The authors have nothing to disclose.

この研究は、医学のイラン大学（テヘラン、イラン）の倫理委員会によって承認された実験動物の管理と使用（NIH）のためのガイドに記載されたポリシーに準じて行きました。 1.動物、手術検体の準備注：3D共焦点顕微鏡分析のために、脳組織を準備します。 <ol><li>二つのグループに無作為に動物を分割：Aβ1-40 -injection（N = 8）、およびゲニステイン治療（N = 8）と、Aβ1-40 -injection。手術前に強制飼養1時間によってゲニステイン（例えばポリエトキシル化ヒマシ油等の車両に希釈した10mg / kgの）を管理。 </li><li>ケタミン（100mg / kg）およびキシラジン（10mg / kg）で動物を麻酔。つま先をつまん後引っ込め反射の欠如によって適切な麻酔を確認してください。乾燥を防ぐために、手術中に目に軟膏を使用してください。 </li><li>定位固定装置と剃りヘッドの動物を配置します。 IODの適用INE溶液を切開前頭皮をきれいにし、感染のリスクを減らすために、手術中に無菌手術部位を維持します。ラット脳アトラス8によれば、ブレグマ-3.5ミリ後方、正中線±2ミリメートル、横方向、および硬膜下の-2.8 mmに海馬におけるAβ1-40定位（4μl）を注入します。定位方法については、以前の出版物9を参照してください 。 </li><li>動物は動物の快適さを確保するために完全に意識されるまで術後観察/ケアを提供します。リカバリ中に暖かい動物を維持し、完全に回復するまで、他の動物とのケージにそれらを返しません。手術後、動物に感染の兆候に注意してください。 </li><li> 3週間手術後（150ミリグラム/ kg）をケタミンにより深く動物を麻酔。 0.1 M PBS（pH値= 7.4）中の4％パラホルムアルデヒドに続いて、0.9％の生理食塩水で動物を灌流することによってtranscardial固定を行い、その後、削除して、10で説明したように、&lt;脳を修正/ SUP&gt;。 </li><li> 4℃で2〜3日、4％パラホルムアルデヒドで脳をポスト修正。 </li><li>組織包埋装置を使用することにより、パラフィンブロック中の組織を埋め込み、それが正しい位置合わせまたは切片を妨げる可能性があるため、充填アンダーまたはオーバー充填カセットを避けます。パラフィンブロック中の組織の向きに注意してください。 注：ラット海馬は、例えば、大脳半球の後部に近接しています。したがって、組織は、脳の後部で開始を区画する方法に埋め込まれるべきです。目的の解剖学的構造に到達するためのガイドとしてPaxinosアトラス8を使用してください 。 </li><li>空気の動きがセクションの取り扱いが困難になることから離れて空気ドラフトや戸口からミクロトームを置きます。 </li><li>この深さは完全なアストロサイトのZスタック画像を生成するために必要なことのように厚さ≥20ミクロンでセクションを使用してください。彼らは望ましくない厚さを有することができるように熱電子に、最初のカップルのセクションを使用しないでくださいxpansion。 </li><li> （5±2 C、パラフィンの融解温度以下）だけで十分な長さのセクションを平坦化する温水の表面にセクションを配置します。 注：セクションの拡大にわたり構造の形態を乱すことができます。慎重にセクションを転送するために小さな絵筆を使用してください。各スライドの2〜3のセクションを収集します。 </li><li>ストア直立位置にあるラックにスライドし、いくつかの時間またはO / N 37℃でそれらが乾燥してみましょう。 </li></ol> 2.免疫組織化学<ol><li>キシレン、2×10分間で脱パラフィン切片、及びアルコール勾配（99.8％、95％、70％、10分毎）およびPBSを介して再水和します。 </li><li> 0.25％ウシ血清アルブミン（BSA）、0.25％トリトンX-100および3.5％正常血清（4℃でO / N）を含有するPBSで1,500：グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）に対する抗体でインキュベートし、1に希釈しました。 </li><li> 3×5分間PBS中でセクションを洗ってください。 </li><li>二次アルカリホスファターゼコンジュゲートantibodieでインキュベート1時間のためのS（1：PBSで希釈した100、21℃）。 </li><li> 3×5分間PBS中でセクションを洗ってください。 