This study was supported by the Swiss National Foundation (n&#176; 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)

動物のケアは、スイスの地方自治体（AMTエリーゼLandwirtschaftウントナチュールデKantonsベルン、Veterinärdienst、Sekretariat Tierversuche、承認NRS。11分の52と14分の35）によって承認されたガイドラインに従いました。これらのガイドラインは、欧州共同体指令63分の2010 / EUと一致しています。 注： - サブステップを含む、5すべてのステップ1のための滅菌機器およびソリューションを、層流フード内で作業。 MEAの作製注：のMEAは、ガラス基板、微細加工金属電極とSU-8ポリマー絶縁層で構成されている（またTscherter ら 3を参照）。本研究の目的のために、市販のMEAは、カスタマイズされた電極アレイの配置（ 図1 A＆B）に注文しました。 68の電極は、電極の自由は300μm幅の広い溝、電動式によって二つのゾーンに分割されている長方形の格子状に配置されていますiCalのリードと絶縁。各電極のサイズは40×40μmであり、それらは中心に中心から200ミクロンだけ離間しています。四つの大きな接地電極は、記録部位の周囲に配置されています。彼らは、サイズの他の標準的な市販のMEA（X 21ミリメートル21ミリメートル）とは異なり、彼らは決まった記録室がありません。 <ol><li>少なくとも30秒毎、100％エタノール（2×）、70％エタノール（1×）および蒸留水（2×）で消毒すすぎMEAについ​​て。乾燥してみましょう。きれいなガラスシャーレ（150ミリメートル×25ミリメートル）で12のMEAと蓋を閉じる - 10を置きます。 </li><li> 120℃で20分間オ​​ートクレーブのMEA。室温で保管してください。 </li><li> -20℃でのMEAや店舗のアリコートのために（材料のリストを参照）塗布液を調製します。 </li><li>個々の滅菌ペトリ皿（35ミリメートル×10 mm）の各MEAを置きます。 </li><li>電極の上に150μlの冷やした塗布液を入れ、シャーレの蓋を閉じるために冷却されたピペットを使用してください。約10分後の上部に気泡を確認必要に応じて、そっと電極とは、ゴム被覆スパチュラでそれらを削除します。 RTで1時間休ませてください。 </li><li>吸引し塗布液残基、出生前および胚の神経細胞のために最適化中、蒸留、滅菌水で2倍と1倍を洗います。 MEAのが翌日まで使用されていない場合は、インキュベータO / Nで37℃の蒸留、無菌水に保管してください。それ以外の場合は、室温で直接乾燥させてください。 </li></ol>器官培養物の調製および増殖に必要な2成分<ol><li>カルシウムを含まない洗浄溶液を準備（材料のリストを参照）。 </li><li>洗浄溶液中に鶏のプラズマを再構成（1：1、軽く振って、泡の形成を避けるため）、約20分間、3000×gで遠心分離し、滅菌チューブに明確な内容をデカント。小分け-20℃でクリオチューブやストアに200μlの。 </li><li>それに応じてウシ血漿（200 U / ml）および滅菌フィルター（0.2μmの孔のフィルター）からトロンビンを再構成。小分けcrytに200μlの-20℃でotubesと店舗。 </li><li> 30の文化のための栄養培地100mlを（材料のリストを参照）を作製。 </li></ol> 3.脊髄組織の解剖注：胚の数に応じて、手順の収率は約25のために、脊髄切片 - 35共培養し、無菌条件下で層流フードの内部に用意されています。 <ol><li>筋肉内注射によって母動物にペントバルビタール（0.4ミリリットル）の致死量を適用します。ペダル引っ込め反射をチェックすることにより、深い麻酔を確認してください。断頭により帝王切開と犠牲によってE14ラット胚を提供します。 </li><li>滅菌、チルド、洗浄溶液で満たされたペトリ皿に胚のボディを転送します。 </li><li>一つの完全な横断後肢上記メスで切断し、前肢上記の別のものを実行し、本体から手足を削除します。次に、脊髄Coを含むバック片から独立した内臓に前頭面で切断してくださいRD。 </li><li>スライスは、ディスク装着に一度脊髄一つを含むバックピースを転送し、225の厚さで切断 - 組織チョッパーで250μmです。刻んだ組織に洗浄溶液の液滴を入れて、35ミリメートル滅菌、チルド、洗浄溶液で満たされたX 10ミリメートルペトリ皿にスパチュラでスライスを転送します。 </li><li>個別に各スライスについて、離れて残りの組織から脊髄を解剖。添付の後根神経節を残します。 </li><li>スライスは、4℃で1時間休ませてください。 </li></ol> 4.多国間環境協定の脊髄組織のスライスのマウント<ol><li>インキュベーター内で無菌栄養培地をウォームアップ（37℃、酸素化のために軽く緩め蓋）。 </li><li>焦点の電極アレイで立体顕微鏡下でペトリ皿で​​室温、ゴム被覆ヒントを滅菌ピンセットで位置MEA。 、きれいなダストフリー、および無菌の電極アレイ上に鶏のプラズマ6μlの滴を中央に配置します。小さなへらを使用して、慎重にスライドさせ腹側がプラズマ液滴に互いに対向有する2つの脊髄切片。スパチュラで電極に触れないでください。 </li><li>鶏のプラズマ液滴の周りにトロンビンの8μLを追加します。トロンビンピペットチップを使用して、慎重に2つのスライスを中心に鶏プラズマ/トロンビン混合物を混合して広がりました。ここでも、直接脆い電極アレイを触れないでください。ただ、凝固する前に、余分な鶏のプラズマ/トロンビンを吸引。 </li><li> MEA /文化アセンブリは、37℃のインキュベーター内部加湿チャンバー内で約1時間座っている間、高湿度を維持するためにペトリ皿に蓋を。 </li><li>慎重にペトリ皿に蓋をし、約30分間インキュベーターに戻し、培養室に栄養培地10μlを添加します。 </li><li> 、ローラーチューブに無菌の、ゴムで覆われたヒントを各MEA /文化アセンブリを配置栄養培地の3ミリリットルを追加し、しっかりふたを閉めます。 5％のCOでインキュベーターで2回転数 - 1で回転するローラードラムにローラーチューブを置き<su37℃でB&gt; 2含有雰囲気。 </li><li> in vitroで 7日後に栄養培地の半分を変更します（DIV）、その後1 -週2回。 </li></ol> 5.機械病変<ol><li>焦点の組織と実体顕微鏡下で栄養培地なしペトリ皿にローラーチューブと場所のうち、滅菌、ゴムで覆われたヒントをMEA /文化アセンブリを取ります。視覚的に2つのスライスが融合していることを確認します。 </li><li> MEA上のゴム被覆ヒントをピンセットを配置することによって安定したMEA /文化アセンブリを持ちます。 </li><li>組織切片に近いMEAの溝に手術用メスの刃を配置します。むしろ水平にメスを持ちます。 </li><li>メスアップハンドルが、手術用メスの刃がベースからブレード「ロール」は先端と、それによって溝をカバーする組織を切断するようにMEAの溝に滞在させ持ち上げます。 </li><li> 25 G針先端necess場合と重度の残留組織の接続進。溝内の領域でのみ動作し、入札の縁に手を触れないでください。 </li><li>ローラーチューブに戻し、MEA /文化アセンブリを配置します。培養に新鮮な栄養培地の3ミリリットルを提供し、インキュベーター内でローラードラムに戻し、それらを配置します。 </li></ol>自発的活動の6電気生理学的記録<ol><li> DIVの選択された番号の後に2脊髄スライス間の機能的再生を調べるために、（材料のリストを参照）、顕微鏡で記録チャンバーにMEA /文化アセンブリをマウントし、約500μlの細胞外溶液を適用します。 </li><li>システムを安定させるために最初の記録の前に10分を待ちます。 </li><li> RTでMEAの各アクティビティ検出電極からの約10分間の録音の基本的な自発的活動の2倍。 </li><li>安定細胞外の条件を確実にするために、すべての記録セッションの後に細胞外溶液を交換します。 </li><li>ネットワークを脱抑制をきたすために、細胞外溶液の共同適用ストリキニーネ（1μM）とgabazine（10μm）をntaining。録音を開始する前に、少なくとも2分間待ちます。 </li></ol> 7.データ解析注：細胞外に記録された活動電位の検出のために各電極の標準偏差とその後の弁別に基づいて検出するために使用します。この手順はTscherter ら 3に詳細に記載されています。 <ol><li>標準的な手順3（ 図1F）に応じて、ラスタープロットの各電極の検出ニューロンの活動を表示します。 </li><li>決定し、表示する10ミリ秒のスライディングウィンドウ内応じてチャンネルのイベント数を合計することにより、各スライスの合計ネットワークアクティビティは、1ミリ秒のステップだけシフトした （図1GおよびTscherter ら3参照）。 </li><li>各スライスの個々のバースト（いくつかの電極の上に表示されるアクティビティのクラスタ）で検出します。したがって、、対応するネットワーク全体の活動の最小のピーク活性のしきい値を設定し、各バーストの開始とバースト終了を定義します。例えば、適切な閾値は、平均バースト振幅の25％であり、バースト開始は時の時間ウィンドウ内の最後のイベントであることによって、少なくとも5ミリ秒、バースト終了の時間ウィンドウ内の最初のイベントであることによって定義することができます。少なくとも25ミリ秒（Heidemann ら 10を参照）。 </li><li>機能的再生を定量化するために2つのスライス間の同期バーストの割合を計算します。これを行うには、1スライス内のバーストおよび他のスライスで次のバーストとの間の待ち時間を計算します。 注：バースト対は待ち時間、平均バースト長よりも小さい場合、「同期化」と呼ばれます。特に、多くのアクティビティとの共培養では、可能性は両側が偶然に選ばれた待ち時間ウィンドウでバーストを開始することが存在します。この事実は、SYの割合の定量化に考慮しなければなりませんnchronizedバースト。計算の詳細についてはHeidemann ら 10を参照されたいです 。 </li></ol> 8.文化の固定および免疫組織化学<ol><li>洗浄またはインキュベーションを含むすべての手順については、組織を通って溶液の適切な拡散を確保するために、傾斜テーブルの上に培養液を入れてください。 </li><li>記録セッションが終了した直後シャーレ（X 10ミリメートル35ミリメートル）でそれを入れて、細胞外溶液の約2mlを追加し、セットアップのうち、MEA /文化アセンブリを取ります。 </li><li> in vitroでの時間の間に形成している周囲の細胞層からのスライスを分離するために、スライス10μlのピペットチップと円がかかります。文化を傷つけないように注意してください。なお、この工程を省略することも可能であるが、後に埋め込むことは、それが実行されたときに容易です。 </li><li>薄い非金属注射針を使用して外solutiで満たされた1mlシリンジと組み合わせて（素材リストを参照）優しく、MEAから文化を爆破します。 </li><li>パスツールピペットの先端を取り外し、slivered端にゴム球をフィット。固定液（リン酸緩衝生理食塩水（PBS、0.1 M）を用いて4％パラホルムアルデヒド）に文化を転送するためにバックエンドを使用します。それはあまりにも小さく、文化が折り畳まれ、おそらく損傷を受けることになるので、転送のためにパスツールピペットの標準チップを使用しないでください。 4℃で2時間 - 1の修正。蒸留水でMEAをすすぎ、指先で組織残留物を除去するが、爪で傷つけたりしません。 4℃の蒸留水に保管したMEA </li><li>少なくとも10分ごとに、PBS中の培養3回洗浄します。 4℃でPBS中に保存したり、直接染色手順で開始します。 </li><li>溶液（5％ヤギ血清、1％ウシ血清アルブミン、PBS中の0.3％の界面活性剤）をブロック内に少なくとも90分間培養物をインキュベートします。 </li><li>ブロッキング溶液で希釈した一次抗体を加え、4℃で3泊インキュベートします。 </li><li> lにおけるPBS中の洗浄3倍東30分各。 </li><li>室温で2時間、PBSで希釈した二次抗体を追加します。 </li><li>少なくとも30分ごとに、PBS中で洗浄3倍。 </li><li>オブジェクトスライドで除去先端でパスツールピペットでスライスを転送します。過剰のPBSを削除して、メディアをマウントして埋め込みます。 </li></ol>

