This work was supported by the United States Federal Drug Administration (FDA) contract HHSF223201310224C and the United States National Institutes of Health/FDA grant 1U01FD004573-01.

Amostras de sangue identificadas-de de indivíduos saudáveis ​​eram do Hospital da Universidade de Colorado (Aurora, Colorado). O uso de amostras de banco de sangue identificou-de para estudos de validação, bem como para a preparação dos calibradores e amostras de controle de qualidade foi considerada &quot;isentos&quot; pelo Conselho Colorado Multi-institucional Análises (COMIRB, Aurora, Colorado). 1. Preparação de Referências e Soluções <ol><li> Tacrolimus compra e do padrão interno D 2, 13 C-tacrolimus a partir dos fornecedores listados na Lista de Materiais. <ol><li> Preparar soluções de reserva em metanol puro a uma concentração de 1 mg / ml para o tacrolimus e uma concentração de 10 ug / ml de D 2, 13 C-tacrolimus. Faça soluções de estoque de materiais de referência com base em três ponderações independentes. Soluções de banco de alíquotas e armazenar a -70 ° C ou abaixo. </li></ol></li><li> Solução para precipitar proteínas Preparee extrair o tacrolimus usando metanol / 0,2 M ZnSO 4 em água (7: 3, v: v). Esta solução também contém o padrão interno D 2, 13 C-tacrolimus, a uma concentração de 2,5 ng / ml e foi utilizado para a extracção de todas as amostras, excepto para a extracção de amostras em branco (por favor ver 1.3.3). <ol><li> Prepara-se esta solução a precipitação da proteína de fresco em cada dia de extracção e definir a expiração da solução a 12 h. </li></ol></li><li> Preparação da curva de calibração e de controlo de qualidade (QC) amostras <ol><li> Preparar soluções estoque de tacrolimus através da realização de diluições apropriadas da solução utilizando metanol puro. </li><li> Para preparar os calibradores e as amostras de controlo de qualidade, pico de 20 ul de solução de reserva apropriadamente diluídas em EDTA sangue total, incuba-se a 37 ° C sob agitação suave num banho de água para permitir uma distribuição homogénea do tacrolimus para os componentes celulares do sangue durante 20 min e alíquota em 1,5 ml de pólipotubos ropylene com fundo cônico e snap-on tampas. Assegure-se que o volume relativo de solvente orgânico não exceda 5%. </li><li> Mancha 50 ul de sangue inteiro cravado no meio de cada círculo sobre os cartões de filtro, utilizando uma pipeta. </li><li> Secam-se as manchas de sangue em placas de filtro, à TA durante 3 h. </li><li> Preparar padrões de calibração de tacrolimus no sangue humano total com EDTA, em concentrações de tacrolimus de 1, 2,5, 5, 10, 25, e 50 ng / ml. Prepare uma amostra em branco para a extração de como os padrões de calibração com a solução de precipitação de proteínas contendo o padrão interno D 2, 13 C-tacrolimus (&quot;amostra zero&quot;). </li><li> Preparar amostras QC em sangue humano total com EDTA, em concentrações de 0, 2, 4, 20, 40 ng / ml. Prepare uma amostra em branco. Em contraste com as amostras de CQ que são extraídos com precipitação contendo o padrão interno D 2, 13 C-tacrolimus, extrair esta amostra em branco com uma solução de precipitação de proteínas que faznão contêm o padrão D interno 2, 13 C-tacrolimus (&quot;amostra em branco&quot;). </li></ol></li><li> Recolha de amostras clínicas <ol><li> Recolha manchas de sangue seco como descrito no 43,44. </li></ol></li></ol> 2. Extração de Tacrolimus secas amostras de sangue <ol><li> Inspecione visualmente a mancha de sangue seco para garantir a qualidade da amostra aceitável eo volume 45. </li><li> Soco centro da mancha de sangue no cartão de filtro com uma perfuração de 6 mm. Nota: A qualidade dos perfuradores pode ser monitorizada por pesagem. Um disco de filtro saturado perfurado pesa em média 5,02 mg ± 0,09 mg (intervalo: 4.83- 5,14 mg, n = 12). </li><li> Coloque os discos em tubos de 1,5 ml de polipropileno com cônico fundo e tampas snap-on. </li><li> Adicionar 20-30 balas para cada tubo. </li><li> Adicionar 500 ul da solução de precipitação de proteína (metanol: 0,2 M ZnSO4, 7: 3, v: v, com 2,5 ng / ml como padrão interno) para cada tubo. Para o extração de amostras em branco, usar a solução de precipitação de proteínas sem a referência interna. </li><li> Homogeneizar os discos no liquidificador bala por 1 min (velocidade máxima, a configuração &quot;10&quot;). </li><li> Agitar à TA amostras em vórtex multi-tubos (velocidade máxima, a configuração &quot;10&quot;) durante 10 min. </li><li> Centrifugar as amostras a 16.000 xg e 4 ° C durante 10 min. </li><li> Transfira os sobrenadantes para frascos de HPLC de vidro equipado com uma inserção de 300 ul. Utilizar vedações teflon pré-fenda. Nota: Extraiu-se as amostras podem ser armazenadas a -20 ° C ou abaixo até a análise por LC-MS / MS. </li></ol> 3. LC-MS / MS