注：これは、バックグラウンド染色を最小限にするために、適切な二次抗体の後のセクションを洗浄することが重要です。 </li><li>液体パーマネントレッドクロモゲン（15〜20分）で暗闇の中でのセクションをインキュベートします。注：使用する前に解決策がない以上30分以上を準備します。 </li><li> 3×5分間PBS中でセクションを洗ってください。 </li><li>最後に、4-6ジアミジノ-2-フェニルと、核染色（DAPI; 1：PBSで希釈した500）の前にカバー・スリップします。顕微鏡の前に冷蔵庫24〜48時間でスライドを保管してください。 </li></ol> 3.共焦点顕微鏡注：定量的評価（下記参照）の場合は、エラーのリスクを減らすために枝を重複を最小限に抑えてはっきりと見えるDAPI染色核とアストロサイトを選択します。 Zスタック画像を生成することは時間がかかります。我慢して、処理中に停止しないでください。直立共焦点レーザー走査型顕微鏡は、Uでありますアストロサイトから3D画像を作成するためのsed。 <ol><li>顕微鏡ステージ上にスライドを入れて、63Xの目的を選択します。 </li><li>イメージングソフトウェアを開き、スタートシステムをクリックします。探しタブをクリックします。割り当てに移動し、適切な光を調整するために、GFPを選択します。 </li><li>光を反射するようにシャッターを開きます。シャッターの右側にリフレクターリボルバーを見つけて、アストロサイト（緑、赤または紫）によって反射されるべき色を選択します。赤色（FSet20 WF）は、ここで使用しました。 注：顕微鏡の接眼レンズに直接絵を集中することを忘れないでください。 </li><li>最適な焦点を見つけるために、すべての閉じをクリックして、画面モードで顕微鏡ピンを入れ、取得]タブをクリックします。 </li><li>取得]タブの下でスマートセットアップをクリックします。ウィンドウが開きます。リストから適切な蛍光団（現在のプロジェクトで、すなわち DAPIおよびAlexaフルーア555、）を選択します。色が自動的に選択されます。 </li><li>最良の信号をクリックして、[適用し、設定された露出をクリックしました;その後、コンピュータは自動的に露光パラメータを設定します。 </li><li>画像を最適化するために、チャンネル・ウィンドウに移動します。マーク解除トラック2は、トラック1を強調表示し、ライブをクリックしてください。必要に応じて画像の焦点を合わせます。 </li><li> Channelsウィンドウで次のキーを調整します。自動的にピンホールを最適化するために、1AUをクリックしてください。それ以外の場合は、共焦点画像を非最適になりますこの手順を実行することは非常に重要です。最高の強度（余分なノイズを低減するために800の下には、この設定を保持する）を持つようにゲインを調整します。最後に、2と3の間のデジタルゲインを設定します。 </li><li>マーク解除トラック1は、トラック2をクリックして、トラック2のためのステップ3.8を繰り返します。そして、ライブを停止します。 </li><li>取得モードのウィンドウに移動します。フレームサイズを最適化し、平均化することによって、画像を改善します。フレームサイズは、X * Yに移動して、1,024×1024を選択変更するには。良好な画像を作成するために遅い速度を選択してください。 </li><li>アベレージに移動し、数≥4を選択します。この平均値はな生産するために平均化されるスキャンの数を示します取得した画像を電子。今スナップボタンをクリックして、キャプチャされた2D画像を保存します。 </li><li> 3Dイメージングの場合は、Z-Stack]ウィンドウを開くには、原因となるスマートセットアップ下のZスタック項目をマークします。 </li><li>セルの深さ、すなわち 、zスタックのための最初と最後の位置を設定します。初のライブを​​クリックしてください。その後、Zスタックが開始する組織でアストロサイトの最上位の位置に集中する顕微鏡のフォーカス駆動を使用しています。設定された最初のをクリックします。その後、Zスタックのスキャンを停止する必要がある組織内のアストロサイトの最も低い位置まで焦点を当てます。最後に設定をクリックします。そして、ライブを停止します。 </li><li>間隔を選択します。 1.01μmのは、現在の研究で使用されています。間隔を選択するスライスの数を設定することが最適でクリックすることによって行うことができます。 </li><li>スタート実験をクリックします。スキャンが完了すると、画像を保存します。