<ol>
	<li>Avossa, D., Rosato&#8211;Siri, M., Mazzarol, F., Ballerini, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+circuits+formation:+a+study+of+developmentally+regulated+markers+in+organotypic+cultures+of+embryonic+mouse+spinal+cord.">Spinal circuits formation: a study of developmentally regulated markers in organotypic cultures of embryonic mouse spinal cord.</a> Neuroscience. 122 (2), 391-405 (2003).</li><li>Cifra, A., Mazzone, G. L., Nani, F., Nistri, A., Mladinic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+developmental+profile+of+neurons+and+glia+in+motor+nuclei+of+the+brainstem+and+spinal+cord,+and+its+comparison+with+organotypic+slice+cultures.">Postnatal developmental profile of neurons and glia in motor nuclei of the brainstem and spinal cord, and its comparison with organotypic slice cultures.</a> Dev Neurobiol. 72 (8), 1140-1160 (2012).</li><li>Tscherter, A., Heuschkel, M. O., Renaud, P., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+characterization+of+rhythmic+activity+in+rat+spinal+cord+slice+cultures.">Spatiotemporal characterization of rhythmic activity in rat spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 14 (2), 179-190 (2001).</li><li>Czarnecki, A., Magloire, V., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+oscillations+of+spiking+activity+in+organotypic+spinal+cord+slice+cultures.">Local oscillations of spiking activity in organotypic spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 27 (8), 2076-2088 (2008).</li><li>Kirkby, L. A., Sack, G. S., Firl, A., Feller, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+correlated+spontaneous+activity+in+the+assembly+of+neural+circuits.">A role for correlated spontaneous activity in the assembly of neural circuits.</a> Neuron. 80 (5), 1129-1144 (2013).</li><li>Ballerini, L., Galante, M., Grandolfo, M., Nistri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+rhythmic+patterns+of+activity+by+ventral+interneurones+in+rat+organotypic+spinal+slice+culture.">Generation of rhythmic patterns of activity by ventral interneurones in rat organotypic spinal slice culture.</a> J. Physiol. (Lond.). 517 ((Pt 2)), 459-475 (1999).</li><li>Hanson, M. G., Landmesser, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+patterns+of+spontaneous+activity+are+required+for+correct+motor+axon+guidance+and+the+expression+of+specific+guidance+molecules).">Normal patterns of spontaneous activity are required for correct motor axon guidance and the expression of specific guidance molecules).</a> Neuron. 43 (5), 687-701 (2004).</li><li>Courtine, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+supraspinal+control+of+stepping+via+indirect+propriospinal+relay+connections+after+spinal+cord+injury.">Recovery of supraspinal control of stepping via indirect propriospinal relay connections after spinal cord injury.</a> Nat. Med. 14 (1), 69-74 (2008).</li><li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+regeneration+of+intrinsic+spinal+cord+axons+in+a+novel+spinal+cord+slice+culture+model.">Spontaneous regeneration of intrinsic spinal cord axons in a novel spinal cord slice culture model.</a> Eur. J. Neurosci. 27 (10), 2483-2492 (2008).</li><li>Heidemann, M., Streit, J., Tscherter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+regeneration+of+intraspinal+connections+in+a+new+in+vitro+model.">Functional regeneration of intraspinal connections in a new in vitro model.</a> Neuroscience. 262, 40-52 (2014).</li><li>Nishimaru, H., Restrepo, C. E., Ryge, J., Yanagawa, Y., Kiehn, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+motor+neurons+corelease+glutamate+and+acetylcholine+at+central+synapses.">Mammalian motor neurons corelease glutamate and acetylcholine at central synapses.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (14), 5245-5249 (2005).</li><li>Tsuji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibition+induces+selective+motor+neuron+death+in+organotypic+slice+cultures.">Proteasome inhibition induces selective motor neuron death in organotypic slice cultures.</a> J. Neurosci. Res. 82 (4), 443-451 (2005).</li><li>Magloire, V., Streit, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+activity+and+positive+feedback+in+motor+circuits+in+organotypic+spinal+cord+slice+cultures.">Intrinsic activity and positive feedback in motor circuits in organotypic spinal cord slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 30 (8), 1487-1497 (2009).</li><li>Bahrami, F., Janahmadi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+supplements+affect+electrophysiological+properties+and+excitability+of+rat+hippocampal+pyramidal+neurons+in+primary+culture.">Antibiotic supplements affect electrophysiological properties and excitability of rat hippocampal pyramidal neurons in primary culture.</a> Iran. Biomed J. 17 (2), 101-106 (2013).</li><li>Mentis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncholinergic+excitatory+actions+of+motoneurons+in+the+neonatal+mammalian+spinal+cord.">Noncholinergic excitatory actions of motoneurons in the neonatal mammalian spinal cord.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A.. 20 (102), 7344-7349 (2005).</li><li>Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+are+rich+in+non&#8211;phosphorylated+neurofilaments:+Cross&#8211;+species+comparison+and+alterations+in+ALS.">Motor neurons are rich in non&#8211;phosphorylated neurofilaments: Cross&#8211; species comparison and alterations in ALS.</a> Brain Res. 861 (45&#8211;58), (2000).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

