This work was supported by a grant to MEM from the Dept. of Life Sciences and Systems Biology of the University of Turin, Italy. The authors thank G. Gnavi for technical assistance during some experiments. CTR is funded by the Wellcome Trust and the Royal Society (Grant Number 098436/Z/12/Z).

三軸コイルの1設定 メモ ：図1は、GMFを逆転するために使用される三軸コイルを示しています。 <ol><li>そのプローブ三軸コイルに挿入された3軸磁力計、オンにします。 </li><li>コンピュータの電源をオンにし、データが3軸磁気センサから収集することを可能にする磁力計のソフトウェアを起動します。 </li><li> GMFの大きさを計算するために、磁力によって報告された部品の値を使用してください。例えば、磁力計値で：BXは6.39μTを=で= 36.08μT、Bzが= 20.40は、以下の式を使用して、μT41.94の電界強度を計算するμT：B = B GMF + B の追加 、ここでB の追加 =（Bxを2 + 2 +のBz 2）1/2（ すなわち、この例では 41.9μT。） </li><li> 3 couplに接続された各1：（0-8V / 5Aおよび0-20V / 2.5A、50Wのデュアルレンジ）3つのDC電源をオンにしますヘルムホルツコイルのESとGPIB接続（ 図1B）を介してコンピュータに接続されています。 </li><li>電源のセ​​ット電圧が反転磁界ベクトルと所望の磁場を発生させます。例えば、ステップ1.3で、ここでは説明計装のコイルサイズであるB GMFと、V新しい結果Bを生成するために、X = 0.00 V、V yを= 30.52 V、VのZ = 0.00 Vに電圧を設定します= B GMF + B 三軸コイル =（6.38、-36.08、20.39）μTは。 すなわち、BのGMFと同じ大きさで新しいフィールドが、異なる方向を指しています。 </li><li> 1.3で説明した手順を使用して、磁力計ソフトウェアで新しいフィールドを確認してください。 </li><li>通常の両方に植物をさらすと、セクション2で説明したようにペトリ皿を使用して、GMF条件を逆転させました。 </li><li>等しいフィールドの大きさを維持することによって、偽曝露実験を行います| B GMF |そして、維持垂直GMFと同等のフィールドの構成要素が、フィールド反転状態に比べて三軸コイル内の等しい電流と磁場の水平成分の方向（ すなわち、「北、東または西」）を変更します。 1.5で説明したように、コイルの電圧を変更することによってこれを行います。 注：この偽の露出は、潜在的な微妙な加熱またはいずれかのコイル自体またはコイルを制御するために使用される電子機器からの振動の影響を除外。 </li><li>人員実験の残りの部分を実行し、および/またはデータを解釈するから盲目にフィールド条件を適用することにより、二重盲検試験を実行します。 </li></ol>植物材料と植物生育の条件の作製<ol><li> 5％（w / v）の次亜塩素酸カルシウム溶液および0.02％（v / v）のトリトンX-で処理することによって滅菌1.5 mlのチューブ表面にその後シロイヌナズナ 、コロンビア生態型0（COL 0）の種、場所を使用連続振とうしながら25〜28℃で10〜12分間、80％エタノール（エタノール）、100。その後、100％エタノールで洗浄し、80％EtOHで二回洗浄し、最終的に滅菌蒸留水で洗い流してください。 </li><li>追加することで、メディアを変更しムラシゲ・スクーグ22（MS）の1リットルを準備し、MSの2.297グラム（0.5×MS基礎塩混合物）、10gのスクロース、1 L、KOHでpH調整5.8から6.0への脱イオン水を上に。 20分、120℃のために寒天、オートクレーブの16グラムを追加します。 </li><li>固化する前に、各（120×120ミリメートル2）正方形のペトリ皿に培地80ミリリットルを注ぎます。プレートに30無菌種をまく、その後、ワックス状フィルムでプレートを密封します。 </li><li>発芽を増強し、同期させるために4℃で2日間暗闇に水平プレートを開花結実を促進する、その後、正常またはGMFを逆のいずれかにペトリ皿を公開します。 </li><li>三軸コイル内部の3軸コイルの外側の両方の並行実験で垂直位置で22℃の気候制御された環境で種子を公開ナトリウム蒸気ランプを使用して、8時間の闇と16時間の光の光周期スケジュール、下の（220×10 -6のEメートル-2秒-1）。ランプの赤色成分を低減するためにスポットライトの青のゼラチンフィルムを使用してください。 </li><li>通常の（コントロール）と逆転（治療）の両方GMF条件にRNA抽出前に10日間の植物を公開します。 </li><li>露光後、ペトリ皿の写真を撮ります。 </li><li>根長と葉面積を計算するためにImageJソフトウェアを使用してください。 <ol><li>簡単に言うと、その後、ペトリプレートの画像を開いて、正確にプレート側を横切る線を引くための「ストレート」ラインオプションを使用して、ペトリプレートの側面を測定します。 </li><li> 「分析」メニューの「設定スケール」を選択し、「既知の距離」ボックス（例えば、120ミリメートル）は、長さ（mm）の単位を挿入実際の距離を挿入します。