This work was supported by a grant to MEM from the Dept. of Life Sciences and Systems Biology of the University of Turin, Italy. The authors thank G. Gnavi for technical assistance during some experiments. CTR is funded by the Wellcome Trust and the Royal Society (Grant Number 098436/Z/12/Z).

1. Einstellung der Triaxial Coils ANMERKUNG: Abbildung 1 zeigt die für die GMF Rückwärts triaxiale Spulen. <ol><li> Einschalten des Drei-Achsen-Magnetometer, dessen Sonde in die triaxiale Spulen eingesetzt ist. </li><li> Schalten Sie den Computer und starten Sie die Magnetometer-Software, die Daten, die von Drei-Achsen-Magnetometer gesammelt werden können. </li><li> Mithilfe der Komponentenwerte des Magneto gemeldet, um die Größe des GMF berechnen. Zum Beispiel mit Magneto Werte: Bx = 6,39 &amp; mgr; T, By = 36,08 &amp; mgr; T, Bz = 20,40 &amp; mgr; T zu berechnen einer Feldstärke von 41,94 &amp; mgr; T unter Verwendung der folgenden Gleichung: B = B GMF + B zusätzliche, wobei B zusätzliche = (Bx 2 + durch 2 + Bz 2) ½ (dh 41,9 &amp; mgr; T im Beispiel.) </li><li> Schalten Sie die drei DC-Stromversorgungen (dual Bereich: 0-8V / 0-20V 5A und / 2.5A, 50W) jede 1-3 coupl verbundenes Helmholtz-Spulen und an einen Rechner über eine GPIB-Verbindung (1B) verbunden ist. </li><li> Set Spannungen der Netzteile, um das gewünschte Magnetfeld mit einer umgekehrten Magnetfeld-Vektor zu erzeugen. Zum Beispiel mit B GMF wie in Schritt 1.3 und mit der Spulengröße des hier beschriebenen Instrumente, setzen Sie die Spannungen V x = 0,00 V, V y = 30,52 V, V z = 0,00 V, um eine neue resultierende B zu erzeugen = B + B GMF triaxiale Spulen = (6,38, -36,08, 20,39) &amp; mgr; T. dh ein neues Feld mit der gleichen Größenordnung wie B GMF sondern zeigt auf eine andere Richtung. </li><li> Stellen Sie sicher, das neue Feld mit dem Magnetometer-Software unter Verwendung der in 1.3 beschriebenen Verfahren. </li><li> Expose Pflanzen zu normalen und umgekehrt GMF Bedingungen unter Verwendung Petrischalen, wie in Kapitel 2 beschrieben. </li><li> Führen Schein-Expositions-Experimente, indem sie die Größe des Feldes gleich | B GMF | und Haltungdie vertikale Komponente des Feldes gleich der des GMF jedoch unter Veränderung der Richtung (dh &quot;Nord, Ost oder West&quot;) der horizontalen Komponente des Feldes mit gleichen Strömen in den triaxialen Spulen im Vergleich zu der Feldumkehr Zustand. Dies geschieht durch Änderung der Spannung der Spulen, wie in 1.5 beschrieben. Hinweis: Diese Schein-Exposition schließt potentielle subtile Heizung oder Schwingungseffekte entweder die Spulen selbst oder von den verwendeten, um die Spulen Steuerelektronik. </li><li> Laufen Doppelblindversuchen, indem Feldbedingungen vom Personal geblendet Führen des Rests der Experimente und / oder der Interpretation der Daten. </li></ol> 2. Herstellung von Pflanzen Materialien und Bedingungen für das Pflanzenwachstum <ol><li> Verwenden Samen von Arabidopsis thaliana Ökotyp Columbia 0 (Col 0), setzen dann in ein 1,5-ml-Röhrchen und Oberflächen sterilisiert durch Behandlung mit einer 5% (w / v) Calciumhypochlorit-Lösung und 0,02% (v / v) Triton X-100 in 80% Ethanol (EtOH), für 10-12 min bei 25-28 ° C unter kontinuierlichem Schütteln inkubiert. Dann spülen Sie zweimal mit 80% EtOH, wäscht mit 100% EtOH und schließlich mit sterilem destilliertem Wasser spülen. </li><li> Bereiten Sie 1 l Murashige und Skoog 22 (MS) modifiziertes Medium durch Zugabe von: 2,297 g MS (0,5 x MS Basal Salzmischung), 10 g Sucrose, VE-Wasser bis zu 1 l, pH 5,8 bis 6,0 mit KOH eingestellt. 