著者は彼らの助け無菌手続きの下で子宮内エレクトロポレーションで実行するために、図面を準備する彼女の助けのためにヘイリー·ウッド博士のキャスリーン·マザーズ博士ジャン·フィリップ·Mocho博士ヨランダサアベドラ·トーレスに感謝します。 EPは、エリザベス·フィッシャーとビクターTybulewiczにウェルカムトラスト助成により、欧州の生化学的社会の長期的な連合（FEBS）の交わりと医学研究評議会（MRC）キャリア開発のフェローシップ、MAH（080174/B/06/Z）によってサポートされていました、HW EMBO長期的な親睦とRAによるMRCの学生の身分で。この作品は、ウェルカム·トラスト（086947/Z/08/Z）からプロジェクトの助成金によってとFGの医学研究評議会（U117570528）からの補助金によってサポートされていました

イギリスでは、マウスは、飼育繁殖、動物（科学的手続）法1986の下に内務省によって承認されたガイドラインに従って扱われます。 1。準備：DNA溶液と針<ol><li>エンドトキシンフリーマキシプレップキットでプラスミドDNAを精製する。水の中で所望の濃度まで注射用プラスミドDNA溶液を調製し、注射を可視化する（0.05％の最終濃度）ファストグリーンを追加します。エレクトロポレーションの効率はDNA濃度に大きく依存しています。は1μg/μlの濃度は、一般的に使用されています。この濃度は、その開発に影響を与えずに、エレクトロポレーションのニューロンを可視化するのに十分である。しかし、プラスミドベクターと同様のサイズと（サイトメガロウイルスプロモーター/エンハンサー、サイトメガロウイルス即時型初期エンハンサーおよびニワトリβ-アクチンプロモーターの融合（CAG）のプロモーターとの強力な発現レベルの低い発現レベル）で使用されるプロモーターによると<html>発現タンパク質の安定性は、この濃度は（0.25μg/μLのにを5μg/μl）を調整することができます。 </li><li>マイクロピペットプラーを用いて、ガラス針を引き抜きます。 </li></ol> 2。手術の準備<ol><li>手術器具をオートクレーブとリン酸緩衝生理食塩水（PBS）。 </li><li> PBS（ブプレノルフィン、30μg/ mlのVetergesic、最終濃度）に鎮痛剤溶液を調製します。妊娠マウスの重量を量ると、少なくとも30分手術前Vetergesicの皮下に0.1 mg / kgを注入します。この時間の間に、外科領域を準備します。加熱パッドおよび回復室の電源をオンにします。温水浴および滅菌ドレープ上のすべての滅菌器具および材料の滅菌したPBSを配置します。 PBSを入れたビーカーに白金電極を配置して、エレクトロに接続します。 microloaderチップを用いてDNA溶液を用いて針を入れ、キャピラリーホルダーに針を接続し、鉗子で針の先端をつまむ。 </li></ol>DNA注入とエレクトロポレーションする前にe_title &quot;&gt; 3。手術<ol><li>麻酔誘導チャンバーを用いて酸素キャリア（酸素2リットル/分）でイソフルランを妊娠マウス（E14.5-E15.5）をAnaesthetize。動物は正向反射失うまで待ちます。 </li><li> &quot;手術前&quot;マスクに動物を転送します。母親は全身麻酔下にありながら、目の角膜潰瘍を防ぐために、それぞれの目に目ゲルのドロップを配置します。腹部の毛を剃るように電気かみそりを使用しています。飛行の髪を収集するためにclorhexidineで一度剃っエリアを清掃します。 </li><li>外科領域における第二のマスクに動物を転送します。加熱パッド上で、その背にマウスを置きます。ペダル反射が失われた外科手術を開始します。 </li><li>マスクと滅菌手袋を着用してください。剃毛され、駆除されていない皮膚の領域によって汚染される組織や楽器を防ぐために滅菌ドレープ（腹部の上に小さな穴を持つ）で動物をカバーしています。剃毛面積をきれいに少なくともトンclorhexidineで3回。別の滅菌綿棒を毎回使用しています。皮膚を通して正中線（約1インチの長さ）に沿って垂直に切開を作るためにメスを使用しています。