最終的にはすべての測定の設定が利用できるようにする「グローバル」オプションをクリックします。 </li><li>カンガルーのためにトン長、フリーハンドツールを使用して慎重にルートの形状に従ってください。 「分析」メニューの「測定」オプションを使用して長さを測定します。画像内のすべての根を測定し、さらに統計分析のために、ファイルを保存し続けます。 </li><li>葉面積については、「イメージ」メニューから調整オプションし、「カラーしきい値」を使用します。個々の葉を選択し、「分析」メニューの「粒子を分析する」を選択します。統計分析のための個々の測定値を保存します。 </li></ol></li></ol> 3. シロイヌナズナ全RNA抽出、定量的リアルタイムPCR（定量PCR）反応条件とシロイヌナズナのためのプライマー<ol><li>別途30芽や根30を収集し、直ちに液体窒素中で凍結します。その後、乳鉢と乳棒を用いて液体窒素中で粉砕します。 </li><li>機械製造を使用して精製キットおよびRNaseフリーDNase処理キットを用いて全RNAを単離しますERの指示。 </li><li>製造業者の指示に従ってRNAナノキットおよびキャピラリーゲル電気泳動を使用して、サンプルの質と量を確認してください。分光光度法でRNAの定量を確認してください。 </li><li>製造業者の推奨に従って、第一鎖cDNAを得るために、cDNAを逆転写キットを用いて全RNAおよびランダムプライマーを2μgを使用してください。 </li><li>内部の負荷標準としてROXとサイバーグリーンを用いたリアルタイムシステム上のすべての実験を行います。 </li><li> 2X SYBRグリーン定量PCRマスターミックス12.5μlの、cDNAの0.5μlの100 nMのプライマーからなる混合物を25μlで反応を実行します。 表1に列挙されたプライマーを使用してください。（ゲノムDNA汚染を監視するために逆転写することなく、全RNAを使用して）コントロール非RTコントロールと非テンプレートコントロール（水の代わりに、テンプレート）に含めます。 </li><li>標準を使用して全てのプライマー対のためのプライマーの効率を計算します曲線法23。 </li><li> CRU3、COTP1、RRTF1：以下のPCR条件を使用してください。 95℃で10分間、95℃、58℃で30秒間、および72℃で30秒で15秒を40サイクル; UBP6、eEF1Balpha2、ACT1、GAPC2、CAT3、TAPX、APX1、RbohD、FeSOD1 10分95℃で、95°C、57°Cで20秒間、および72℃で30秒で15秒の40サイクル。 </li><li>各アニーリングおよび伸長段階の後、蛍光をお読みください。すべての実行のために、熱プロファイルで解離セグメントを含むことにより、55〜95℃の融解曲線分析を行います。解離プロファイル（温度の関数としての蛍光のプロット）を表示するには、[結果]タブを介してアクセス解離曲線画面を使用します。実験の解離セグメント間に収集されたデータセットが分析/セットアップ画面を使用して、分析のために選択されていることを確認します。 </li><li> Lを決定します3つの技術反復24,25で分析三つの独立したRNA抽出物からのcDNAを用いて10倍希釈系列（1〜3〜10倍）を行うことにより、閾値サイクル値（Ct値）に鋳型濃度の範囲inear。 </li><li> Ct値を得るために、リアルタイムPCR機器ソフトウェアですべての増幅プロットを分析します。キャリブレーションとしては、次の最高のハウスキーピング遺伝子のレベルと相対的RNAレベルを正常化：3.11.1）[結果]タブを介してプロット画面で増幅にアクセスし、データを分析選択/設定画面を使用して分析する必要のあるランプや高原を選択し、してから、コマンドパネルの蛍光メニューからDRN（ベースライン補正された正規化された蛍光）を選択します。サンプル値は、サンプリングされたウェルについてのCt値を表示するには、[結果]タブを介してスクリーンプレートにアクセスします。 </li><li>四つの異なる参照遺伝子を使用して[例えば、 細胞質のグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、（GAPC2）、ユビキチンspecifICプロテアーゼ6（UBP6）、Actin1（ACT1）と伸長因子1（b）のαサブユニット2（eEF1Balpha2）]は、リアルタイムPCRの結果を正規化します。解析ソフトウェア26を用いたトップランクの遺伝子を選択します。そして、標準化のために最も安定した遺伝子を使用しています。 <ol><li>簡単に言えば、遺伝子名およびサンプル名を含む最初の行を含む最初の列でExcelシート上の入力データを整理します。次に、メニューバーから解析ソフトウェアを選択します。入力データを選択するためのダイアログボックスを使用します。 </li><li>次に、フィールドにサンプル名、遺伝子名と簡単な出力だけをチェックします。解析を実行するGoボタンをクリックします。最も安定に発現候補遺伝子として（最小安定性値を有する）トップランクの遺伝子を選択します。 </li></ol></li><li>芽と根の両方の差動倍数変化の発現を示すことにより、プロットデータ。 </li></ol> 4.統計分析<ol><li> ±標準誤差平均値などのデータを表現。共同の比較ntrolと分散分析（ANOVA）およびボンフェローニとダン・シダック調整確率検定（0.95パーセントの信頼）とTukeyのテストの分析を行うことで、治療群。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