この画像は、以下のパラメータの測定に使用されます：アストロサイトの領土の表面積と体積、ブラジャーを含む全体のアストロサイトnches、細胞体および核。 </li><li>ステップ3.6から3.11に記載されているように10倍または20倍対物レンズを使用して二次元画像を取得します。この画像は、測定抗体の蛍光免疫反応性、及びアストロサイトの密度（個/1000μmで2）の強度のために使用することができます。 </li></ol> 4.星状細胞密度およびGFAP +蛍光強度<ol><li> 20X 2D画像を開きます。画像ウィンドウの左側にヒスト（Hisogram）をクリックします。 </li><li>アストロサイトの密度を計算するために、20Xの対物レンズの下に三つの連続視野を選択します。フィールドに支店を重ね、最小で明確なソーマを示すアストロサイトの数をカウントします。 </li><li>蛍光強度を定量化するために、画像ウィンドウのフッターに適切なツール（長方形や円）を選択し、測定のための領域を選択します。平均値と標準偏差は、画像の下に自動的に表示されます注意してください。 strの間の現在の研究では、0.7ミリメートル2矩形領域iatumと歯状回の内側ブレードを使用しました。 </li></ol> 5.星状細胞の分岐<ol><li>長さと分枝の総数を定量化するために、画像解析ソフトウェアで（20Xで取得）の3D画像を使用。選択されたアストロサイトの各枝の長さに沿って手動で線を引きます。そして、ラインの長さを測定するために特化された測定ツールを選択します。ブランチの数を定量化するために、マークされた項目の数をカウントするカウントツールを選択します。 </li></ol> 6.ボリュームと表面積注：3D画像解析ソフトウェアで手動で構造をマーキングは、フォーカスと訓練が必要です。実験を開始する前に、何回か練習。 <ol><li>アストロサイトの核、相馬、細胞体と領土の体積と表面積を定量化するために、このようなVolocity 6.1のように3次元画像解析ソフトに（ステップ3.1から3.16で取得された）3D画像を転送します。 </li><li>ソフトウェアを開き、新しいを作成します図書館。新しいライブラリの左側の灰色の列にすべての画像をドラッグします。そして、1 3D画像を選択します。右側には、異なる色の異なるチャネルがあります。興味のある一つのチャネルをオンにします。例えば、DAPI用の青のチャンネルは、核を測定するとき。最適なコントラストを得るために、手動で明るさを変更します。 </li><li> [ツール]メニューを選択し、ボリュームを作成し、Zスタック画像の中から、単一の3D画像を生成するために行きます。 [編集]メニューの[プロパティ]をクリックし、Xは、Y、Zの性質が提示されていることを確認してください。それ以外の場合は、3次元解析を行うことは不可能です。 </li><li>ツールバーのフリーハンドRIOツールアイコンをクリックします。アストロサイトの核の体積と表面積を測定するには、DAPIで標識された核の周りに線を引きます。 </li><li>アストロサイトの細胞体の体積と表面積を測定するには、枝を除く相馬の周りに線を引きます。 </li><li>全体アストロサイト（支店を含む細胞体）の体積および表面積を測定するには、次のソーマの周りに線を引きますすべての枝の表面。 </li><li>アストロサイトの領土の体積と表面積を評価するには、枝の先端との間に線を引きます。 注：押して、不要な図面を消去するには、キーボード上で削除します。 </li><li>測定プロトコルを作成するために、画像ウィンドウの上部にある測定のメニューをクリックします。さまざまなツールを含むウィンドウが開きます。 </li><li>ドラッグすると、ウィンドウ（ウィンドウ枠）の一番上にオブジェクトを検索します。人口1に名前を付け、関連する色を選択し、メジャーをクリックしてください。別のウィンドウが開きます。 </li><li>パラメータすなわち 、ボリュームまたは表面積を選択してください。 [OK]をクリックします。データがテーブルに表示されます。 </li><li>測定メニューのデータをクリックして保存し、測定項目を確認し選択します。 </li><li>開いたウィンドウから呼び出された新しい測定項目を選択します。次に、データに名前を付け、[OK]をクリックします。 </li><li>最後に、グラフパッドまたはプログラムをExcelなどの統計ソフトウェアにデータをエクスポートします。データを分析するためにt検定を使用し、2DグラムをプロットAPHS。 </li></ol>