16 g Agar Autoklavieren für 20 min, 120 ° C. </li><li> Vor der Verfestigung, gießen Sie 80 ml ​​Medium in jede (120 x 120 mm 2) Quadratisch Petrischalen. Säen dreißig sterilen Samen auf Platte, und dann Dichtungsplatten mit einer wachsartigen Film. </li><li> Vernalize die Platten horizontal in der Dunkelheit bei 4 ° C für 2 Tage, um eine Verstärkung und Keimung zu synchronisieren und dann Petrischalen ausgesetzt werden entweder in normaler oder umgekehrter GMF. </li><li> Aussetzen Samen in einer klimatisierten Umgebung bei 22 ° C in einer vertikalen Position in Parallelversuchen sowohl innerhalb der dreiachsigen Wicklungen und außerhalb der triaxiale Spulenunter einer Photoperiode von 8 h Zeitplan Dunkelheit und 16 Stunden Licht, mit Natriumdampfleuchten (220 x 10 -6 E m -2 s -1). Verwenden Sie einen blauen Gelatinefilm für Spotlight, um die Rot-Komponente der Leuchtmittel zu reduzieren. </li><li> Aussetzen Pflanzen für 10 Tage vor der RNA-Extraktion sowohl normalen (Kontroll-) und Umkehrung (Behandlung) GMF Bedingungen. </li><li> Nach der Belichtung fotografieren Petrischalen. </li><li> Verwenden Sie die ImageJ Software zur Wurzellänge und Blattflächen zu berechnen. <ol><li> Kurz gesagt, messen Sie die Seite der Petrischale, dann öffnen Sie das Bild der Petrischale und mit Hilfe der &quot;gerade&quot; Zeilenoption, um eine Linie, die genau durchquert die Plattenseite zu zeichnen. </li><li> Im Menü &quot;Analysieren&quot;, wählen Sie &quot;Skala&quot; und setzen Sie den tatsächlichen Abstand in der &quot;bekannte Strecke&quot; Box (zB 120 mm), legen Sie dann die Einheit der Länge (mm); Schließlich klicken Sie auf die &quot;globalen&quot; Optionseinstellungen zur Verfügung für alle Messungen zu machen. </li><li> Für root Länge, beachten Sie unbedingt die Form der Wurzel, indem Sie die Freihandwerkzeug. Messen Sie die Länge mit Hilfe der Option &quot;Maßnahme&quot; im &quot;Analyse&quot; Menü. Weiterhin alle Wurzeln auf dem Bild zu messen und speichern Sie die Datei zur weiteren statistischen Analysen. </li><li> Für Blattfläche, aus dem Menü &quot;Bild&quot; verwenden Sie die Option und dann &quot;Farbschwelle&quot; einzustellen. Wählen Sie die einzelnen Blatt und im Menü &quot;Analysieren&quot;, wählen Sie &quot;analysieren Teilchen&quot;. Speichern Sie die einzelnen Messungen für statistische Auswertungen. </li></ol></li></ol> 3. Arabidopsis Gesamt-RNA-Extraktion, quantitative Echtzeit-PCR (qPCR) Reaktionsbedingungen und Primer für Arabidopsis <ol><li> Getrennt sammeln 30 Triebe und 30 Wurzeln und sofort in flüssigem Stickstoff einfrieren. Dann mahlen in flüssigem Stickstoff mit Mörser und Stößel. </li><li> Isolieren der Gesamt-RNA mit einem Reinigungs-Kit und RNase-Free DNase-Behandlung-Kit mit Hilfe manufacturAnleitungen er ist. </li><li> Überprüfen Probe qualitativ und quantitativ unter Verwendung eines RNA-nano-Kit und Kapillargelelektrophorese nach Herstelleranweisungen. Bestätigen Sie die