我々は最近、驚くべき相関がGMFの反転および家族被子植物の系統のほとんどの転換が2に発生した時間の間に存在することを示しました。しかし、刺激仮説多様GMF強度の効果に関する研究の過多にもかかわらず、GMF反転自体が植物遺伝子発現および形態に有意な変化を誘導する可能性があるという仮定が実証されていません。ここでは、初めて我々の研究室でGMFを逆にする三軸八角形のヘルムホルツコイルを使用し、周囲の磁場の反転が表現型の変化や植物における遺伝子発現の調節を引き起こす可能性があることを方法を示しています。 植物成長実験（2×2×2 m 3で）のに十分な量の上GMF反転（または変更）を得るために、我々は、八角形のヘルムホルツコイルシステムを構築しました。このシステムは、（通常、ヘルムホルツコイルがリング状であり、小さい方）市販されていませんそして、建設のためのコストがかなりありました。重要なことは、このシステムが変更された磁場中で例外的な時間の安定性と均一性で、堅牢なフィールドの変更を実現します。 システムは正常な状態の千にGMFの値を小さくしたり、磁場の3次元のいずれかを逆転させるために設計され、構築されています。しかしながら、コイルの設計は、高い磁場強度を生成することはできません。したがって、本形態では、この器具は、植物または他の生物に高磁場強度の効果を評価するために設計した実験には適していません。 研究室では、この方法に記載したものと同様のGMFの変化は、磁場を外れると、金属自体の中でそれらを濃縮する高透磁率を有する強磁性金属板によって実験ゾーンを囲むことによりシールドを含む、様々な方法によって得られました。目ヘルムホルツコイルを使用しての電子の利点は、システムは、このようにそれだけでなく、in vitro試験のための（ペトリ皿の使用と同様に）理想的なだけでなくなって、植物がより自然条件（光、空気循環等 ）にさらされることを可能にすることですインビボでの植物の成長及び発達実験のため。我々のシステムの寸法は、このようにいくつかのペトリ皿またはいくつかの小さなをホストできるように、（ 図1Aを参照してください ）25×25×25 cm 3の球状の体積全体の自然GMFの&lt;1 /第千まで抑制することができるスペースを作成植物の成長のためのポット。 ここに提示される方法は、生物学の研究を植物に適用されてきました。しかし、このシステムは、ウイルス学や微生物学だけでなく、線虫の研究（例えば、 線虫（Caenorhabditis elegans））、（マウスおよびラットを含む）節足動物や小動物などの実験の広い範囲を、可能にします。 GMFの反転が可能であるという仮説のため、テスト形態学的および転写の変化を誘発することもあっても、ヒトの細胞に、おそらく最終的に、多くの他の生体系に拡張することができます。 GMFは、常に変化と変動しています。したがって、我々の実験で一つの主要な課題は、所望の新しいGMF値を得るために、GMFの一定の補償を提供することにあります。これは、磁力値及び電圧補償の読み取りを介して磁界値を連続的に制御することによって達成することができます。したがって、システムはGMFのゆっくりと変化する部​​分を補うことができますが、それは、より高い周波数の変動を何もしません。 結論として、GMFベクトルを逆にする三軸コイルの使用は、GMFベクトルのこの逆転は、植物形態学的変化と差動遺伝子発現を誘導することができることを実証するために尽力しました。提示される方法を用いて得られた結果は、仮説GMF再を支持する説得力のある証拠を提供しますversalsは、地質学的時間スケール2の上に植物の進化のための原動力の一つとなっている可能性があります。