<ol>
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この作品は、オスターゴットラントの州議会、（スウェーデン）と医学のイラン大学の細胞および分子研究センター（テヘラン、イラン）からの助成金によってサポートされていました。

現在のプロトコルでは、アストロサイトの形態と関連していた12異なるパラメータを評価するための3次元共焦点形態計測を用いました。この目的のために、Aβ1-40とラットの海馬組織-とまたは抗炎症剤としてのゲニステイン前処理なし誘発性アストログリオーシスは、使用されました。 3D画像と形態計測ソフトウェアを使用することにより、我々は、アストロサイトの形態...

健康な中枢神経系（CNS）において、星状細胞は、血流の調節、エネルギー代謝、シナプス機能と可塑性、および細胞外イオン及び神経伝達物質の恒常性1-3の重要な役割を果たしています。また、アストロサイトは肥大、増殖およびアストロサイト4,5の機能改造することを特徴とする反応性アストログリオーシスを介した別の有害な刺激や、外傷、感染症、虚血または神経変性などの異常な状態に応答します。 反応性アストログリオーシスは、組織に炎症反応と修復プロセスを設計することができ、したがって、治療的介入の臨床転帰に影響を与えることができます。したがって、アストロサイトは、CNSに影響する種々の疾患のための治療的介入のための潜在的なターゲットとして最後の十年の間に神経科学者から注目を集めています。 アストロサイトは、通常、よくdで星状の形状を有しますソーマ6の周囲に広がる枝をefined。脳内の病的状態では、アストロサイトの枝が複雑になり、アミロイドベータ（Aβ）の存在下で、例えば、腫れ終了7を示しています 。 この記事では、共焦点顕微鏡で取得したアストロサイトの3次元画像を解析するためのプロトコルを提示します。各アストロサイトのための12の異なる定量的パラメータを測定した：アストロサイトの領土（アストロサイトで覆われた組織）の表面積と体積を、セル全体、細胞体、および核（支店を含みます）;枝の長さの合計と数。星状細胞の検出のために使用した抗体の蛍光強度。そして、アストロサイトの密度（数/千μm2で）。この目的のために、我々は、抗炎症物質としてゲニステイン処理の有無にかかわらず、Aβ1-40の海馬内注入に暴露されたラットからの脳切片を用いました。記載されているプロトコルは、形態学的ANのために使用することができますインビトロまたはインビボでの異なる条件で異なる細胞型のalysis。

<table border="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amyloid beta 1-40</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>79793</td>
			<td>Keep in -70 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genistein</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>446-72-0</td>
			<td>keep in -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polycolonal rabbit antibodies against glial fibrillary acidic protein</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>Z0334</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkaline phosphate-conjugated swine anti-rabbit IgG antibodies</td>
			<td>DAKO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid Permanent Chromogen</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid permanent Red Substrate Buffer</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>K0640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cremophor EL</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>27963</td>
			<td>Polyethoxylated castor oil - Step 1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 700 Confocal Laser Scanning Microscopy</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity 6.3</td>
			<td>Perkin Elmer Inc.,</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Analysis 2000</td>
			<td>Tekno Optic</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streotaxic apparatus</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graph pad Prism 5</td>
			<td>Graph pad software Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocol for three-dimensional confocal morphometric analysis of astrocytes

脳内のグリア細胞のように、星状細胞は、中枢神経系における多様な機能的な役割を持っています。有害な刺激の存在下では、アストロサイトは、それらの機能的および構造的特性、反応性アストログリオーシスと呼ばれる状態を変更します。ここでは、星状細胞の形態学的特性の評価のためのプロトコルが提供されます。このプロトコルは、星状細胞（アストロサイト領土）で覆われた組織の表面積と体積、支店、細胞体、および核を含む全体のアストロサイトと同様に、枝の長さの合計と数、強度、すなわち12の異なるパラメータの定量化を含み星状細胞の検出のために使用した抗体の蛍光免疫反応性、及びアストロサイトの密度（個/1000μmで2）の。 Volocity 6.3測定のために使用されたように、この目的のために、三次元（3D）の共焦点顕微鏡画像を作成し、3D画像解析ソフトウェアかかるました。アミロイドベータ1-40に露出ラット脳組織</サブ&gt;（Aβ1-40）治療的介入は、方法を提示するために使用されたの有無にかかわらず。このプロトコルは、 インビボまたはインビトロの条件のいずれかでの他のセルの3次元形態計測分析のために使用することができます。

このセクションでは、3次元形態計測分析によって生成定性的および定量的な観測のいくつかの例を紹介します。前述した全12パラメータの完全な結果を得るために、私たちの以前の出版物10を参照してください 。 定性的観察アストロサイトは、Aβ1-40注射したラット（ 図1）で、通常の長さで細いまたは太い枝を示しまし?...