はさみを使用して、白線（ホワイトラインは、コラーゲン結合組織の大部分で構成）に沿って腹部の筋肉と同様の切開を行います。 </li><li>最もアクセスしやすい胚を選択し、2胚の間にリング鉗子を配置し、慎重に腹腔内の胚チェーンを引き出します。この点からは、滅菌予め温めておいたPBSで胚が水和保つ。 </li></ol>ない顕微鏡は可視化は必要ありません。 4。 DNAとエレクトロの注入<ol><li>それは容易に胚をエレクトロポレーションしたかを追跡するために行う、最も外側の胚のいずれかを使用して起動します。これは出血のリスクを増加させるとして、胚にあまり引っ張らないでください。リング鉗子を用いて羊膜嚢内の胚の位置を操作し、リング間の胚の頭部を安定させます。子宮壁に近い胚を押し上げるように優しく絞る。 </li><li>もう一方の手で、キャピラリーホルダーを取り、側脳室を対象とする半球の中央に慎重に針を挿入します。ファストグリーン（樹状突起を研究するために以下を1μl）と混合したDNA溶液の約1μlを注入するためにペダルを押してください。あなたが側脳室を埋める緑の色素を観察する必要があります。重要なステップ： - 針の鋭さが適切に子宮壁を貫くことが重要です。穴の拡大は、羊水や胎児死亡の漏れになりますので、それは子宮壁の表面と心室に挿入した後、針の動きを最小限に抑えることが重要です。これは出血と胎児死亡になりますように、子宮壁に刺す血管を避けてください。 - それが誘発されるので、側脳室へのDNAの大きすぎる音量を注入しないことが重要です水頭症（E14.5で2μlを超えない）。 DNAの量は実験の目的に応じて調整されます。 1μlのは一般的にほとんどの実験に使用されている場合は、DNA（約0.5μL）の小さいボリュームが樹状突起と脊椎分析のために必要となります。確かにいくつかの単離された細胞は、エレクトロポレーション、ニューロンの樹状東屋を視覚化し、測定するために対象とする必要があります。 </li><li>皮質のエレクトロポレーションのために注入された心室、または海馬のエレクトロポレーションのために注入された心室（ 図2）の反対側の同じ側にあるプラス（+）パドルで胚の頭部の両側に電極を配置します。その後1秒間隔で5〜30V電気パルス（50ミリ秒の期間）を適用します。重要なステップ：これは胚の死になりますように胎盤を通過電流を印加することは避けてください。 妊娠マウスのすべての胚は、任意の混乱を避けるために構築する通常は同じDNAを用いて、エレクトロポレーションすることができます。しかし、長い手術の減少<html>胚の生存率はS。腹腔内は30分以上開かないでください。 </li></ol> 5。手術後、エレクトロポレーション<ol><li>胚をelectroporatingした後、腹腔内にPBSを追加し、元の場所に子宮角を置き換えるためにリングピンセットを使用しています。 Vicryl吸収性縫合糸と腹壁と皮膚を縫合。 </li><li>それは加熱パッド上に置かケージで転送してウェイクアップ（通常は5〜10分）となるまで回復室に動物を配置します。 </li></ol> 6。術後痛み、苦しみまたは苦痛を評価し、手術後の動物の24時間および48時間の重量を量るためにマウスの動作を確認してください。必要に応じて、鎮痛剤は痛みや不快感を最小限に抑えるために投与することができる。 7。組織の処理実験に必要な胚又は出生後の段階でエレクトロポレーション胚または子犬を収集します。 ove_content &quot;&gt; - 分析のための胚の段階で（細胞増殖または移行を検討するなど）： 頸椎脱臼を介して母親を安楽死させると胚を収集します。断頭した後、蛍光双眼鏡を使って頭蓋骨を越えて視覚化し、蛍光シグナルの量と位置によって示されるように適切に、エレクトロポレーションされた頭脳を選択します。頭蓋骨の脳を解剖し、20％スクロース/ PBSで一晩4％PFAで一晩固定し、その後場所。 OCTコンパウンド、-80°Cとクライオスタットを用いてセクションを凍結に埋め込むことができます。 - 生後段階（例えば、樹状突起と棘を勉強するため）での解析の場合： ペントバルビタールの腹腔内注射（40-60 mg / kg体重）で仔や成体マウスを麻酔し、PBS中4％PFAに続いてPBSでtranscardial灌流を行います。一晩4％PFAで頭蓋骨とポストフィックスの脳を解剖する。ビブラトーム（dは100μm以下のセクションを使用して、PBS、セクション脳内洗浄した後endrite分析）。画像の樹状突起と棘に0.16〜0.19ミリメートル厚いカバーガラスを使用して、アクアポリ/マウントのセクションをマウントします。 8。代表的な結果 図3は、CA1（図3C、D）および海馬の歯状回（ 図3E、F）で、大脳皮質（ 図3A、B）にエレクトロポレーションした細胞の例を示します。野生型マウスにGFPコンストラクト（PCA-B-EGFPm5サイレンサー3）脳の生後日（P）14で収穫されたとE14.5に電気穿孔した。 DNA溶液の少量（1μg/μLので溶液0.5μl以下）を注入することによって、いくつかの細胞は、単離されたGFP +細胞（ 図3）だけでなく、その棘の樹状突起分枝の可視化を可能にする、ラベルが付いています高倍率（ 図4）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig1.jpg" /> &lt;強い&gt;図1樹状突起と棘を研究するために使用することができるエレクトロポレーション·プロトコルの模式図。 （A）GFPのエレクトロポレーションは、野生型と変異型マウスでは樹状突起と棘を比較するために構築します。 （B）GFP-shRNAのエレクトロポレーション（GFPは、同じコンストラクトから発現されています）shRNAは、関心のある遺伝子（X）またはコントロールshRNAのための特定のコンストラクトでエレクトロマウスでは樹状突起と棘を比較することができます。 （C）IUEは、望ましい期間にshRNAの発現を制限するためにCreリコンビナーゼを誘導系と一緒に使用することができます。この実験では、4 -ヒドロキシ（CAG-ER T2 CreER T2;は1μg/μl）をしてアクティブにすることができますCreリコンビナーゼのフォーム発現ベクター10は 、依存性のCreリコンビナーゼに特異的なshRNAを発現するベクターと一緒にエレクトロポレーションされてい方法（1μg/μLの、および組換えインジケータ付き（CALNL-GFPコンストラクト、CreリコンビナーゼによりGFPの発現誘導;は1μg/μl）を10 efficienノックダウンのCYはshRNAの濃度を増加させると同様にCAG-ER T2 CreER T2濃度を増加させることによって改善することができます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig2.jpg" /> 図2エレクトロポレーションの空間を制御します。この図は、大脳皮質や海馬をターゲットにするためにDNAの注射部位に応じてパドル電極を配置する場所を示します。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig3.jpg" /> 図3 子宮内での樹状東屋の可視化は、大脳皮質や海馬で細胞をエレクトロポレーション。 （A、B）GFP +大脳皮質の錐体細胞（CD）錐体、海馬のCA1の細胞と（E、F）、P14における海馬歯状回の顆粒細胞を示す冠状断面。 GFPコンストラクト（PCA-B-EGFPm5サイレンサー3）は14.5日でエレクトロポレートした。高倍率の画像（B、​​D、F）はIUEは、樹状突起を可視化する効率的な方法であることを示している。スケールバーは50μm（B、DおよびF）、150μmの（A、C、E）を表します。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig4.jpg" /> 図4構築物を発現しているGFPでE14.5で子宮内エレクトロポレーションしたP14神経細胞における樹状突起棘の可視化。 （A、B）海馬錐体ニューロンの基底樹状突起から棘の高倍率画像。スケールバーは5μm（）と2μmの（B）を表します。