提示された手順のいくつかの要素は、正確で再現性のある実験の達成のための基本です。 MEAを、溶液の調製とスライス培養物の製造時の全てのステップは、層流フード内で無菌条件下で行われます。彼らは自発的活動14に影響を与えることができるため、抗生物質を栄養培地には適用されません。 MEAのコーティングの間に、最も重要な部分は、細胞外マトリックスゲル溶液が常に冷たいまま確認することです。それ冷蔵庫の中や、0℃に近い最高温度を確保するために、全体の手順のために氷の上にそれを維持解凍。スライス迅速な隔離の準備中および切片だけでなく、氷冷解剖バッファを使用して低温に注意を払っては健全な文化の割合が増加します。また、プラズマ/トロンビン凝固は最も重要なステップの1つです。まず、プラズマが正しくミヘ族であることを確認してくださいトロンビンでD。第二に、多国間環境協定へのスライスの適切な取り付けを確実にするために、できるだけ多くの残留物を除去することに特別な注意を払います。このステップは非常に時間に敏感です。タイムフレームが短すぎると、プラズマ/トロンビン混合物の過度に除去します。タイムフレームが長すぎると、凝集が既に残留プラズマ/トロンビンと共にスライスを除去する危険性を増大させる、起こりました。 機械的な病変が計画されている場合には、正確なデザインでのMEAを使用することが重要です。病変が意図されている領域は、電極、配線と絶縁体を含まないことが必要です。それ以外の場合は、MEAの電気系統が損傷されようとしているので、何のレコーディングはもう実行することはできません。 もう一つの重要なステップは、病変の大きさに関係します。これは、病変後に二人の若いのスライスを再接続すると、2日程度10を要することが以前に示されています。すべての実験のために、親指のルールは、スペースbetweことに使用しました病変後のスライスエンMEA溝（300ミクロン）の幅よりも大きくなるべきではありません。大きな病変サイズは、病変は、全く再接続大きすぎるされていない場合、再接続のための長い時間枠になるか、可能性があります。注釈を付けるには、前者の実験はさらに離れて非常に低い接続速度が1mmの結果より、2つのスライスの初期配置することを明らかにしました。 録音、室温に少なくとも10分の調整時間の開始前に、インキュベーターの、および細胞外溶液に、代わりに栄養培地の代わりに37℃を推奨します。これらの初期分間の活動パターンの綿密な観察は、測定データが記録を開始した適切後文化の崩壊パターンを表していることを保証します。 （チャンバーを記録し、アンプやアンプへの接続）活性の検出、データ収集、さらなる処理、手作りのハードウェアについては、ラボ内のプログラムVIEW、C ++とIgorProが使用されています。市販のMEAのセットアップおよびその他のソフトウェアパッケージは、これらの操作のためにも適しています。ここで、電極によって見られる信号は、1001倍に増幅された後、6 kHzの速度でデジタル化されています。 なぜなら、インビボで提示したモデルは、脊髄固有の接続を検査するために役立つツールとなることができ、それらは、繊維路を昇順と降順の干渉を受けずに勉強することは困難です。 2脊髄スライスの共培養は、エレガントに、この問題を回避することができます。培養物は、厳密に制御し、簡単に操作することができる微小環境を提供します。一方、脊柱上および感覚入力が不足していることは勿論です。さらに、培養調製方法は、CNS損傷の状況を表しています。アストロサイトとミクログリアのようなグリア細胞が増加増殖と病変に応答することが知られているので、組織を再編成ある程度ですされています。提示モードに関する機械的な損傷を実行した後、Lグリア性瘢痕の形成は観察されませんでした。 1つの説明は、アストロサイトの適応メカニズムが既に準備処理中にトリガされたことや文化の病変がさらに応答を生じなかったことが考えられます。また、ミエリン関連阻害剤、 例えばの関与の証拠はありません。、のNogo-A、老後に病変の文化の低い再生可能性に。しかし、ロリプラムは、スライス10の間で23 DIV増加機能的再生に病変を実行した後に直接起動ホスホジエステラーゼ4阻害剤による治療を示されました。これらの結果は、機能回復が古い培養物中で増加させることができることを示しています。病変部位を横切る軸索の数をカウントするときに顕著に、若い年齢で病変の文化や古い年齢で病変の文化の間には差が発見されませんでした。これらの知見は、軸索再生の欠如が主な理由Fではないことを示唆していますまたはしたがって、文化の中で後半の病変後の回復の損失とは、再生の機能解析を可能にするモデルの必要性を強調しています。シナプス形成とシナプス可塑性は、回復プロセス10において主要な役割を果たしている可能性があります。これらのメカニズムは、近年中に多くの注目を得て、それが今日では広く、彼らは脊髄損傷後の結果に大きな影響を与えることが認められています。したがって、単独でと非常に詳細にこれらのプロセスを調査するために安定した条件を提供するモデルは確かに脊髄の機能的再生に関する洞察を得るのを助けることができます。