Quantifizierung von RNA spektrophotometrisch. </li><li> Verwendung 2 ug Gesamt-RNA und zufällige Primer unter Verwendung eines cDNA Reverse Transkription Kit zur Erststrang-cDNAs entsprechend den Empfehlungen des Herstellers erhalten. </li><li> Führen Sie alle Experimente auf einem Real-Time System mit SYBR Green I mit ROX als interne Lade Standard. </li><li> Führen die Reaktion mit 25 ul Mischung, bestehend aus 12,5 ul 2x SYBR Green qPCR Master Mix, 0,5 &amp; mgr; l cDNA und 100 nM Primer. Verwenden Sie die in Tabelle 1 aufgeführten Primer. Fügen Sie in der Kontrollgruppe nicht-RT Kontrollen (mit Gesamt-RNA ohne reverse Transkription, um Kontamination mit genomischer DNA zu überwachen) und Nicht-Template-Kontrollen (Wasser anstelle von Vorlage). </li><li> Berechnen Primereffizienz für alle Primer-Paare unter Verwendung des Standard-Kurvenverfahren 23. </li><li> Verwenden Sie die folgenden PCR-Bedingungen: CRU3, COTP1, RRTF1. 10 min bei 95 ° C, 40 Zyklen von 15 s bei 95 ° C, 30 sec bei 58 ° C und 30 sec bei 72 ° C; UBP6, eEF1Balpha2, ACT1, GAPC2, KW3, TapX, APX1, RbohD, FeSOD1 10 min bei 95 ° C, 40 Zyklen von 15 s bei 95 ° C, 20 sec bei 57 ° C und 30 sec bei 72 ° C. </li><li> Lesen Fluoreszenz nach jedem Anlagerungs- und Verlängerungsphase. Für alle Läufe, führen eine Schmelzkurvenanalyse 55-95 ° C, indem sie die Dissoziation Segment in dem Wärmeprofil. Verwenden Sie die Dissoziationskurve Bildschirm, durch die Ergebnisse Register zugegriffen wird, um die Dissoziation Profil (Plot der Fluoreszenz als Funktion der Temperatur) anzuzeigen. Stellen Sie sicher, dass die während der Dissoziation Segment des Experiments gesammelt Datensatz wird für die Analyse ausgewählt unter Verwendung der Analyse / Setup-Bildschirm. </li><li> Bestimmen Sie die linear Reihe von Template-Konzentration auf Schwellenzykluswert (Ct-Wert), indem eine zehnfache Verdünnungsreihe (1- bis 10 3 -fach) unter Verwendung von cDNA aus drei unabhängigen RNA-Extraktionen in drei technische Replikate 24,25 analysiert. </li><li> Analysieren Sie alle Verstärkungsgrundstücke mit der Real-Time PCR Instrument Software Ct-Werte zu erhalten. Kalibrieren und zu normalisieren relativen RNA-Spiegel mit dem Niveau der besten Haushaltsgenen wie folgt: 3.11.1) Besuchen Sie das Amplification Plots Bildschirm über die Registerkarte Ergebnisse, wählen Sie die Rampe oder Plateaus, für die Daten sollten mit der Siebanalyse Selection / Setup untersucht werden, und wählen Sie dann die DRN (basislinienkorrigierten normalisierten Fluoreszenz) von der Fluoreszenz-Menü auf der Bedientafel. Besuchen Sie das Kennzeichen Beispielwerte Bildschirm über die Registerkarte Ergebnisse, um Ct-Werte für die Stichprobe Brunnen anzuzeigen. </li><li> Können vier unterschiedliche Referenzgene [zB zytoplasmatischen Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPC2), Ubiquitin spezific Protease 6 (UBP6) Actin1 (ACT1) und der Elongationsfaktor 1B alpha-Untereinheit 2 (eEF1Balpha2)], um die Ergebnisse der Echtzeit-PCR zu normalisieren. Wählen Sie den bestplatzierten-Gen unter Verwendung eines Analyse-Software 26; und verwenden Sie die stabilste Gen für die Normalisierung. <ol><li> Kurz gesagt, organisieren die Eingangsdaten auf einem Excel-Sheet mit der ersten Spalte mit den