Análise <ol><li> Carga de 100 ul do sobrenadante da amostra extraída para a coluna de extracção de cartucho C8 e lava-se com uma proporção de 7: 3 de ácido fórmico a 0,1% em água: acetonitrilo a um caudal de 5 ml / min durante 1 min. As ligações da válvula de comutação são apresentados na Figura 2 e o gradiente executado pela bomba de extracção na Tabela 1 </strong&gt;. </li><li> A partir de agora, ativar a válvula de comutação resultando em back-resplendor dos analitos da pré-coluna para a coluna analítica. </li><li> Regule o termostato de coluna a 65 ° C. </li><li> Eluir os analitos a partir da coluna analítica utilizando as taxas de fluxo e o gradiente mostrados na Tabela 1. </li><li> Ligue a coluna analítica a um espectrômetro de massa em tandem através da fonte de ionização electrospray turbo. Ajustar os parâmetros-chave do espectrômetro de massa de acordo com a Tabela 2. </li><li> Detectar iões positivos ([M + Na] +) no modo de reacção múltipla (MRM). Use as seguintes transições íon para quantificação: tacrolimus: m / z (massa / carga) = 826,6 → 616,2 e D 2, 13 C-tacrolimus: m / z = 829,6 → 619,2. Nota: O tempo total de execução é de 4,6 min. </li></ol> 4. Quantificação <ol><li> Para cada prazo, gerar uma curva de calibração com base nos calibradores preparados em 1.3.5 eincluir em cada corrida analítica. <ol><li> Gerar uma curva de calibração locando as concentrações nominais contra o factor de resposta de analito (Peak Área [Analyte] / Área de Pico [padrão interno]) usando o software espectrômetro de massa. </li><li> Encaixe os calibradores usando um ajuste quadrático em combinação com 1 / X ponderação. </li></ol></li><li> Para tacrolimus quantidade nas manchas de sangue seco integrar o tacrolimus e picos do padrão interno nos cromatogramas MRM extraídos. Calcular o factor de resposta para o tacrolimus (área do pico [Analito] / área de pico [padrão interno]) e comparar com a curva de calibração utilizando o software de espectrometria de massa. </li></ol> Procedimentos de validação 5. <ol><li> Lower limite de detecção (LLOD) e limite inferior de quantificação (LIQ). <ol><li> Considere o menor concentração de tacrolimus com uma relação de pico-para-ruído de 4: 1, como o limite inferior de detecção (LLOD). Definir o limite inferior de quantificação (LIQ) como oconcentração mais baixa da curva de calibração com uma precisão igual ou melhor do que ± 20% de desvio a partir da concentração nominal e precisão igual ou melhor do que 20% (coeficiente de variação). </li></ol></li><li> Precisões intra e inter-dia e precisões. <ol><li> Teste a exatidão e precisão em quatro níveis de concentração de 2 ng / ml (QC1), 4 ng / ml (QC2), 20 ng / ml (QC3) e 40 ng / ml (QC4). </li><li> Preparar as amostras de QC em cada dia de validação em sangue humano total com EDTA, em placas de filtro seco, extrair e analisar tal como descrito acima. </li><li> Determinar exatidão e precisão intra-dia com 6 amostras por nível de concentração QC. </li><li> Avaliar exatidão e precisão inter-dia ao longo de 20 dias. Meça cada nível QC com 4 amostras por dia. </li><li> Analise duas curvas de calibração, juntamente com as amostras QC em cada dia. </li><li> Calcule precisão intra-dia como a% da concentração nominal (seis amostras por nível de concentração, por favor, consulte o item 5.2.2). CalcUlate precisão como o coeficiente de variação (CV%). </li><li> Considere exactidão intra-diária aceitável se cai na aceitação limita 85% a 115% da concentração nominal. Considere precisão intra-dia aceitável se é igual ou melhor do que um CV (coeficiente de variação) de 15%. </li><li> Calcule exatidão e precisão inter-dia como a média para cada nível de concentração QC analisados ​​ao longo dos 20 dias de validação. </li><li> Considere precisão média inter-dia aceitável se cai na aceitação limita 85% a 115% da concentração nominal. Considere precisão inter-dia aceitável se é igual ou melhor do que um CV (coeficiente de variação) de 15%. </li></ol></li><li> Exclusão de interferências da matriz. <ol><li> Para a exclusão das interferências que podem ser provocadas pelos sinais de matriz, analisar manchas de sangue seco em branco (8 indivíduos diferentes, de preferência 4 homens e 4 mulheres). </li><li> Inspecione visualmente cromatogramas iónicos. Se picos dentro do tempo de retençãojanela de tacrolimus são detectados, integrar e comparar as suas áreas sob a curva com os de picos de tacrolimus em amostras em branco enriquecida com tacrolimus no LLOQ. A área de picos nas amostras em branco não devem exceder 15% das pessoas de tacrolimus no LLOQ. </li></ol></li><li> Ion supressão / aprimoramento de íons. <ol><li> Use um protocolo de infusão pós-coluna, conforme descrito 45 para avaliar a possibilidade de interferências de realce ion supressão / ion causada por componentes