地球の磁場（または同等地磁気、GMF）は植物を含む地球に住むすべての生物のための避けられない環境因子です。 GMFは、常に地球の自然の特徴となっているので、進化の過程で、すべての生物は、その作用を経験しました。証拠の増加体は、GMFは、多くの生物学的プロセスを1に影響を与えることができることを示しています。 GMFは、一様ではなく、地球の表面で、その大きさと方向を大幅に地元の違いがあります。地球の表面のGMFは30未満、μTから約70μTに至るまで、大きさの広い範囲を示しています。 GMFは、磁気圏2を介して 、その荷電粒子の大部分を偏向させることにより太陽風の致死効果から、地球とその生物圏を保護します。 植物は環境刺激に応答します。そして、このような光や重力などの非生物的要因への古典的な応答は、トンでしたhoroughlyいわゆる屈光性​​や重力屈性応答を定義することによって説明。非常に少ない、または何も、このトピックに公開され、最近では1件の論文の過多にもかかわらず、知覚と磁場に対する植物の応答のメカニズムに知られています。重力場とは違って、GMFは、それによって、最近、最終的に植物の多様化と分化2に貢献する潜在的な駆動力と考えられてきた重要な非生物的ストレス要因を表す植物進化の間に一貫して変化しました。地磁気逆転（またはエクスカーション）はGMFの極性が変化しています。地球の生命を歴史の中で、GMFの反転は数回発生しました。これらは、すべての極性遷移の間に減少GMF強度の期間に惑星を露呈しました。一部の著者は、低GMF強度のこれらの遷移期間は、それによってAを誘導する、太陽風からの電離放射線は地球の表面に到達させたかもしれないという仮説を立てています最終的には植物の進化2につながる遺伝子変化を誘導するのに十分な強されている可能性が生物への一貫したストレス、。 植物における磁場の効果を説明した実験の詳細な分析は、妥当な生物物理学的相互作用機構の不足により特徴付けられる相反する多数のレポートを示します。他の人は最終的に、3を説得している、検証可能な仮説を欠き、一方で多くの実験は、単に非現実的です。過去数年にわたり、植物の磁場の影響に関する研究の進捗状況とステータスが2,4-11を検討されています。最近では、両方の低域と高磁場の影響を完全に植物の進化2のGMF反転イベントの関与に特に焦点を当てて、1を検討されています。 GMFの反転は、植物の進化に影響を与えるという仮説を実証するための最も直接的な手段GMFを合成することです正常な、逆磁場条件に対する植物の応答を試験することにより実験室で逆転。仮説を検証するために、我々は、したがって、正確に通常のGMF条件を逆転させることができる三軸八角ヘルムホルツコイル対の磁場補償制度（三軸コイル）を、構築されました。 我々は、モデル植物としてシロイヌナズナを用いて、我々はいくつかの重要な遺伝子の遺伝子発現に対する逆GMFの効果テスト： ルシフェリン3（CRU3）、チロシンリン酸化され、そのリン酸化状態が対応して変調された12S種子貯蔵タンパク質をコードしますシロイヌナズナの種子 12,13におけるABAへ。土壌Cuの取得と花粉の開発14において支配的な機能を持つ重金属輸送/解毒スーパーファミリータンパク質をコードしている銅交通Protein1（COTP1）;そして、 レドックス応答性転写Factor1（RRTF1）、すなわち、ERF（エチレン応答因子）サブファミリーB-3遺伝子発現経路の相乗的な共活性化を促進し、非生物的および生物15の応力に交差耐性を与える1 AP2ドメインを含むERF / AP2転写因子ファミリーのメンバーをコードします。 （O 2 - ）と水（H 2 O）、過酸化水素（H酵素的に、迅速にスーパーオキシドアニオンに変換する細胞質酵素をコードしたFeスーパーオキシドDismutase1、（FSD1）：また、我々はまた、酸化ストレス応答に関与する5つの遺伝子を分析しました水と酸素17,18へのH 2 O 2分解を触媒 Catalase3（すなわち、コードすることCAT3）、および酵素; 2 O 2）、酸素分子（O 2）16 Thylakoidalアスコルビン酸ペルオキシダーゼ（TAPX）、符号化しH 2 Oを捕捉する葉緑体チラコイドペルオキシダーゼ2 19; H 2 O 2を捕捉すると、NO-20由来の分子によって媒介される翻訳後修飾の潜在的な標的の一つを表すサイトゾルペルオキシダーゼをコードしているアスコルビン酸Peroxidase1（APX1）は 、 O 2を生成する酵素エンコードNADPH- 呼吸バーストオキシダーゼタンパク質D（RbohD） -とシロイヌナズナ21の成長、開発、ストレス応答の調節に重要な役割を果たしているが。 我々のフィールド反転方法はGMF反転がAの形態および遺伝子発現の有意な変化を誘導し得るという最初の証拠を提供しますシロイヌナズナの根と芽。このプロトコルは、植物形態学および遺伝子発現に対するGMF反転の効果を評価するための革新的な方法を提供し、プラントの動作の他の側面にGMF反転の潜在的な影響を評価するために使用することができ、それによりROの議論を導きます植物の進化のGMF逆転のル。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>three-axis magnetometer</td>
			<td>Bartington&#160;</td>
			<td>Mag-03MC</td>
			<td>triaxial fluxgate magnetometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetometer power supply</td>
			<td>Bartington&#160;</td>
			<td>Mag-03PSU</td>
			<td>triaxial fluxgate magnetometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetometer software</td>
			<td>Bartington&#160;</td>
			<td>Mag03DAM</td>
			<td>triaxial fluxgate magnetometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power supply&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>E3642A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hypochlorite&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>211389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GroLux Sodium vapor lamps&#160;</td>
			<td>OSRAM Sylvania</td>
			<td>600W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plant RNA kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2938B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mx3000P</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Fermentas International, Inc</td>
			<td>K0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog Basal Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5519&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish square (120x120)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z692344&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