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Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

アストロサイトの三次元共焦点形態学的分析のためのプロトコル

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

protocol-for-three-dimensional-confocal-morphometric-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K ビュー.  Linköping University. Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

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Morphometric Analyses of Retinal Sections

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the retinal ganglion cell layer (RGCL) in rat models with N-methyl-D-aspartate (NMDA)&#x2013;induced excitotoxicity1, retinal ischemia-reperfusion injury2 and glaucoma3. Reduction of INL and inner plexiform layer (IPL) thicknesses were reversed with citicoline treatment in rats' eyes subjected to kainic acid-mediated glutamate excitotoxicity4. Alteration of RGC density and soma sizes were observed with different drug treatments in eyes with elevated intraocular pressure3,5,6. Therefore, having objective methods of analyzing the retinal morphometries may be of great significance in evaluating retinal pathologies and the effectiveness of therapeutic strategies.
The retinal structure is multi-layers and several different kinds of neurons exist in the retina. The morphometric parameters of retina such as cell number, cell size and thickness of different layers are more complex than the cell culture system. Early on, these parameters can be detected using other commercial imaging software. The values are normally of relative value, and changing to the precise value may need further accurate calculation. Also, the tracing of the cell size and morphology may not be accurate and sensitive enough for statistic analysis, especially in the chronic glaucoma model. The measurements used in this protocol provided a more precise and easy way. And the absolute length of the line and size of the cell can be reported directly and easy to be copied to other files. For example, we traced the margin of the inner and outer most nuclei in the INL and formed a line then using the software to draw a 90 degree angle to measure the thickness. While without the help of the software, the line maybe oblique and the changing of retinal thickness may not be repeatable among individual observers. In addition, the number and density of RGCs can also be quantified. This protocol successfully decreases the variability in quantitating features of the retina, increases the sensitivity in detecting minimal changes.
 	This video will demonstrate three types of morphometric analyses of the retinal sections. They include measuring the INL thickness, quantifying the number of RGCs and measuring the sizes of RGCs in absolute value. These three analyses are carried out with Stereo Investigator (MBF Bioscience &mdash; MicroBrightField, Inc.). The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

This video demonstrates three types of morphometric analyses of the retina, which include measuring the inner nuclear layer thickness, quantifying the number of retinal ganglion cells (RGCs) and measuring the sizes of RGCs. The technique can offer a simple but scientific platform for morphometric analyses.

網膜切片の形態学的解析

Morphometric analyses of retinal sections have been used in examining retinal diseases. For examples, neuronal cells were significantly lost in the ...

神経科学

Dissection and Culture of Mouse Dopaminergic and Striatal Explants in Three-Dimensional Collagen Matrix Assays

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. Reciprocally, medium spiny neurons in the striatum that give rise to the striatonigral (direct) pathway innervate the substantia nigra2. The development of these axon tracts is dependent upon the combinatorial actions of a plethora of axon growth and guidance cues including molecules that are released by neurites or by (intermediate) target regions3,4. These soluble factors can be studied in vitro by culturing mdDA and/or striatal explants in a collagen matrix which provides a three-dimensional substrate for the axons mimicking the extracellular environment. In addition, the collagen matrix allows for the formation of relatively stable gradients of proteins released by other explants or cells placed in the vicinity (e.g. see references 5 and 6). Here we describe methods for the purification of rat tail collagen, microdissection of dopaminergic and striatal explants, their culture in collagen gels and subsequent immunohistochemical and quantitative analysis. First, the brains of E14.5 mouse embryos are isolated and dopaminergic and striatal explants are microdissected. These explants are then (co)cultured in collagen gels on coverslips for 48 to 72 hours in vitro. Subsequently, axonal projections are visualized using neuronal markers (e.g. tyrosine hydroxylase, DARPP32, or &beta;III tubulin) and axon growth and attractive or repulsive axon responses are quantified. This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of mesostriatal and striatonigral axon growth and guidance during development. Using this assay, it is also possible to assess other (intermediate) targets for dopaminergic and striatal axons or to test specific molecular cues.