da matriz de co-eluição. </li><li> Infundir o tacrolimus numa concentração de 10 ug / ml dissolvido em ácido fórmico a 0,1%: metanol (30:70, v / v) de pós-coluna a uma taxa de 10 ul / min. <ol><li> Conectar uma bomba de seringa através de peça em T entre a coluna analítica e a fonte de electropulverização do espectrómetro de massa. </li><li> Monitorizar a intensidade do sinal de MS / MS das transições MRM de tacrolimus e do seu padrão interno (m / z = 826,6 → 616,2 e m / z = 829,6 → 619,2) após a injecção de extracAs amostras em branco ted (n = 8 amostras de indivíduos diferentes). Nota: Na ausência de melhoria de supressão de iões / o ião de sinal causada por infusão contínua dos analitos não deve ser afectado por injecção da matriz em branco, enquanto a supressão de iões provoca uma queda do sinal e um pico de iões de reforço. </li></ol></li></ol></li><li> Transferir. <ol><li> Avaliar o potencial de carry-over Ao analisar amostras extraídas em branco após os mais altos calibradores (50 ng / ml, n = 6). </li><li> Inspecione visualmente cromatogramas iónicos. Se forem detectados picos dentro da janela de tempo de retenção do tacrolimus, integrar e comparar as suas áreas sob a curva com os picos de tacrolimus em amostras em branco enriquecida com tacrolimus no LLOQ. A área de picos nas amostras em branco não devem exceder 15% das pessoas de tacrolimus no LLOQ. </li></ol></li><li> Recuperações de extração. <ol><li> Determinar recuperações por comparação dos sinais dos analitos após extracção de QC sampios em todos os quatro níveis de concentração (n = 6 por concentração) com os de branco manchas de sangue seco enriquecida com os correspondentes montantes das tacrolimus após a extração. </li><li> Prepare quatro conjuntos de CQ (níveis de concentração: 2, 4, 20, 40 ng / mL). </li><li> Preparar outro 4 conjuntos de amostras de ensaio correspondente &quot;recuperação&quot; através da identificação de 50 ul de sangue total com EDTA em branco para os cartões de papel de filtro e secagem durante 2 horas. </li><li> A partir de agora, tanto para o QC e em branco &quot;amostras de teste de recuperação&quot;, cortar toda a mancha de sangue no cartão de filtro com uma tesoura e coloque os discos resultantes em um tubo cônico de polipropileno com fundo e snap-on tampa. </li><li> Extraia todas as amostras. </li><li> Transfira os sobrenadantes (400 uL) para frascos de vidro de HPLC. </li><li> Adicionar solução estoque tacrolimus aos &quot;corpos de prova de recuperação extraído em branco&quot; para atingir concentrações de 2, 4, 20 e 40 ng / ml (4 ul de 200, 400, 2.000, 4.000 ng ml sol / estoque tacrolimusdoras de 400 ul de sobrenadante). </li><li> Após análise por LC-MS / MS, comparar os sinais em ambas as amostras de QC e amostras de teste &quot;recuperação&quot; de a concentração correspondente (% de recuperação = amostras de sinal cravado antes das amostras de extracção / sinal cravado após extracção x 100). </li></ol></li><li> Diluição integridade. <ol><li> Estabelecer integridade diluição com amostras fortificadas com os analitos em 500, 250 e 100 ng / ml. </li><li> Após a extração, diluir as amostras usando solução de precipitação de proteínas (1:10, n = 3 por nível de concentração). </li><li> Calcular desvios em relação às concentrações nominais. Considere resultados que caem dentro de 85% -115% do valor nominal aceitável. </li></ol></li><li> Estabilidades. <ol><li> Investigar estabilidades, utilizando as amostras de CQ em todos os quatro níveis de concentração (n = 4 para cada concentração) analisada em diferentes pontos de tempo e sob as diferentes condições de armazenagem. </li><li> Compare os resultados após a armazenagem, com os valores nominais. Considere resultados que caem dentro de 85% -115% do valor nominal aceitável. </li><li> Estabelecer estabilidade da amostra durante 1 semana à temperatura ambiente, 1 semana a 4 ° C, 1 mês a -20 ° C e 1 mês à temperatura de -80 ° C. </li><li> Teste de estabilidade congelamento-descongelamento durante três ciclos (-20 ° C). Teste amostra extraída e a estabilidade do amostrador automático por colocar as amostras no amostrador automático com termostato ajustado para 4 ° C. Injectar as amostras depois de 72 horas. </li></ol></li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Embora, como acima mencionado, o conceito de fármaco terapêutico e monitorização aderência do tacrolimus com base em manchas de sangue seco é atraente, existem desafios analíticos que ultrapassam aquelas tipicamente associados com a análise por LC-MS / MS do tacrolimus em EDTA venoso amostras de sangue inteiro. Estes incluem, mas não estão limitados a, o facto de a matriz capilar é sangue completo embebido no material de fibras de algodão do material de cartão de filtro usado aqui e o baixo volume de sangue...