中枢神経系（CNS）の器官型切片培養物は、神経発達の神経変性に到達する様々な生理学的および病理学的現象を研究するために広く使用されています。解離細胞培養物と比較して、器官のスライスは、無傷の細胞構築と地元のシナプス回路をより複雑にするという利点を提供します。同時に、組織は 、インビボのコンテキスト全体の複雑さが関与することなく、孤立したように分析することができます。また、選択したセルに簡単に繰り返しアクセスが保証され、細胞外環境を精密に制御することができ、通常、in vitroモデルは、 それらのインビボ対応よりも低コストです。近年、様々な研究が対応する生きている動物1,2対長期培養の発達プロファイル間の顕著な類似を発表しました。それは、様々なCNSレジオの神経回路が示されていますNSは、開発中に自発的なネットワーク活性を発現し、器官スライスが部分的にこの現象3-7を維持すること 。単離された脊髄調製物は、特にリズム生成6および神経回路1の形成を研究するために使用されています。 器官型スライスの自発的活動を記録する方法は、マルチ電極アレイ（MEAの）の上で培養するそれらです。これらのデバイスは、同時に多数の細胞からの活動電位によって生成された細胞外電位（マルチユニット記録）を監視することができ、複数の電極を含んでいます。 MEA記録の高い時間分解能が与えられた神経回路内の正確な活性の動態を再構築するために使用することができます。さらに、パッチクランプ技術とは対照的に、ニューロンは、それらの動作に影響されないという事実の長期測定し、結果を可能にする、非侵襲的です。 Fまたは、本研究の目的は、器官脊髄共培養およびマルチサイト記録の組み合わせは、脊髄内の機能再生を研究するために使用されました。成人高等脊椎動物の脊髄の損傷から回復する可能性が限られているので、別の戦略は、脊髄損傷後の再生を促進するために研究されています。これまでのところ、皮質脊髄路は、通常、調査のための選択のモデルシステムとなっています。これらの実験は、一般的に高価な時間のかかるであり、単一のグループ内の高い変動に起因する大型動物のコホートを必要とします。また、証拠が脊髄固有の接続（完全脊髄内に閉じ込めているニューロン）は、脊髄損傷8後の回復過程において極めて重要な役割を果たしうることを示唆しています。これらの繊維は、繊維路を昇順と降順の干渉を受けずに、生体内で勉強することは困難です。 BonniciとKapfhammer 9は、長手方向の脊髄を使用しました別のアプローチとして、出生後のマウスのスライス培養。機械的な病変を行った後、彼らは半定量的に脊髄セグメント間の軸索の形態学的再生を分析しました。彼らは成熟した年齢で切断培養における病変部位を横切る少なくはなく、なし、軸索を観察しました。 7日後に損傷 - これとは対照的に、若い段階で病変した培養物は、5軸索再生の高い量を表示しました。しかし、機能的な接続のための証拠が提示されませんでした。 したがって、機能的再生の調査を可能にする脊髄固有の繊維のインビトロモデルにおける代表の開発は、脊髄の再生過程についての知識を拡張するための貴重なツールになります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Planar multielectrode array</td>
			<td>Qwane Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>custom-made according to the design of our lab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nutrient medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For 100 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos modified Eagle&#39;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td>80 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050-070</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>distilled, sterile water</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>10 ml&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve growth factor-7S [5ng/mL]</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N0513</td>
			<td>200 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>reconstituted in wash solution with 1% BSA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coating solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular matrix gel</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356230</td>
			<td>Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medium optimized for prenatal and embryonic neurons</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wash solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[mg/L]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2-6H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4-7H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2HPO4 anhydrous</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose (Dextrose)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="right">1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extracellular solution (pH 7.4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[mM]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>145</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na-pyruvate</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blocking Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detergent: Triton X-100</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>0.3%, harmful if swallowed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td>1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16210-064</td>
			<td align="right">5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2366</td>
			<td>Lyophilized, reconstitute with wash solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gabazine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SR-95531</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mecamylamine hydrochloride</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>2843</td>
			<td>toxic if swallowed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>World Precision Instruments, Inc.</td>
			<td>MF28G-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>harmful, 4%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI-31</td>
			<td>Covance</td>
			<td>SMI-31P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMI-32</td>
			<td>Covance</td>
			<td>SMI-32R-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Strychnine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0532</td>
			<td>toxic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>1123740001</td>
			<td>irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flat tube 10 (= roller tube)</td>
			<td>Techno Plastic Products AG</td>
			<td>91243</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating functional regeneration in organotypic spinal cord co-cultures grown on multi-electrode arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