geomagnetic field (gmf) and plant evolution: investigating the effects of gmf reversal on arabidopsis thaliana development and gene expression

植物の進化の中で最も刺激的な観察の一つは、地球磁場の発生（GMF）逆転（またはエクスカーション）と被子植物の放射の瞬間との間の相関です。これは、GMFの極性の変化が植物の進化において役割を果たし得るという仮説につながりました。ここでは、人工的にGMF条件を逆にするシロイヌナズナを暴露することによって、この仮説を検証する方法を説明します。我々は、三軸磁力計を使用し、収集されたデータは、GMFの大きさを計算するために使用しました。 3つのDC電源装置は、3つのヘルムホルツコイル対に接続され、GMF条件を変更するために、コンピュータによって制御しました。ペトリプレートで生育した植物は、通常の両方に暴露し、GMF条件を逆転しました。シャム曝露実験も行いました。露出された植物は、実験中に撮影され、画像は、根長と葉の面積を計算するために分析しました。シロイヌナズナ全RNAを抽出し、定量しましたリアルタイムPCR（定量PCR）は、 ルシフェリン3（CRU3）、銅輸送protein1（COTP1）、レドックス応答性転写Factor1（RRTF1）、鉄スーパーオキシドジスムターゼ1（FSD1）、Catalase3（CAT3）、Thylakoidalの遺伝子発現分析を行いましたアスコルビン酸ペルオキシダーゼ（TAPX）、細胞質ゾルアスコルビン酸Peroxidase1（APX1）、および NADPH /呼吸バーストオキシダーゼタンパク質D（RbohD）。四つの異なる参照遺伝子は、定量PCRの結果を標準化するために分析しました。 4つの遺伝子の最良を選択し、正規化のための最も安定した遺伝子を使用しました。我々のデータは、三軸コイルを用いGMFの極性を反転することは、植物の成長および遺伝子発現に対する有意な効果を有することを初めて示しています。これは、最終的にはPにつながる、より高い選択圧を正当化する可能性がGMF反転が植物の発育の変化を誘導することに貢献するという仮説を支持しますLANT進化。