O tacrolimus é um potente immonosuppressant 1-7 que tem uma estrutura de macrólido 8 (Figura 1). Devido a cis - isomerismo trans das ligações NC que forma dois rotâmeros em solução 9 que podem ser separados por cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa (HPLC) Tacrolimus é lipofilico e solúvel em álcoois (metanol: 653 g / L, etanol: 355 g / L), hidrocarbonetos halogenados (clorofórmio: 573 g / L) e éter. É moderadamente solúvel em hidrocarbonetos alifáticos (hexano: 0,1 g / L e de água (pH 3:. 0,0047 g / L) 9 A molécula não contém quaisquer cromóforo e o seu máximo de absorção de UV de 192 nm tacrolimus actua através da inibição da calcineurina. . O seu mecanismo de acção foi revisto em referências 10,11. Ele é actualmente utilizado em mais de 80% dos pacientes de transplante de órgãos sólidos nos Estados Unidos 12. O índice terapêutico de tacrolimus é considerád para ser estreita 13. Além disso, a correlação entre doses de tacrolimus e as concentrações sanguíneas é pobre e farmacocinética é variável 14,15. A monitorização terapêutica para orientar a dosagem tacrolimus em doentes transplantados é a prática clínica, pois, em geral 16-20. O objectivo é manter as concentrações sanguíneas de tacrolimus dentro de uma gama terapêutica pré-definido. Concentrações sanguíneas Tacrolimus abaixo da gama terapêutica pode resultar numa actividade aumentada de reacções alo-imune crónica ou aguda, enquanto que as concentrações acima da janela terapêutica aumentar o risco de sobre-imunossupressão, cancro e toxicidade, como nefrotoxicidade, neurotoxicidade, hipertensão, e diabetes. A alta variabilidade intra-individual de farmacocinética de tacrolimus pode ser prejudicial tanto para órgãos transplantados e sobrevida do paciente 21,22. Enquanto a variabilidade inter-individual na farmacocinética do tacrolimus é causada principalmente por polimorfismos CYP3A5, razões para intra-individualvariabilidade incluem, mas não estão limitados a, fármaco-fármaco, com a doença da droga e droga-alimento interacções 14,15. Também a falta de adesão ao regime de imunossupressão terapêutica medicamentosa é um fator contribuinte e uma das principais razões para a perda do enxerto 23,24. Estas considerações sugerem que casa freqüente de drogas terapêuticas e monitoramento da adesão de concentrações de tacrolimus no sangue total pode ser benéfica para garantir que os pacientes têm uma exposição de tacrolímus dentro da janela terapêutica desejada em todos os momentos. No entanto, a logística e os custos de monitorização mais frequente da terapêutica medicamentosa, pois é atual prática clínica 15 é proibitivo. Uma das razões é que o paciente tem de ver uma flebotomia para ter a amostra de sangue venoso necessária desenhada. Manchas de sangue seco surgiram recentemente como um conceito atraente 25-28. Depois de um dedo simples furar o paciente coleta uma gota de sangue em um cartão de papel de filtro especial e após o ponto de sangue tem dRied, pode ser enviado para um laboratório central para análise de tacrolimus e qualquer outro imunossupressor que o paciente possa estar a tomar actualmente. Isto tornou-se possível devido ao desenvolvimento de ensaios de LC-MS / MS altamente sensíveis e específicos para a quantificação de tacrolimus e outros imunossupressores no sangue em volumes muito pequenos, tais como manchas de sangue seco (tipicamente 20 ul de sangue 25,29-43). Outra vantagem é que os baixos estratégias de cobrança minimamente invasivas, amostra de volume, tais como manchas de sangue seco facilitar muito monitorização terapêutica e estudos farmacocinéticos em crianças pequenas 28. Tacrolimus geralmente é medido em toda EDTA sangue venoso 15. As razões são que o tacrolimus é extensamente distribuída a células do sangue e que os estudos clínicos relataram melhor correlação entre as concentrações de tacrolimus calha no sangue do que em plasma com eventos clínicos 15,18. Em comparação, a análise de TAcrolimus em manchas de sangue seco é baseado no sangue capilar que é misturado com a matriz de papel de filtro. Isso apresenta desafios em termos de solubilização de tacrolimus e potenciais interferências com a análise LC-MS / MS. Aqui apresenta-se um ensaio estabelecido e validado com base na homogeneização da mancha de sangue seco usando um misturador de bala em combinação com um alto fluxo de amostra de coluna em linha limpar procedimento e análise por LC-MS / MS. Até hoje, este ensaio tem sido usado com sucesso para a quantificação de mais de cinco mil amostras de sangue para monitorização de tacrolimus seca aderência em ensaios clínicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reference Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tacrolimus</td>
			<td>U.S. Pharmacopeial Convention</td>
			<td>1642802</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2,13C-Tacrolimus</td>
			<td>Toronto Research Chemicals Inc.</td>
			<td>F370002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Test Materials</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red blood cells</td>
			<td>University of Colorado Hospital</td>
			<td>W20091305500 V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma</td>
			<td>University of Colorado Hospital</td>
			<td>W2017130556300Q</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solvents</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone CHROMASOLV, HPLC, &#8805; 99,9 %</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>439126-4 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile Optima LC/ MS, UHPLC- UV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A955-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isopropanol 99.9 %, HPLC</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2632-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol Optima LC/ MS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Optima LC/ MS, UHPLC- UV</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other Chemicals</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A118P-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc sulfate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Z68-500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Instruments and Consumables</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 &#8211; 10 &#181;l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008649</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,5 mL- Eppendorf tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-682-550</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#8211; 100 &#181;L pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008651</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT 10XLS3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#8211; 1000 &#181;l pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008653</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Neptune</td>
			<td>BT 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Multimax</td>
			<td>2940</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 &#8211; 20 &#181;L pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008650</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL- Eppendorf tube</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>02-681-258</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#8211; 200 &#181;L pipet, VoluMate LIQUISYSTEMS</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>17008652</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>GeneMate</td>
			<td>P-1237-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L- pipet tips with filter</td>
			<td>Multimax</td>
			<td>2938T</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L- pipet tips with filter, sterile</td>
			<td>Multimax</td>
			<td>2936J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL- Falcon tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352070</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#956;L inserts for&#160; HPLC vials</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>ARO-9973-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balance PR2002</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>1117050723</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balances AX205 Delta Range</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>1119343379</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender Homogenizer</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge Biofuge Fresco</td>
			<td>Heraeus</td>
			<td>290395</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Wipes</td>
			<td>PDI</td>
			<td>Q55172</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass v ials, 4 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>14-955-334</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials, 20 mL</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>B7800-20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves, nitrile</td>
			<td>Titan Brand Gloves</td>
			<td>44-100S</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC vials, 9 mm, 2 mL, clear</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>ARO- 9921-13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lids for HPLC vials</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>ARO- 8952-13-B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle, 18G 1.5</td>
			<td>Precision Glide</td>
			<td>305196</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for Eppendorf tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-448-11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rack for HPLC Vials</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>05-541-29</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steel beads 0.9 &#8211; 2 mm</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>SSB14B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Storage boxes for freezers / refrigerators</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>03-395-464</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard multi-tube vortexer</td>
			<td>VWR Scientific Products</td>
			<td>658816-115</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Paper, 903 Protein Saver US 100/PK</td>
			<td>GE Whatman&#160;</td>
			<td>2016-05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Equipment and Columns</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler</td>
			<td>CTC PAL&#160;</td>
			<td>PAL.HTCABIx1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binary pump, Agilent 1260 Infinity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 G1312B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binary pump, Agilent 1290 Infinity</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1290 G4220A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro vacuum degasser, Agilent 1260</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1260 G13798</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Column oven,&#160; Agilent 1290 with 2 position&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1290 G1216C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermostated column compartment with integrated 6 port switching valve</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>1290 G1316C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC pre-column cartridge, Zorbax XDB C8 (5 &#181;m particle size), 4.6 &#183; 12.5 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>820950-926</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC analytical column, Zorbax Eclipse-XDB-C8 (5 &#181;m particle size), 4.6 &#183; 150 mm</td>
			<td>Phenomenex</td>
			<td>993967-906</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tandem Mass Spectrometer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API5000 MS/MS with TurboIonspray source</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>4364257</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometry software</td>
			<td>AB Sciex</td>
			<td>Analyst 1.5.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of the immunosuppressant tacrolimus on dried blood spots using lc-ms/ms