E14ラット胚の脊髄に由来する共培養物の機能回復の可能性を調べるために、病変は、8〜28 DIVの時間ウィンドウ内で行われました。 2〜3週間後に、自発的なニューロンの活動は、多国間環境協定（ 図1 C＆D）で記録しました。細胞外に記録された活動電位は、個々の電極（ 図1E）のためにオフラインで同定されました。ネットワークアクティビティプロットが続くラスタプロットが生成されたこれらのデータ（ 図1F）、から側（ 図1G）ごとに別々に総活性を可視化しました。各スライスでは自発的活動は通常バーストで構成されています。スライスが機能的に接続されている場合は、これらのバーストは1スライスから他に伝播することができます。したがって、2つのスライスの間の同期バーストの量を定量的に機能的な再生を測定するために、計算されました。どのように変換intの詳細について異なるプロットoを行い、同期活動の割合を計算するための式は導出したか、Heidemann ら 10を参照してくださいされています。 全ての実験において、活動はまず、標準的な条件下で記録しました。第2のステップでは、シナプスの阻害は、細胞外浴溶液にストリキニーネ（1μM）とgabazine（10μM）を加えることによりブロックしました。この脱抑制は、バーストの定義、したがって、スライス間のバースト同期の決意を容易に延長されたバーストとバースト間隔でより規則的な活動パターン、通常つながります。 若い年齢で病変文化-後期（&gt; 19 DIV）で病変文化が（ 図2のAを再生する能力の明らかな低下を示した（図7〜図9 DIV）は、2〜3週間後に病変同期活動の高い量を表示しました- F）。これらの知見は、その再生能力を示します脊髄切片培養において機能的接続の培養で3週間以内に、 インビボでのさらなる展開状態を示す、低レベルのために、 インビボでの胚の状態を表す、ハイレベルから低下します。 接続にはどのようなものは、実際には2つのスライス間のバースト同期に関与していますか？脊髄固有の接続に加えて、繊維は、運動ニューロンまたは後根神経節ニューロンから発生する可能性があります。これは、後根神経節ニューロンは、脊髄の切片10との間の機能的結合に関連しないことが以前に示されています。しかし、運動ニューロンの関与は可能性が残りました。運動ニューロンのニコチン性受容体13を介して脊髄ニューロンへのコリン作動性の接続を形成することが知られているので、脊髄の共培養物の活性は8 DIV、培養物は高度に同期活動10を示し 、時間、およびニコチンアンタゴニストMecamで記録しましたイルアミン（MEC、100μM）は、細胞外浴溶液に添加しました。 2つのスライスとの間の接続における運動ニューロンの参加は、同期活動の減少割合をもたらすであろう。しかし、これはそうではなかった（MEC：91.0±4.5％、N = 7;対照：93.6±4.6％、N = 7、P&gt; 0.05、ウィルコクソンのマッチドペア検定）。これらの結果は、コリン作動性シナプスは、スライス間の機能の接続には寄与しないことを示唆しています。運動ニューロンはまた、CNS 11,15内のシナプスでのグルタミン酸を放出することが示されているので、これらの実験は、完全にそれらの関与を排除するものではありません。 運動ニューロンを同定するために、SMI-32と非リン酸化神経フィラメントHに対する免疫組織化学的染色を行いました。彼らは、スライス（ 図3A）に分布し、運動ニューロンのための代表的ないくつかのラベルに大きな細胞体を、明らかにしました。 SMI-32抗体はmotoneuroの細胞体を標識することが報告されていますNS 12と、この発見を使用しても文化13にも当てはまります。また、B-IIIチューブリンまたはのNeuNに対する一般的な神経細胞体の染色、 例えば、同様にグリア細胞体、 例えば 、GFAP抗体によるアストロサイトは、他の報告と一致していると、これらの細胞型の形態学的記述と一致しています（ 図3のB - D）。それにもかかわらず、SMI-32抗体を用いた軸索の標識は（ 図3E）についてです。予想に反し、この抗体を使用した場合、繊維の巨大なネットワークが表示され、それがリン酸化された神経フィラメントH（ 図3F）をラベルのSMI-31染色のようになります。この結果の一つの解釈は、ニューロフィラメントのリン酸化/脱リン酸化の発生調節がin vivoでの状況と比較して使用した培養物のようにタイトではないことが考えられます。同じ軸索におけるリン酸化および非リン酸化神経フィラメントの混合発生が正しくありませんでしたこの知見AIN。別の可能性は、SMI-32ラベルされた軸索は投射ニューロンから発生するということです。ツァンや同僚16は、 例えばは、クラークの列と中間外側セル列ニューロンは運動ニューロン以外に、SMI-32で染色されることが示されています。このようなニューロンの発音神経突起の増殖はまた、SMI-32陽性線維の豊かさを説明することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig1.jpg" /> 図1.ディスプレイと自発的活動の分析。（A）MEAのダイアグラム。プラチナ覆われた電極は、黒、赤、透明ワイヤと黄色で、MEAの中央にある溝に描かれています。 （B）、MEAの中心部に位置する電極アレイのクローズアップ。図は親切に博士M. Heuschkelによって提供されています。 （C）8 DIV古いculturの明視野像E。スライスが成長し、互いに対向する辺に沿って融合しています。黄色のバーは、MEAの電極 - 絶縁フリー溝を表します。実験のスケールバー= 400μmの（D）のタイムライン。 E14ラット胚の二つの脊髄切片を、MEAの上に隣同士に配置されています。数日以内に、スライスは、互いに対向する辺に沿って成長し、ヒューズ。 8の時間枠で - 28 DIV、完全な病変が融合部位を介して実行されます。 2〜3週間後に自発的な活動が記録され、培養物は、免疫組織化学的染色のために固定されています。 （E）23 DIV古い文化の各個別電極の自発的活動の痕跡。明確に可視化するために、すべての第2のトレースのみが示されています。オレンジ色のトレースは、左側から右側のスライスから記録された活動、青色トレースを示しています。バーストのほとんどは、両者の間に同期されます。左スライスpのみで発生するバーストに矢印ポイントartially右スライスに伝播。右のスライスでの活動は、しかし応じ側の平均最大ピーク活性の少なくとも25％の選択されたしきい値に達しなかったため、バーストとして検出されません。右の倍率が最後に同期バーストのペアを示しています。 （E）に示す活動の（F）ラスタープロット。 （E）に示す活動の定義されたバースト（ベースライン下のバー）と（G）ネットワークアクティビティプロット。 Heidemann らから適応。10。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig2.jpg" /> 図2.わけではありません同期活動に対する同期。（A、B）の文化のラスタープロットがlesione若い年齢でD（7時- 9 DIV）、標準的な条件（A）と脱抑制下（B）の下で同期活動を示します。 （C、D）の標準的な条件（C）および脱抑制下（D）下にない同期活動を示す（&gt; 19 DIVで）昔の年齢で病変の文化、のラスタプロット。同期活動の（E、F）の平均割合は、標準的な条件（E）および脱抑制下（F）の下で記録された各個々の病変日のためにプロットしました。 3週間病変の日の後 - 記録は2を撮影しました。 Heidemann らから適応。10。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53121/53121fig3.jpg" /> Figure 3.免疫組織化学的キャラクタリゼーション。SMI-32との運動神経細胞体の（A）染色。 （B）は、成熟神経細胞体とそのプロセスのβ-IIIチューブリンラベル。 （C）GFAPとアストロサイトの同定。 （D）のNeuNと成熟した神経細胞体の標識。 SMI-31で識別される非リン酸化神経フィラメントH.（F）リン酸化ニューロフィラメントHの（E）SMI-32染色。 Heidemann らから適応。10。両方、SMI-31およびSMI-32で、繊維の大規模なネットワークは、培養で表示されていることに注意してください。バーAD = 20ミクロン、H＆F =100μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53121/53121fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays at JoVE.com