このプロトコルの目的は、時セットGMFを逆転するために使用され、図1（a）に示すように地球磁場（GMF）の反転は、植物発育及びシロイヌナズナ生態型コル0三軸コイルの遺伝子発現に影響を及ぼし得るかどうかを評価する方法を提供することにありますプロトコールのステップ1.5で説明したように適切な駆動電圧（ 図1B）と、得られます。三軸コイルの寸法は、いくつかのペトリ皿をホストする逆GMF条件に十分なスペースを可能にした〜2×2×2メートル3、です。コントロールは、同じ環境条件で、通常のGMF値で増殖させました。 GMF条件ノーマルへの曝露の10日後に、逆に、植物の表現型は明らかに形態変化を示しました。 図2に示すように 、（通常のGMF条件下で増殖させ、すなわち 、）コントロール植物は、有意（ダン-シダック及びボンフェローニの調整度Prob &lt;0.001で根の長さを示しました。逆GMFにさらされる植物に対する（17.53ミリメートルで、N = 32）;スチューデントのt = 10.68、DF = 31）より高い値（29.41ミリメートル; SEM = 1.04、S​​EM = 0.58; N = 36）。 GMF-逆転植物では、芽の形態はまた、リーフレット拡大の減少発展を示すことによって変更されました。スチューデントのt = 31.32、DFを、逆GMF条件にさらされる植物は度Prob = &lt;0.001を調整ダン・シダックとボンフェローニ（大幅に示したのに対し、正常な状態にさらされた植物は、4.95ミリメートル2（SEM 0.025、N = 54）の平均葉面積を示しました= 53）下葉面積値（3.71ミリメートル2、SEM = 0.032; N = 54）。したがって、逆GMF条件にシロイヌナズナの露出は根長と葉面積の両方の減少を誘導しました。 葉の拡大と根の成長は、分裂、細胞27の伸びの両方に依存しています。したがって、植物の開発、生産性と全体的なフィットネスは、最適なshoot-とルートシステムアーキテクチャに依存しています&lt;SUP&gt; 28。縮小根長と逆GMF条件にさらされる植物の葉の大きさは、磁場強度の変動を認識するだけでなく、重力に比べて磁界の変化を「方向」に応答することができる検出システムの存在を示します。 GMF反転が植物の成長に影響を与える可能性があるという仮説は、GMF反転条件が大幅に植物の発育に影響を与えることができることを実証する実験において、説得力のある証拠を見つけます。 形態学的変化は、遺伝子発現の変化を伴っていました。ハウスキーピング遺伝子の中で、最も安定した遺伝子は、 伸長因子1（b）のアルファサブユニット2であった 。遺伝子の最初のグループ（CRU3、COTP1、RRTF1）は 、遺伝子発現（ 図3）の劇的な変化を示しました。すべての3つの遺伝子の発現が有意に準備にさらされる植物では約2.5倍（P &lt;0.05）増加したシュートD GMF条件。 CRU3のルート式は逆GMF条件においてダウンレギュレートした（P &lt;0.05）、通常のGMFの条件にさらされた植物で根においてアップレギュレートされ、有意でした。反対は、通常の状態でダウンレギュレートし、GMFの逆転（ 図3）の存在下でアップレギュレートされたCOTP1とRRTF1、見つかりました。 ルシフェリン（12 Sグロブリン）は、Aの種子中で最も豊富な貯蔵タンパク質でありますシロイヌナズナや他のアブラナとは、粗面小胞体内の前駆体として合成されます。次いで、これをタンパク質貯蔵液胞13に搬送されます。苗の発芽は、窒素の初期ソースとして使用されるルシフェリンの内訳を、必要とします。ダウンレギュレーション劣化をルシフェリンの細胞構造や細胞成分の開発29,30を損なうことにより、胚の発生を低減します。我々の結果は、CRU3のアップレギュレーションはと相関することを示していますこのようにして下葉の拡大と縮小根長、G​​MF反転に敏感で、この遺伝子れ、その過剰発現が植物の発育の低減に寄与し得ることを示しています。また、GMF反転が減少根の長さと相関根におけるCRU3の大幅なダウンレギュレーションを誘導します。銅は植物中の主要プロセスに不可欠な補因子であるが、それは過剰に有害な効果を発揮します。したがって、銅の輸送を過剰発現する植物の成長を損ないます。 GMFの逆転の効果は、このように減少し、植物の成長を説明する、シュートおよび根の両方におけるCOTP1の有意な過剰発現がありました。イオン応力がしっかり細胞の酸化還元状態にリンクされている葉緑体の代謝を損ないます。シロイヌナズナで転写因子RRTF1は、酸化還元に調整する能力31を変更するには、関連する遺伝子の発現のために重要です。したがって、植物は、その生理学的および開発を変えることができる外部刺激にさらされているときアルプログラムは、この重要な転写因子の過剰発現が期​​待されます。 GMFの逆転は、このように逆GMF条件に対する植物の高い酸化ストレス応答を示し、芽と根の両方でRRTF1の大幅な過剰発現を誘導しました。 