, an in vivo model is needed to test each treatment. The pig is one of the most used large animal models for cardiovascular disease. Its heart is very similar in anatomy and function to that of a human. The ameroid placement technique creates an ischemic area of the heart, which has many useful applications in studying myocardial infarction. This model has been used for surgical research, pharmaceutical studies, imaging techniques, and cell therapies.
There are several ways of inducing an ischemic area in the heart. Each has its advantages and disadvantages, but the placement of an ameroid constrictor remains the most widely used technique. The main advantages to using the ameroid are its prevalence in existing research, its availability in various sizes to accommodate the anatomy and size of the vessel to be constricted, the surgery is a relatively simple procedure, and the post-operative monitoring is minimal, since there are no external devices to maintain. This paper provides a detailed overview of the proper technique for the placement of the ameroid constrictor.

The purpose of this protocol is to demonstrate the placement of a delayed constricting device (an ameroid constrictor) around a coronary artery in a swine model. This device creates an ischemic area of the heart that is useful for studying new diagnostic imaging techniques and new methods of treatment.

アメロイド収縮を使用して豚の慢性心筋虚血モデル

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

体外血液脳関門ブタ脳血管内皮細胞に基づくモデルの確立のための改良法

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained using laser Doppler flowmetry (LDF). This paper demonstrates a closed skull preparation that allows cerebral blood flow to be assessed without penetrating the skull or installing a chamber or cerebral window. To evaluate autoregulatory mechanisms, a model of controlled blood pressure reduction via graded hemorrhage can be utilized while simultaneously employing LDF. This enables the real time tracking of the relative changes in the blood flow in response to reductions in arterial blood pressure produced by the withdrawal of circulating blood volume. This paradigm is a valuable approach to study cerebral blood flow autoregulation during reductions in arterial blood pressure and, with minor modifications in the protocol, is also valuable as an experimental model of hemorrhagic shock. In addition to evaluating autoregulatory responses, LDF can be used to monitor the cortical blood flow when investigating metabolic, myogenic, endothelial, humoral, or neural mechanisms that regulate cerebral blood flow and the impact of various experimental interventions and pathological conditions on cerebral blood flow.

This article demonstrates the use of laser Doppler flowmetry to evaluate the ability of the cerebral circulation to autoregulate its blood flow during reductions in arterial blood pressure.

レーザードップラー流量測定を用いたラットにおける脳血流自動調節の評価

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. Plasma drug levels are the current gold standard assessment, but require phlebotomy and a cold chain, and capture only very recent adherence. Our method uses hair, a matrix that is easily collected and reflective of long-term adherence, to test for 11 anti-TB medications. Previous work by our group shows that antiretroviral drug levels in hair are associated with HIV outcomes. Our method for DR-TB drugs uses 2 mg of hair (3 cm proximal to the root), which is pulverized and extracted in methanol. Samples are analyzed with a single LC-MS/MS method, quantifying 11 drugs in a 16 min run. Lower limits of quantification (LLOQs) for the 11 drugs range from 0.01 ng/mg to 1 ng/mg. Drug presence is confirmed by comparing ratios of two mass spectrometry transitions. Samples are quantified using the area ratio of the drug to the deuterated, 15N-, or 13C-labeled drug isotopologue. We used a calibration curve ranging from 0.001-100 ng/mg. Application of the method to a convenience sample of hair samples collected from DR-TB patients on directly observed therapy (DOT) indicated drug levels in hair within the linear dynamic range of nine of the eleven drugs (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimine, bedaquiline, pretomanid). No patient was on prothionamide, and the measured levels for ethionamide were close to its LLOQ (with further work instead examining the suitability of ethionamide&#8217;s metabolite for monitoring exposure). In summary, we describe the development of a multi-analyte panel for DR-TB drugs in hair as a technique for therapeutic drug monitoring during drug-resistant TB treatment.

Current methods of analyzing patients&#8217; adherence to complex drug resistant-tuberculosis (DR-TB) regimens can be inaccurate and resource-intensive. Our method analyzes hair, an easily collected and stored matrix, for concentrations of 11 DR-TB medications. Using LC-MS/MS, we can determine sub-nanogram drug levels that can be utilized to better understand drug adherence.

小さな毛髪サンプルで11の薬剤耐性結核薬を定量化するための検証済みのLC-MS/MSパネル

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...

Human Fetal Blood Flow Quantification with Magnetic Resonance Imaging and Motion Compensation

Magnetic resonance imaging (MRI) is an important tool for the clinical assessment of cardiovascular morphology and heart function. It is also the recognized standard-of-care for blood flow quantification based on phase contrast MRI. While such measurement of blood flow has been possible in adults for decades, methods to extend this capability to fetal blood flow have only recently been developed.
Fetal blood flow quantification in major vessels is important for monitoring fetal pathologies such as congenital heart disease (CHD) and fetal growth restriction (FGR). CHD causes alterations in the cardiac structure and vasculature that change the course of blood in the fetus. In FGR, the path of blood flow is altered through the dilation of shunts such that the oxygenated blood supply to the brain is increased. Blood flow quantification enables assessment of the severity of the fetal pathology, which in turn allows for suitable&#160;in utero&#160;patient management and planning for postnatal care.
The primary challenges of applying phase contrast MRI to the human fetus include small blood vessel size, high fetal heart rate, potential MRI data corruption due to maternal respiration, unpredictable fetal movements, and lack of conventional cardiac gating methods to synchronize data acquisition. Here, we describe recent technical developments from our lab that have enabled the quantification of fetal blood flow using phase contrast MRI, including advances in accelerated imaging, motion compensation, and cardiac gating.

Here we present a protocol for measuring fetal blood flow rapidly with MRI and retrospectively performing motion correction and cardiac gating.