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	<li>Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Molecular+Approach+of+in+utero+Electroporation+to+Functionally+Decipher+Endophenotypes+in+Neurodevelopmental+Disorders.">Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders.</a> Front Mol. Neurosci. 4, 37 (2011).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. 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Growth Differ. 50, 499-506 (2008).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation.">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 507-511 (2008).</li><li>Castro, D. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. L. o. n. g. -. t. e. r. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=selective+gene+expression+in+developing+and+adult+hippocampal+pyramidal+neurons+using+focal+in+utero+electroporation.">selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation.</a> J. 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利害の衝突が宣言されません。

IUEは、スペースでなく、時間だけでなく、遺伝子発現を操作するための強力なツールです。我々は、この技術は、マウスの大脳皮質と海馬の樹状突起と棘を視覚化し、遺伝的に操作するために使用することができますここで表示されます。以前に引用した利点に加え、それはIUEは、メソッドがゴルジ体へとは対照的に、免疫組織化学、あるいは表現型エレクトロポレーションした細胞を例にすることができsituハイブリダイゼーションにおいて結合することができますことは注目に値する。このプロシージャは、その相対的侵襲性にもかかわらず、明らかな脳の奇形を誘発しないことについて言及することも重要です。さらに、細胞レベルでは、IUEは、エレクトロポレーションのニューロン13の電気生理学的特性を変更しません。私たちのデモでは、樹状突起とスパイン形態の可視化に焦点を当てているが、E14.5における皮質または海馬ニューロンのIUEはまた、軸索形成およびガイダンスのような他の発達イベントを研究するために使用される可能性があります。追加でition、プロトコルの同じ種類の異なる集団を対象とする胚発生の他の段階で実装することができます。たとえば、E18.5で発達が非常に遅く皮質のエレクトロポレーションのパラダイムは、アストロサイト前駆細胞が1で発現を駆動するために実行することができます。同様に、E14.5における海馬のエレクトロポレーションが同時にCA1-CA3錐体細胞の前駆細胞および歯状回顆粒細胞の前駆細胞を標的とすることができますが、後半に海馬のエレクトロポレーション（E18.5または出生後早期）が別の歯状回顆粒をターゲットにできるようになる前駆細胞14。このケースでは、DNAの注入量は、電流の強さと同様に増加することができます。 IUEによって導入された導入遺伝子はエピソームのままのように見えるため、連続する細胞分裂後の細胞から失われています。このようなニューロンとして分裂細胞では、しかし、エピソームの導入遺伝子は、エレクトロポレーションは、長期試験13を許した後、月間アクティブのまま、15。私たちの研究では、胚の初期の発達時点アップから導入遺伝子の持続的な式でIUE結果を用いて皮質または海馬の神経前駆細胞を標的とすることを示す（ここでは分析した最新の時点）、出生後7週間に明るいGFP +細胞を観察した成人期へ。 技術の電流制限は、エレクトロポレーションした細胞の総数を細かく制御を行使することは困難であるということです。しかし、DNA溶液の注入量を減少させることによって、我々は、少数の細胞を標識するために、孤立したGFP +細胞だけでなく、その棘の樹状突起分枝を可視化することが可能であることが示されている。トランスフェクトされた領域の寸法は、また、電流とパルス数またはエレクトロポレーションパドル径の強度としてエレクトロポレーションのパラメータを変更して調整することができます。 完全にIUEは、迅速、簡単に実装できる方式であるとin vivoでの樹状突起と棘を学ぶことが効率的です。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> 注射用の針とDNA溶液の調製 </td></tr><tr><td> Endofreeプラスミドマキシキット</td><td>キアゲン</td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td>速いグリーン</td><td>シグマ</td><td> F-7258 </td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス毛細管 1.0ミリメートルOD×0.58 mm内径</td><td>ハーバード装置</td><td> 30から0016 </td><td></td></tr><tr><td> Microloaderヒント</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5242956003 </td><td>エッペンドルフピペットで0.5μL、10μL/ 2から20μL </td></tr><tr><td></td><td></td><td> ＆n個のBSPは、 </td><td> 手術のための材料 </td></tr><tr><td>余分な薄いアイリスはさみ</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 14088から10 </td><td></td></tr><tr><td>湾曲した鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 91197から00 </td><td></td></tr><tr><td>リング鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11103から09 </td><td></td></tr><tr><td>ニードルホルダー</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 12002から12 </td><td></td></tr><tr><td>グレーフェ鉗子</td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11050から10 </td><td></td></tr><tr><td> Vicryl吸収性縫合糸</td><td>エチコン社（ジョンソン·エンド·ジョンソン） </td><td> W9074 </td><td></td></tr><tr><td>滅菌ドレープ30センチメートルX 45センチメートル</td><td>バスター</td><td> 141765 </td><td></td></tr><tr><td>滅菌綿棒</td><td> Shermond </td><td> HUBY-340 </TD&gt; <td></td></tr><tr><td>綿の芽</td><td>クリーンクロス（株） </td><td> 1860 </td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン（Vetergesic） </td><td> Alstoeアニマルヘルス</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clorhexidine </td><td> Vetasept </td><td> XHG007 </td><td></td></tr><tr><td>アイゲルViscotears </td><td>ノバルティス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルレン</td><td>アボット·ラボラトリーズ</td><td> B506 </td><td></td></tr><tr><td> Pentoject、ペントバルビタールナトリウム20パーセント</td><td> Animalcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> エレクトロポレーション </td></tr><tr><td>エレクトロ</td><td> BTX </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td>プラチナTweezertrod5ミリメートルの電子</td><td> BTX、ハーバード装置</td><td> 45から0489 </td><td></td></tr><tr><td> Femtojetインジェクター</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5247000030 </td><td></td></tr><tr><td> Femtojetマイクロインジェクター用フットコントロール</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5247623002 </td><td></td></tr><tr><td>キャピラリーホルダー</td><td>エッペンドルフ</td><td> 5176190002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 組織の処理 </td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>シグマ</td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td> VWR（Prolabo） </td><td> 27480.294 </td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td> ThermoScientific（メンツェル·グレイザー） </td><td> J1800AMN​​Z </td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>メンツェル·グレイザー</td><td></td><td> 22×50ミリメートル＃1,5 </td></tr><tr><td>アクアポリ/マウント</td><td>ポリサイエン株式会社</td><td> 18606 </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation

子宮内エレクトロポレーション（IUE）胚の神経系1-5の異なった地域の発展を研究するための強力な手法となっています。このツールは広く細胞増殖、分化、特に大脳皮質6-8の神経細胞移動の調節を研究するために使用された日付ます。ここでは詳細私たちのプロトコルを子宮内で大脳皮質および海馬をエレクトロポ、このアプローチは、これら二つの脳領域における樹状突起と棘を研究するために使用することができる証拠を提供する。 初代培養の神経細胞の可視化と操作は、樹状突起、スパインとシナプスの開発に関与するプロセスの理解に貢献しています。しかし、in vitroで成長してニューロンが正常な発達中の樹状突起および/または脊椎の形成と維持に影響を与える可能性がすべての生理的な手がかりには公開されません。樹状突起と脊椎の構造の知識<e野生型または変異マウスにおけるin vivoでm&gt;は、ゴルジ-コックス法9を使用しての観測から来ている。しかし、ゴルジ染色は予測できないと見なされます。確かに、神経細胞と繊維管のグループは、隣接する領域は染色を欠いている間の特定の領域は、しばしば完全に染色された表示されると、ランダムにラベルが付けられています。最近の研究では、蛍光灯の構造のIUE変異体/野生型マウス10-11（ 図1A）に樹状突起、棘などのシナプスを研究するための魅力的な代替方法を表していることが示されている。また、マウスのノックアウトの世代と比較して、IUEは、特定の時間帯に細胞の特定の集団における機能の研究の利得と損失を実行するための迅速なアプローチを表しています。さらに、IUEは、正常遺伝子またはshRNA 12の過剰発現時間制御を改良する誘導性遺伝子の発現または誘導性RNAiアプローチで使用されています。 IUEのこれらの利点は、このようにopene持っているD新しい寸法だけではなく、特定の脳構造（ 図1B）でなく、開発の特定の時点（ 図1C）における樹状突起と棘上の遺伝子の発現/抑制の効果を検討します。 最後に、IUEは、樹状突起、背骨、そして/または、シナプスの開発に関与する遺伝子間の機能的相互作用を識別するための便利なツールを提供しています。確かに、ウイルスなど他の遺伝子導入法とは対照的に、それが細胞の同じ集団内で複数のRNAiまたは導入遺伝子を組み合わせることは簡単です。 要約すると、IUEは、すでに脳機能や病気の根底にある分子機構の特性に貢献してきました、それはまた、樹状突起と棘の研究に有用なはずである強力な方法です。

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Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

この資料では詳細に子宮内で大脳皮質およびマウスのE14.5における海馬をエレクトロポためのプロトコルについて説明します。また、このこれらの2つの脳領域で樹状突起と棘を研究する貴重な方法であることを示している。

使用して、マウス大脳皮質および海馬における可視化と樹状突起と棘の遺伝子操作<em&gt;子宮内で</em&gt;エレクトロポレーション

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

visualization-genetic-manipulation-dendrites-spines-mouse-cerebral

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

17.8K ビュー.  MRC National Institute for Medical Research. この資料では詳細に子宮内で大脳皮質およびマウスのE14.5における海馬をエレクトロポためのプロトコルについて説明します。また、このこれらの2つの脳領域で樹状突起と棘を研究する貴重な方法であることを示している。

ビデオ: Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

嗅神経細胞のレンチウイルスを介した遺伝子操作と可視化 in vivoで</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