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

ここでは、in vitroでの脊髄固有の接続の機能的再生を研究するために、マルチ電極アレイ上で培養脊髄スライスに基づいてされているプロトコルを提示します。

マルチ電極アレイ上に成長させた器官脊髄共培養における機能的再生の調査

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

investigating-functional-regeneration-organotypic-spinal-cord-co

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.0K ビュー.  University of Bern. ここでは、in vitroでの脊髄固有の接続の機能的再生を研究するために、マルチ電極アレイ上で培養脊髄スライスに基づいてされているプロトコルを提示します。 

ビデオ: Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies of these neurons are located in the dorsal spinal cord and their axons follow stereotyped trajectories during embryonic development. Commissural axons initially project ventrally towards the floorplate. After crossing the midline, these axons turn anteriorly and project towards the brain. Each of these steps is regulated by the action of several guidance cues. Cultures highly enriched in commissural neurons are ideally suited for many experiments addressing the mechanisms of axon pathfinding, including turning assays, immunochemistry and biochemistry. Here, we describe a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. First, the spinal cord is isolated and dorsal strips are dissected out. The dorsal tissue is then dissociated into a cell suspension by trypsinization and mechanical disruption. Neurons are plated onto poly-L-lysine-coated glass coverslips or tissue-culture dishes. After 30 hours in vitro, most neurons have extended an axon. The purity of the culture (Yam et al. 2009), typically over 90%, can be assessed by immunolabeling with the commissural neuron markers DCC, LH2 and TAG1 (Helms and Johnson, 1998). This neuronal preparation is a useful tool for in vitro studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance during spinal cord development.