Explants from the midbrain dopamine system and striatum are used in a collagen matrix assay for the in vitro analysis of mesostriatal and striatonigral pathway development. In this assay axonal outgrowth and guidance can be manipulated and quantified. It can also be modified for assessing other regions or molecular cues.

三次元コラーゲンマトリックスアッセイにおけるマウスのドーパミンと線条体片の解剖と文化

Midbrain dopamine (mdDA) neurons project via the medial forebrain bundle towards several areas in the telencephalon, including the striatum1. ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Three-dimensional Confocal Analysis of Microglia/macrophage Markers of Polarization in Experimental Brain Injury

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that include expression of novel surface antigens and production of mediators that build up and maintain the inflammatory response. Emerging evidence indicates that M/M are highly plastic cells that can assume classic pro-inflammatory (M1) or alternative anti-inflammatory (M2) activation after acute brain injury. However a complete characterization of M/M phenotype marker expression, their colocalization and temporal evolution in the injured brain is still missing.	
	Immunofluorescence protocols specifically staining relevant markers of M/M activation can be performed in the ischemic brain. Here we present immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis as a powerful approach to investigate the pattern of localization and co-expression of M/M phenotype markers such as CD11b, CD68, Ym1, in mouse model of focal ischemia induced by permanent occlusion of the middle cerebral artery (pMCAO). Two-dimensional analysis of the stained area reveals that each marker is associated to a defined M/M morphology and has a given localization in the ischemic lesion. Patterns of M/M phenotype marker co-expression can be assessed by three-dimensional confocal imaging in the ischemic area. Images can be acquired over a defined volume (10 &mu;m z-axis and a 0.23 &mu;m step size, corresponding to a 180 x 135 x 10 &mu;m volume) with a sequential scanning mode to minimize bleed-through effects and avoid wavelength overlapping. Images are then processed to obtain three-dimensional renderings by means of Imaris software. Solid view of three dimensional renderings allows the definition of marker expression in clusters of cells. We show that M/M have the ability to differentiate towards a multitude of phenotypes, depending on the location in the lesion site and time after injury.

A way to gain new insights into the complexity of the brain inflammatory response is presented. We describe immunofluorescence-based protocols followed by three-dimensional confocal analysis to investigate the pattern of co-expression of microglia/macrophage phenotype markers in a mouse model of focal ischemia.

実験的脳損傷における偏光のミクログリア/マクロファージマーカーの三次元共焦点解析

After brain stroke microglia/macrophages (M/M) undergo  rapid activation with dramatic morphological and phenotypic changes that  include expression of ...

Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure consistent scoring between scorers. This protocol builds off of a need that has arisen from the last two decades of taste research using FP as a proxy for taste pore density. FP density has historically been analyzed using Miller &#38; Reedy&#8217;s 1990 characterizations of their morphology: round, stained lighter, large, and elevated. In this work, the authors forewarned that stricter definitions of FP morphology needed to be outlined. Despite this call to action, follow up literature has been scarce, with most studies continuing to cite Miller &#38; Reedy&#8217;s original work. Consequently, FP density reports have been highly variable and, combined with small sample sizes, may contribute to the discrepant conclusions on the role of FP in taste sensitivity. The Genetics of Taste Lab explored this apparent inconsistency in counting and found that scorers were individually prioritizing the importance of these characteristics differently and had no guidance for when a papilla had some, but not all, of the reported qualities of FP. The result of this subjectivity is highly variable FP counts of the same tongue image. The Denver Papillae Protocol has been developed to remedy this consequence through use of a dichotomous key that further defines and prioritizes the importance of the characteristics put forth by Miller &#38; Reedy. The proposed method could help create a standard way to quantify FP for researchers in the field of taste and nutritional studies.

Here we present a protocol to measure fungiform papilla density from digital photographs. This method builds prioritization and objective characteristic metrics into the original descriptive work on fungiform papillae by Miller &#38; Reedy (1990).