O tacrolimus inibidor da calcineurina é a pedra angular da maioria dos protocolos de tratamento imunossupressores após transplante de órgão sólido nos Estados Unidos. Tacrolimus é uma droga estreito índice terapêutico e, como tal, exige monitorização terapêutica e ajuste de dose com base em toda a sua concentrações mínimas no sangue. Para facilitar casa droga terapêutica e monitoramento da adesão, a coleta de gotas de sangue seco é um conceito atraente. Depois de uma picada no dedo, o paciente recebe uma gota de sangue em papel de filtro em casa. Depois de o sangue é seca, que é enviado para o laboratório de análises, onde o tacrolimus é quantificada usando espectrometria de massa líquida de alta eficiência A cromatografia-tandem (HPLC-MS / MS), em combinação com um manual simples passo de precipitação de proteína e de extracção em linha da coluna. Para a análise de tacrolimus, um disco de 6 mm é perfurado a partir do centro do local saturada de sangue. A mancha de sangue é homogeneizada utilizando um misturador de uma balaND, em seguida, as proteínas são precipitadas com metanol / 0,2 M ZnSO4 contendo o padrão interno D 2, 13 C-tacrolimus. Após agitação em vórtice e centrifugação, 100 ul de sobrenadante foi injectada numa coluna de extracção em linha e lavou-se com 5 mL / min de ácido fórmico a 0,1 / acetonitrilo (7: 3, v: v) durante 1 min. Daqui por diante, a válvula de comutação é activada e os analitos são back-lavada na coluna analítica (e separados utilizando um gradiente de ácido fórmico / acetonitrilo a 0,1%). O tacrolimus é quantificada no modo positivo de multi reacção (MRM) usando um espectrómetro de massa em tandem. O ensaio é linear de 1 a 50 ng / ml. A variabilidade inter-ensaio (3,6% -6,1%) e precisão (91,7% -101,6%), avaliada durante 20 dias satisfazer os critérios de aceitação. A recuperação média de extração é de 95,5%. Não há carry-over, interferências de matriz e efeitos de matriz relevante. O tacrolimus é estável em manchas de sangue seco em temperatura ambiente e a +4 ° C durante 1 semana. Amostras extraídas doamostrador automático são estáveis ​​a 4 ° C durante pelo menos 72 h.