興味深い結果は、酸化ストレスに関与する5つの遺伝子を解析することにより得られます。植物が正常に成長又はGMF条件（ 図4、図5）を逆転したときに一般的には、芽で抽出し、分析した全ての遺伝子が有意差（P&gt; 0.05）を示さありませんでした。しかし、かなりのダウンレギュレーションは、常に逆GMF条件にさらされる植物の根において観察されました。特に、CAT3が最高のダウンレギュレーション（ 図5）を示した （ 図4）APX1、FSD1、RBOHDとTAPXによってダウンレギュレーションのために続きます。 にクロス寛容生物的および生物的ストレスは、いくつかの生化学的経路に関与する種々の遺伝子の活性化によって提供される。RRTF1転写因子は、これらの経路15,31の遺伝子発現の相乗的な共活性化を促進し、そして潜在的に酸化ストレス32に関与することができます。脱酸素が ​​減少したときしたがって、RRTF1のアップレギュレーションが期待されます。ルート捕捉酵素のダウンレギュレーションは、増加した酸化ストレスに応答して作用するRRTF1のアップレギュレーションと相関します。 CAT3、APX1とTAPXの劇的なルートダウンレギュレーションは、FSD1のダウンレギュレーションにより、スーパーオキシドアニオンをdismutate能力の低下を伴って、H 2 O 2を 、捕捉する根細胞の減少能力を示します。酸化ストレス応答は逆GMF知覚の主要な部位であると思われるルーツが高いです。 図1.地磁気補償システム 。 （A）三軸コイル（3直交軸のそれぞれに八角形のコイル対を含む）は、地磁気ベクトルを逆にするために使用されます。 （B）は、コンピュータ制御された電源は、ヘルムホルツコイルの各対に接続されています。 （図中の電圧は任意である<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig1large.jpg" target="_blank">）、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig2.jpg" /> 図シロイヌナズナの形態の地磁気逆転の2影響 。曝露の10日後、対照植物（ すなわち 、通常のGMF条件に暴露されたもの）は、著しく大きな根長、よりEXPANを表示逆GMF条件に曝露した植物と比較DEDリーフレット。メトリックバー= 18ミリメートル。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig3.jpg" /> 図シロイヌナズナ遺伝子発現に対する地磁気逆転の3影響 。曝露の10日後、対照および処理した植物の総RNAを抽出し、発現分析のためにリアルタイムPCRによって分析しました。 GMFの逆転の効果を試験した全ての遺伝子の遺伝子発現の急激な変化を誘導することであったCRU3、ルシフェリン3;。COTP1、銅輸送Protein1; RRTF1、レドックス応答性転写Factor1。バーは標準誤差を示します。アスタリスクは、PLとの間に有意な（P &lt;0.05）の違いを示し、逆および通常のGMF条件に暴露アリ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig4.jpg" /> 図シロイヌナズナ抗酸化関連遺伝子の発現に地球磁場逆転の4影響 。曝露の10日後、対照および処理した植物の総RNAを単離し、リアルタイムPCRを用いた遺伝子発現解析のために用いられます。 GMFの反転の効果がシュート遺伝子発現に有意な変化を誘発しないことでした。しかし、大幅なダウンレギュレーションが逆転GMF条件の下で栽培された植物の根の遺伝子発現で観察されたTAPX、Thylakoidalアスコルビン酸ペルオキシダーゼ ; APX1、アスコルビン酸Peroxidase1; FSD1、鉄スーパーオキシドDismutase1; RbohD、NADPH /呼吸バーストオキシダーゼタンパク質Dバーは標準誤差を示します。アスタリスクは逆に、通常のGMF条件にさらされた植物との間に有意な（P &lt;0.05）の違いを示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig5.jpg" /> 図シロイヌナズナカタラーゼ3（CAT3）遺伝子発現に対する地磁気逆転の5影響 。曝露の10日後、対照および処理した植物の総RNAを単離し、リアルタイムPCRを用いた遺伝子発現解析のために用いられます。 GMFの反転の効果がシュート遺伝子発現に有意な変化を誘発しないことでした。しかしながら、急激なダウンレギュレーションが逆GMF条件下で成長した植物の根の遺伝子発現で観察されました。バーは標準ERROを示しますR;アスタリスクは逆に、通常のGMF条件にさらされた植物との間に有意な（P &lt;0.05）の違いを示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