茸乳頭の客観的な分析のためのデンバー乳頭プロトコル

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

三次元画像と人間の表皮内神経線維内のミトコンドリアの解析

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like mouse and rat astrocyte monocultures: Brain cells can be isolated from different brain regions, and after a week of cell culture, non-astrocytic cells are shaken off by placing the culture dishes on a shaker for 6 h in the incubator. The remaining astrocytes are then passaged into new plates with an astrocyte-specific medium (termed NB+H). NB+H contains low concentrations of heparin-binding EGF-like growth factor (HBEGF), which is used in place of serum in medium. After growing in NB+H, AWESAM astrocytes have a stellate morphology and feature fine processes. Moreover, these astrocytes have more in vivo-like gene expression than astrocytes generated by previously published methods. Ca2+ imaging, vesicle dynamics, and other events close to the membrane can thus be studied in the fine astrocytic processes in vitro, e.g., using live cell confocal or TIRF microscopy. Notably, AWESAM astrocytes also exhibit spontaneous Ca2+ signaling similar to astrocytes in vivo.

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

The AWESAM protocol described here is optimal for culturing murine astrocytes in isolation from other brain cells in a fast, simple, and inexpensive manner. AWESAM astrocytes exhibit spontaneous Ca2+ signaling, morphology, and gene expression profiles similar to astrocytes in vivo.

生体内培養-高速、シンプルで、安価な AWESAM プロトコルを使用してマウスのアストロ サイトのように

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

マウス大脳皮質における細胞組織の大規模三次元イメージング

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Three-Dimensional Shape Modeling and Analysis of Brain Structures

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. We have developed a software package for accurate and robust shape modeling and group-wise analysis. Here, we introduce an pipeline for the shape analysis, from individual 3D shape modeling to quantitative group shape analysis. We also describe the pre-processing and segmentation steps using open software packages. This practical guide would help researchers save time and effort in 3D shape analysis on brain structures.

We introduce a semi-automatic protocol for shape analysis on brain structures, including image segmentation using open software, and further group-wise shape analysis using an automated modeling package. Here, we demonstrate each step of the 3D shape analysis protocol with hippocampal segmentation from brain MR images.

脳構造の3次元形状モデリングと解析

Statistical shape analysis of brain structures has been used to investigate the association between their structural changes and pathological processes. ...

Preparation of Newborn Rat Brain Tissue for Ultrastructural Morphometric Analysis of Synaptic Vesicle Distribution at Nerve Terminals

Our laboratory and many others have exploited the high resolving power of transmission electron microscopy to study the morphology and spatial organization of synaptic vesicles. In order to obtain high-quality electron micrographs that can yield the degree of morphological detail necessary for quantitative analysis of pre-synaptic vesicle distribution, optimal specimen preparation is critical. Chemical fixation is the first step in the process of specimen preparation, and of utmost importance to preserve fine ultrastructure. Vascular fixation with a glutaraldehyde-formaldehyde solution, followed by treatment of vibratome-sectioned specimens with osmium tetroxide, stabilizes the maximum number of molecules, especially proteins and lipids, and results in superior conservation of ultrastructure. Tissue is then processed with counterstaining, sequential dehydration and resin-embedding. En bloc staining with uranyl acetate (i.e., staining of vibratome-sectioned tissue before resin embedding) enhances endogenous contrast and stabilizes cell components against extraction during specimen processing. Contrast can be further increased by applying uranyl acetate as a post-stain on ultrathin sections. Double-staining of ultrathin sections with lead citrate after uranyl acetate treatment also improves image resolution, by intensifying electron-opacity of nucleic acid-containing structures through selective binding of lead to uranyl acetate. Transmission electron microscopy is a powerful tool for characterization of the morphological details of synaptic vesicles and quantification of their size and spatial organization in the terminal bouton. However, because it uses fixed tissue, transmission electron microscopy can only provide indirect information regarding living or evolving processes. Therefore, other techniques should be considered when the main objective is to study dynamic or functional aspects of synaptic vesicle trafficking and exocytosis.

We describe procedures for processing newborn rat brain tissue to obtain high-resolution electron micrographs for morphometric analysis of synaptic vesicle distribution at nerve terminals. The micrographs obtained with these methods can also be used to study the morphology of a number of other cellular components and their dimensional structural relationships.