This video demonstrates a method to dissect and culture commissural neurons from E13 rat dorsal spinal cord. Dissociated commissural neurons are useful to study the cellular and molecular mechanisms of axon growth and guidance.

胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

神経科学

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

器官培養における神経雪崩のマルチ電極アレイの録音

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Spinal Cord Transection in the Larval Zebrafish

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability to reinitiate spinal neurogenesis. However, some anamniotes including the zebrafish Danio rerio exhibit both sensory and functional recovery even after complete transection of the spinal cord. The adult zebrafish is an established model organism for studying regeneration following spinal cord injury, with sensory and motor recovery by 6&#160;weeks post-injury. To take advantage of in vivo analysis of the regenerative process available in the transparent larval zebrafish as well as genetic tools not accessible in the adult, we use the larval zebrafish to study regeneration after spinal cord transection. Here we demonstrate a method for reproducibly and verifiably transecting the larval spinal cord. After transection, our data shows sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury (dpi), with the C-bend movement detectable by 3 dpi and resumption of free swimming by 5 dpi. Thus we propose the larval zebrafish as a companion tool to the adult zebrafish for the study of recovery after spinal cord injury.

After spinal transection, adult zebrafish have functional recovery by six weeks post-injury. To take advantage of larval transparency and faster recovery, we present a method for transecting the larval spinal cord. After transection, we observe sensory recovery beginning at 2&#160;days post-injury, and C-bend movement by 3 days post-injury.

幼虫のゼブラフィッシュにおける脊髄切断

Mammals fail in sensory and motor recovery following spinal cord injury due to lack of axonal regrowth below the level of injury as well as an inability ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

アン<em&gt;エクスビボ</em&gt;レーザー誘起脊髄損傷モデルがリアルタイムで軸索変性のメカニズムを評価するために

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons. 
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.

We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.

マルチ電極アレイ上のらせん神経節ニューロン外植片培養と電気生理学

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Thy1を用いた一次体性感覚野における神経活動のイメージング-GCaMP6s トランスジェニック マウス

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

並列の単核 RNA 配列のため大人の脊髄核の分離

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

脊髄とトレッドミル上のアクティビティ ベースのトレーニング負傷 Wistar ラット

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

ラットおよびマウス脳への神経幹細胞の動脈内デリバリー:脳虚血への応用

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Automated Gait Analysis to Assess Functional Recovery in Rodents with Peripheral Nerve or Spinal Cord Contusion Injury

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and a lot of comparative data has been published in the literature. This includes a multitude of assessment methods to study functional recovery following nerve injury and repair. Besides evaluation of nerve regeneration by means of histology, electrophysiology, and other in vivo and in vitro assessment techniques, functional recovery is the most important criterion to determine the degree of neural regeneration. Automated gait analysis allows recording of a vast quantity of gait-related parameters such as Paw Print Area and Paw Swing Speed as well as measures of inter-limb coordination. Additionally, the method provides digital data of the rats&#8217; paws after neuronal damage and during nerve regeneration, adding to our understanding of how peripheral and central nervous injuries affect their locomotor behavior. Besides the predominantly used sciatic nerve injury model, other models of peripheral nerve injury such as the femoral nerve can be studied by means of this method. In addition to injuries of the peripheral nervous systems, lesions of the central nervous system, e.g., spinal cord contusion can be evaluated. Valid and reproducible data assessment is strongly dependent on meticulous adjustment of the hard- and software settings prior to data acquisition. Additionally, proper training of the experimental animals is of crucial importance. This work aims to illustrate the use of computerized automated gait analysis to assess functional recovery in different animal models of peripheral nerve injury as well as spinal cord contusion injury. It also emphasizes the method&#8217;s limitations, e.g., evaluation of nerve regeneration in rats with sciatic nerve neurotmesis due to limited functional recovery. Therefore, this protocol is thought to help researchers interested in peripheral and central nervous injuries to assess functional recovery in rodent models.

Automated gait analysis is a feasible tool to evaluate functional recovery in rodent models of peripheral nerve injury and spinal cord contusion injury. While it requires only one setup to assess locomotor function in various experimental models, meticulous hard- and soft-ware adjustment and training of the animals is highly important.

末梢神経または脊髄損傷を伴うげっ歯類の機能回復を評価する自動歩行分析

Peripheral and central nerve injuries are mostly studied in rodents, especially rats, given the fact that these animal models are both cost-effective and ...