神経科学

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

でProprioceptorsの可視化<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫および蛹

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

軸索、樹状突起および脳スライスにおける個々のニューロンの樹状突起棘から電位感受性色素記録

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

同時脳波、リアルタイム乳酸濃度の測定と齧歯類大脳皮質ニューロン活動のOptogeneticマニピュレーション

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

マウスの遺伝子操作は、視床下部を介して開発<em&gt;子宮内</em&gt;エレクトロポレーション

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

二光子<em&gt; in vivoで</em&gt;間引き頭蓋骨の準備を使用して、マウス皮質における樹状突起棘のイメージング

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous system. Overexpression of desired genes is just as possible as shRNA mediated loss-of-function studies. Therefore it offers a wide range of applications. The feasibility to target particular cells in a distinct area further increases the range of potential applications of this very useful method. For efficiently targeting specific regions knowledge about the subtleties, such as the embryonic stage, the voltage to apply and most importantly the position of the electrodes, is indispensable.
Here, we provide a detailed protocol that allows for specific and efficient in utero electroporation of several regions of the C57BL/6 mouse central nervous system. In particular it is shown how to transfect regions the develop into the retrosplenial cortex, the motor cortex, the somatosensory cortex, the piriform cortex, the cornu ammonis 1-3, the dentate gyrus, the striatum, the lateral septal nucleus, the thalamus and the hypothalamus. For this information about the appropriate embryonic stage, the appropriate voltage for the corresponding embryonic stage is provided. Most importantly an angle-map, which indicates the appropriate position of the positive pole, is depicted. This standardized protocol helps to facilitate efficient in utero electroporation, which might also lead to a reduced number of animals.

Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse

This protocol describes in detail how to specifically transfect different regions in the C57BL/6 central nervous system via in utero electroporation. Included in this protocol are detailed instructions for transfections of regions that develop into the cortex, hippocampus, thalamus, hypothalamus, lateral septal nucleus and striatum.

Cortex-、Hippocampus-、Thalamus-、Hypothalamus-、横中隔Nucleus-と線条体固有<em&gt;子宮内</em&gt; C57BL / 6マウスでのエレクトロポレーション

In utero electroporation is a widely used technique for fast and efficient spatiotemporal manipulation of various genes in the rodent central nervous ...

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To do so requires generating a mosaic in which neurons with loss or gain of function of a gene are surrounded by genetically unperturbed tissue. Here, we combine the Cre-lox recombination system with in utero electroporation in order to generate mosaic brain tissue that can be used to study the cell-autonomous function of genes in neurons. DNA constructs (available through repositories), coding for a fluorescent label and Cre recombinase, are introduced into developing cortical neurons containing genes flanked with loxP sites in the brains of mouse embryos using in utero electroporation. Additionally, we describe various adaptations to the in utero electroporation method that increase survivability and reproducibility. This method also involves establishing a titer for Cre-mediated recombination in a sparse or dense population of neurons. Histological preparations of labeled brain tissue do not require (but can be adapted to) immunohistochemistry. The constructs used guarantee that fluorescently labeled neurons carry the gene for Cre recombinase. Histological preparations allow morphological analysis of neurons through confocal imaging of dendritic and axonal arbors and dendritic spines. Because loss or gain of function is achieved in sparse mosaic tissue, this method permits the study of cell-autonomous necessity and sufficiency of gene products in vivo.

Inducing Cre-lox Recombination in Mouse Cerebral Cortex Through In Utero Electroporation

Cell-autonomous functions of genes in the brain can be studied by inducing loss or gain of function in sparse populations of cells. Here, we describe in utero electroporation to deliver Cre recombinase into sparse populations of developing cortical neurons with floxed genes to cause loss of function in vivo.

子宮内エレクトロポレーション マウス大脳皮質における Cre lox 組換えを誘導します。

Cell-autonomous neuronal functions of genes can be revealed by causing loss or gain of function of a gene in a small and sparse population of neurons. To ...

Rapid Golgi Stain for Dendritic Spine Visualization in Hippocampus and Prefrontal Cortex

Golgi impregnation, using the Golgi staining kit with minor adaptations, is used to impregnate dendritic spines in the rat hippocampus and medial prefrontal cortex. This technique is a marked improvement over previous methods of Golgi impregnation because the premixed chemicals are safer to use, neurons are consistently well impregnated, there is far less background debris, and for a given region, there are extremely small deviations in spine density between experiments. Moreover, brains can be accumulated after a certain point and kept frozen until further processing. Using this method any brain region of interest can be studied. Once stained and cover slipped, dendritic spine density is determined by counting the number of spines for a length of dendrite and expressed as spine density per 10 &#181;m dendrite.

The protocol describes a modification of the rapid Golgi method, which can be adapted to any part of the nervous system, for staining neurons in the hippocampus and medial prefrontal cortex of the rat.