Cromatogramas iónicos representativos de uma amostra em branco, uma amostra enriquecida para o limite inferior de quantificação e uma amostra do paciente são apresentados na Figura 3. As curvas de calibração O limite inferior de detecção foi de 0,5 ng / ml e o limite inferior de quantificação foi de 1,0 ng / ml. Cinquenta ng / ml foi escolhido como o mais alto calibrador como concentrações mais elevadas não são susc...

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Quantification of the Immunosuppressant Tacrolimus on Dried Blood Spots Using LC-MS/MS

Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

Quantificação do imunossupressor tacrolimus em manchas de sangue seco utilizando LC-MS / MS

The calcineurin inhibitor tacrolimus is the cornerstone of most immunosuppressive treatment protocols after solid organ transplantation in the United ...

quantification-immunosuppressant-tacrolimus-on-dried-blood-spots

Research

JoVE Journal

Medicine

16.8K visualizações.  University of Colorado, Anschutz Medical Campus. Here we describe a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) assay to quantify the immunosuppressant tacrolimus in dried blood spots using a simple manual protein precipitation step and online column extraction.

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A Contusive Model of Unilateral Cervical Spinal Cord Injury Using the Infinite Horizon Impactor

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of spinal cord injury (SCI) in which the thoracic spinal cord is injured. Additionally, because most human cord injuries occur as the result of blunt, non-penetrating trauma (e.g. motor vehicle accident, sporting injury) where the spinal cord is violently struck by displaced bone or soft tissues, the majority of SCI researchers are of the opinion that the most clinically relevant injury models are those in which the spinal cord is rapidly contused.1 Therefore, an important step in the preclinical evaluation of novel treatments on their way to human translation is an assessment of their efficacy in a model of contusion SCI within the cervical spinal cord. Here, we describe the technical aspects and resultant anatomical and behavioral outcomes of an unilateral contusive model of cervical SCI that employs the Infinite Horizon spinal cord injury impactor.
Sprague Dawley rats underwent a left-sided unilateral laminectomy at C5. To optimize the reproducibility of the biomechanical, functional, and histological outcomes of the injury model, we contused the spinal cords using an impact force of 150 kdyn, an impact trajectory of 22.5&deg; (animals rotated at 22.5&deg;), and an impact location off of midline of 1.4 mm. Functional recovery was assessed using the cylinder rearing test, horizontal ladder test, grooming test and modified Montoya's staircase test for up to 6 weeks, after which the spinal cords were evaluated histologically for white and grey matter sparing.
The injury model presented here imparts consistent and reproducible biomechanical forces to the spinal cord, an important feature of any experimental SCI model. This results in discrete histological damage to the lateral half of the spinal cord which is largely contained to the ipsilateral side of injury. The injury is well tolerated by the animals, but does result in functional deficits of the forelimb that are significant and sustained in the weeks following injury. The cervical unilateral injury model presented here may be a resource to researchers who wish to evaluate potentially promising therapies prior to human translation.

A reliable and repeatable way to produce a cervical unilateral spinal cord injury using the Infinite Horizon impactor is described. The method takes advantage of a custom designed frame and clamp to stabilize the spine. The standardized procedure and biomechanical injury parameters result in sufficient and sustained injuries.

Um Modelo contundente de lesão da medula espinhal cervical unilateral Usando o Impactor horizonte infinito

While the majority of human spinal cord injuries occur in the cervical spinal cord, the vast majority of laboratory research employs animal models of ...

Medicina

Formation of Human Prostate Epithelium Using Tissue Recombination of Rodent Urogenital Sinus Mesenchyme and Human Stem Cells

Progress in prostate cancer research is severely limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems, which limit our ability to understand genetic and molecular events underlying prostate disease initiation. Toward developing better model systems for studying human prostate carcinogenesis, we and others have taken advantage of the unique pro-prostatic inductive potential of embryonic rodent prostate stroma, termed urogenital sinus mesenchyme (UGSM). When recombined with certain pluripotent cell populations such as embryonic stem cells, UGSM induces the formation of normal human prostate epithelia in a testosterone-dependent manner. Such a human model system can be used to investigate and experimentally test the ability of candidate prostate cancer susceptibility genes at an accelerated pace compared to typical rodent transgenic studies. Since Human embryonic stem cells (hESCs) can be genetically modified in culture using inducible gene expression or siRNA knock-down vectors prior to tissue recombination, such a model facilitates testing the functional consequences of genes, or combinations of genes, which are thought to promote or prevent carcinogenesis.
The technique of isolating pure populations of UGSM cells, however, is challenging and learning often requires someone with previous expertise to personally teach. Moreover, inoculation of cell mixtures under the renal capsule of an immunocompromised host can be technically challenging. Here we outline and illustrate proper isolation of UGSM from rodent embryos and renal capsule implantation of tissue mixtures to form human prostate epithelium. Such an approach, at its current stage, requires in vivo xenografting of embryonic stem cells; future applications could potentially include in vitro gland formation or the use of induced pluripotent stem cell populations (iPSCs).

To unravel the earliest molecular mechanisms underlying prostate cancer initiation, novel and innovative human model systems and approaches are desperately needed. The potential of pre-prostatic urogenital sinus mesenchyme (UGSM) to induce pluripotent stem cell populations to form human prostate epithelium is a powerful experimental tool in prostate research.

Formação de Epithelium próstata humano utilizando Tissue Recombinação de Rodent Urogenital Mesênquima Sinus e células-tronco humanas

Progress in prostate cancer research is severely  limited by the availability of human-derived and hormone-na&iuml;ve model systems,  which limit our ...