地磁気（Gmfと）と植物の進化：Gmfと逆転の影響に関する調査を<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;開発と遺伝子発現

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

geomagnetic-field-gmf-plant-evolution-investigating-effects-gmf

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

13.0K ビュー.  University of Turin. This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

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Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

エレクトロポレーションによりマウス胎児蝸牛外植の文化と遺伝子導入

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

発生生物学

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

糖尿病性角膜症のためのアデノウイルス遺伝子治療：ヒト臓器培養角膜と​​輪部上皮細胞における創傷治癒に及ぼす影響と細胞マーカーの発現を幹

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

脊索動物における胚のマイクロインジェクションやエレクトロポレーション<em&gt;カタユウレイボヤ</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

根および胚軸発達の長期共焦点イメージングのための単純なチャンバー

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

シロイヌナズナの胚発生の特性評価法

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

体外受精卵の Live 細胞イメージング偏光とシロイヌナズナの胚パターン形成の胚珠培養

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday products. They are classified as endocrine disrupting compounds (EDC) with estradiol-like properties. Long-term exposure to EDCs, even at low doses, has been linked with various health defects including cancer, behavioral disorders, and infertility, with greater vulnerability during early developmental periods. To study the effects of BPA on the development of neuronal function, we used an in vitro neuronal network derived from the early chick embryonic brain as a model. We found that exposure to BPA affected the development of network activity, specifically spiking activity and synchronization. A change in network activity is the crucial link between the molecular target of a drug or compound and its effect on behavioral outcome. Multi-electrode arrays are increasingly becoming useful tools to study the effects of drugs on network activity in vitro. There are several systems available in the market and, although there are variations in the number of electrodes, the type and quality of the electrode array and the analysis software, the basic underlying principles, and the data obtained is the same across the different systems. Although currently limited to analysis of two-dimensional in vitro cultures, these MEA systems are being improved to enable in vivo network activity in brain slices. Here, we provide a detailed protocol for embryonic exposure and recording neuronal network activity and synchrony, along with representative results.

Exposure to environmental toxins can acutely impact developing embryos. Endocrine disrupting chemicals such as bisphenols are known to adversely affect the nervous system. Here we describe a protocol using an in vitro vertebrate (chick embryo) neuronal network model to study the functional impact of toxin exposure on early embryos.

ホルモン多電極アレイを用いた脊椎動物の神経回路網関数の開発化合物の影響の評価

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

全体マウント クリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

遺伝子発現解析のためのマウス胚軟骨と骨のレーザー捕捉微小分片

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

細胞型特異的スケールでのシロイヌナズナ・タリアナの開発を調査するためのリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...