Dried Blood Spot Collection of Health Biomarkers to Maximize Participation in Population Studies

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spots meet this need, and can be collected in the field with high response rates. These elements are particularly important in longitudinal study designs including interventions where attrition is critical to avoid, and high response rates improve the interpretation of results. Dried Blood Spot sample collection is simple, quick, relatively painless, less invasive then venipuncture, and requires minimal field storage requirements (i.e.&#160;samples do not need to be immediately frozen and can be stored for a long period of time in a stable freezer environment before assay). The samples can be analyzed for a variety of different analytes, including cholesterol, C-reactive protein, glycosylated hemoglobin, numerous cytokines, and other analytes, as well as provide genetic material. DBS collection is depicted as employed in several recent studies.

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease or health. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spot (DBS) collection meets this need, can be collected in the field with high response rates&#160;and analyzed for a variety of biomarkers.

Secas Coleta de Sangue Mancha de Biomarcadores de saúde para maximizar a participação em Estudos Populacionais

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, ...

Absolute Quantification of A&#946;1-42 in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the diagnosis of AD is based on cognitive tests and mental state exams, but the peptide amyloid-beta (A&#946;) in cerebrospinal fluid (CSF) is increasingly used in clinical trials and settings. As for most protein and peptide biomarkers, quantification is performed using antibody-based techniques, such as enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). However, intra- and inter-laboratory variability in these assays hamper its use as a diagnostic marker in clinical routine.
An antibody-independent Reference Measurement Procedure (RMP) was developed based on solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography (LC)-tandem mass spectrometry (MS/MS), where stable, isotope-labeled A&#946; peptides were used as internal standards, enabling absolute quantification. A high-resolution quadrupole-orbitrap hybrid instrument was used for the measurements. The method allows for the quantification of CSF A&#946;1-42 between 150-4,000 pg/mL.

Absolute Quantification of A&amp;#946;&lt;sub&gt;1-42&lt;/sub&gt; in CSF Using a Mass Spectrometric Reference Measurement Procedure

A reference measurement procedure for the absolute quantification of A&#946;1-42 in human CSF based on solid-phase extraction and liquid chromatography tandem mass spectrometry is described.

A quantificação absoluta de Ap<sub&gt; 1-42</sub&gt; No CSF ​​Usando um Procedimento Referência medição de massa espectrométrica

Alzheimer's disease (AD) is the most common neurodegenerative disease among the elderly and accounts for 60-80% of all cases of dementia. Currently, the ...

Optimized LC-MS/MS Method for the High-throughput Analysis of Clinical Samples of Ivacaftor, Its Major Metabolites, and Lumacaftor in Biological Fluids of Cystic Fibrosis Patients

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening pulmonary manifestations. Ivacaftor (IVA) and ivacaftor-lumacaftor (LUMA) combination are two new breakthrough CF drugs that directly modulate the activity and trafficking of the defective CFTR-protein. However, there is still a dearth of understanding on pharmacokinetic/pharmacodynamic parameters and the pharmacology of ivacaftor and lumacaftor. The HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of the concentrations of ivacaftor, hydroxymethyl-ivacaftor, ivacaftor-carboxylate, and lumacaftor in biological fluids in patients receiving standard ivacaftor or ivacaftor-lumacaftor combination therapy has previously been developed by our group and partially validated to FDA standards. However, to allow the high-throughput analysis of a larger number of patient samples, our group has optimized the reported method through the use of a smaller pore size reverse-phase chromatography column (2.6 &#181;m, C8 100 &#197;; 50 x 2.1 mm) and a gradient solvent system (0-1 min: 40% B; 1-2 min: 40-70% B; 2-2.7 min: held at 70% B; 2.7-2.8 min: 70-90% B; 2.8-4.0 min: 90% B washing; 4.0-4.1 min: 90-40% B; 4.1-6.0 min: held at 40% B) instead of an isocratic elution. The goal of this study was to reduce the HPLC-MS analysis time per sample dramatically from ~15 min to only 6 min per sample, which is essential for the analysis of a large amount of patient samples. This expedient method will be of considerable utility for studies into the exposure-response relationships of these breakthrough CF drugs.

Ivacaftor and ivacaftor-lumacaftor combination are two new CF drugs. However, there is still a dearth of understanding on their PK/PD and pharmacology. We present an optimized HPLC-MS technique for the simultaneous analysis of ivacaftor and its major metabolites, and lumacaftor.

Método otimizado de LC-MS/MS para a análise do elevado-throughput de amostras clínicas de Ivacaftor, seus principais metabolitos e Lumacaftor em fluidos biológicos de pacientes de fibrose cística

Defects in the cystic fibrosis trans-membrane conductance regulator (CFTR) are the cause of cystic fibrosis (CF), a disease with life-threatening ...

A Chronic Cardiac Ischemia Model in Swine Using an Ameroid Constrictor

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but regardless of the approach, an in vivo model is needed to test each treatment. The pig is one of the most used large animal models for cardiovascular disease. Its heart is very similar in anatomy and function to that of a human. The ameroid placement technique creates an ischemic area of the heart, which has many useful applications in studying myocardial infarction. This model has been used for surgical research, pharmaceutical studies, imaging techniques, and cell therapies.
There are several ways of inducing an ischemic area in the heart. Each has its advantages and disadvantages, but the placement of an ameroid constrictor remains the most widely used technique. The main advantages to using the ameroid are its prevalence in existing research, its availability in various sizes to accommodate the anatomy and size of the vessel to be constricted, the surgery is a relatively simple procedure, and the post-operative monitoring is minimal, since there are no external devices to maintain. This paper provides a detailed overview of the proper technique for the placement of the ameroid constrictor.

The purpose of this protocol is to demonstrate the placement of a delayed constricting device (an ameroid constrictor) around a coronary artery in a swine model. This device creates an ischemic area of the heart that is useful for studying new diagnostic imaging techniques and new methods of treatment.

Um modelo de isquemia cardíaca crônica em suínos, usando um Ameroid Constrictor

Cardiovascular disease remains the number one cause of mortality in the United States. There are numerous approaches to treating these diseases, but ...

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

Melhor método para o estabelecimento de uma In Vitro barreira hemato - encefálica modelo baseado em células endoteliais do cérebro de suínos

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

Blood Collection Through Subclavian Vein Puncture in Mice

The mouse is the foremost mammalian model for studying human disease and human health. However, blood sample collection from mice is challenging in research work. Tail blood collection is a popular method when a small amount of blood sample is needed. Orbital artery could be considered if a large amount of blood is needed but this blood collection method has ethical issues. Formerly, we demonstrated the feasibility and safety of blood sample collection through subclavian vein puncture in rats, and here we investigate whether this method could be used in mice. We report that this method is safe and practical for blood collection in mice. Blood collection through the subclavian vein puncture in mice can be a convenient method in daily research works.

Here, we present a protocol to take blood samples from the subclavian vein of mice.

Coleta de sangue por punção da veia subclávia em camundongos

The mouse is the foremost mammalian model for studying human disease and human health. However, blood sample collection from mice is challenging in ...

Evaluation of Cerebral Blood Flow Autoregulation in the Rat Using Laser Doppler Flowmetry

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained using laser Doppler flowmetry (LDF). This paper demonstrates a closed skull preparation that allows cerebral blood flow to be assessed without penetrating the skull or installing a chamber or cerebral window. To evaluate autoregulatory mechanisms, a model of controlled blood pressure reduction via graded hemorrhage can be utilized while simultaneously employing LDF. This enables the real time tracking of the relative changes in the blood flow in response to reductions in arterial blood pressure produced by the withdrawal of circulating blood volume. This paradigm is a valuable approach to study cerebral blood flow autoregulation during reductions in arterial blood pressure and, with minor modifications in the protocol, is also valuable as an experimental model of hemorrhagic shock. In addition to evaluating autoregulatory responses, LDF can be used to monitor the cortical blood flow when investigating metabolic, myogenic, endothelial, humoral, or neural mechanisms that regulate cerebral blood flow and the impact of various experimental interventions and pathological conditions on cerebral blood flow.

This article demonstrates the use of laser Doppler flowmetry to evaluate the ability of the cerebral circulation to autoregulate its blood flow during reductions in arterial blood pressure.

Avaliação da autoregulação do fluxo sanguíneo cerebral no rato usando fluimetria de laser

When investigating the body&#39;s mechanisms for regulating cerebral blood flow, a relative measurement of microcirculatory blood flow can be obtained ...

Validated LC-MS/MS Panel for Quantifying 11 Drug-Resistant TB Medications in Small Hair Samples

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. Plasma drug levels are the current gold standard assessment, but require phlebotomy and a cold chain, and capture only very recent adherence. Our method uses hair, a matrix that is easily collected and reflective of long-term adherence, to test for 11 anti-TB medications. Previous work by our group shows that antiretroviral drug levels in hair are associated with HIV outcomes. Our method for DR-TB drugs uses 2 mg of hair (3 cm proximal to the root), which is pulverized and extracted in methanol. Samples are analyzed with a single LC-MS/MS method, quantifying 11 drugs in a 16 min run. Lower limits of quantification (LLOQs) for the 11 drugs range from 0.01 ng/mg to 1 ng/mg. Drug presence is confirmed by comparing ratios of two mass spectrometry transitions. Samples are quantified using the area ratio of the drug to the deuterated, 15N-, or 13C-labeled drug isotopologue. We used a calibration curve ranging from 0.001-100 ng/mg. Application of the method to a convenience sample of hair samples collected from DR-TB patients on directly observed therapy (DOT) indicated drug levels in hair within the linear dynamic range of nine of the eleven drugs (isoniazid, pyrazinamide, ethambutol, linezolid, levofloxacin, moxifloxacin, clofazimine, bedaquiline, pretomanid). No patient was on prothionamide, and the measured levels for ethionamide were close to its LLOQ (with further work instead examining the suitability of ethionamide&#8217;s metabolite for monitoring exposure). In summary, we describe the development of a multi-analyte panel for DR-TB drugs in hair as a technique for therapeutic drug monitoring during drug-resistant TB treatment.

Current methods of analyzing patients&#8217; adherence to complex drug resistant-tuberculosis (DR-TB) regimens can be inaccurate and resource-intensive. Our method analyzes hair, an easily collected and stored matrix, for concentrations of 11 DR-TB medications. Using LC-MS/MS, we can determine sub-nanogram drug levels that can be utilized to better understand drug adherence.

Painel LC-MS/MS validado para quantificar 11 medicamentos resistentes a medicamentos para tuberculose em amostras de cabelos pequenos

Drug resistant-tuberculosis (DR-TB) is a growing public health threat, and assessment of therapeutic drug levels may have important clinical benefits. ...