Gen-Namen und erste Zeile mit den Probennamen. Dann wählen Sie die Analyse-Software aus der Menüleiste. Verwenden Sie das Dialogfeld, um die Eingangsdaten zu wählen. </li><li> Als nächstes überprüfen Sie die Felder Beispielnamen, Gennamen und einfach nur ausgegeben. Klicken Sie auf die Go-Taste, um die Analyse durchzuführen. Wählen Sie den bestplatzierten Gen als Kandidaten-Gen meisten stabil exprimiert (was die kleinste Stabilitätswert hat). </li></ol></li><li> Grundstücksdaten durch Nachweis unterschiedlicher Falte Änderung Ausdruck in beiden Sprossen und Wurzeln. </li></ol> 4. Statistische Analysen <ol><li> Express-Daten als Mittelwerte ± Standardfehler. Vergleichen Sie die Zusammenarbeitntrol und die Behandlungsgruppen durch Durchführen einer Varianzanalyse (ANOVA) und Tukey-Test mit Bonferroni und Dunn-Sidak Adjusted Wahrscheinlichkeitstest (0,95% Vertrauen). </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Wir haben kürzlich gezeigt, dass eine erstaunliche Korrelation zwischen GMF Wertaufholungen und der Zeit, als Abzweigung von den meisten der familiären Angiospermen Abstammungslinien aufgetreten 2 existiert. Doch trotz der stimulierenden Hypothesen und der Fülle von Studien über die Wirkung von verschiedenen GMF Intensitäten, die Annahme, dass GMF Umkehr kann selbst herbei signifikanten Veränderungen in Pflanzengenexpressions und Morphologie noch nie gezeigt worden. Hier zeigen wir zum ersten Mal ein Verfahren, das eine achteckige triaxial Helmholtz-Spule verwendet, um GMF in unserem Labor umzukehren, und daß die Umkehr der Umgebungsmagnetfeld phänotypischen Veränderungen und Modulation der Genexpression in Pflanzen verursachen. Um GMF Umkehr (oder Änderung) über ein ausreichendes Volumen für die Pflanzenwachstumsexperimente (2 x 2 x 2 m 3) zu erhalten, bauten wir einen achteckigen Helmholtz-Spulensystem. Dieses System ist nicht im Handel erhältlich (üblicherweise Helmholtzspulen sind ringförmig und kleiner)und die Kosten für den Bau waren beträchtlich. Wichtig ist, liefert dieses System robuster Feldmodifikation, mit außergewöhnlichen Zeit-Stabilität und Homogenität in den modifizierten Magnetfeldern. Das System ist so konzipiert und aufgebaut, um den Wert der GMF auf ein Tausendstel der normalen Bedingungen zu reduzieren oder um einen der drei Dimensionen des Magnetfeldes umzukehren. Allerdings ist der Entwurf der Spulen nicht erlauben, eine hohe magnetische Feldstärke zu erzeugen. Daher ist dieses Gerät in der vorliegenden Form nicht geeignet für Experimente entworfen, um die Wirkung der hohen magnetischen Feldstärke auf Pflanzen oder andere Organismen zu beurteilen. Im Labor hat die Veränderung des GMF ähnlich den in diesem Verfahren beschrieben durch verschiedene Verfahren gewonnen wurde, auch Abschirmung durch Umgeben der Versuchszone durch ferromagnetische Metallplatten mit hoher magnetischer Permeabilität, die Magnetfeldern abweichen und konzentriert sie im Metall selbst. The Vorteil der Verwendung von Helmholtzspulen ist, dass das System ermöglicht Pflanzen möglichst natürlichen Zustand (Licht, Luftzirkulation, etc.) ausgesetzt werden, so dass es sich nicht nur für in-vitro-Studien (wie bei der Verwendung von Petrischalen), sondern auch zur in vivo-Pflanzenwachstum und -entwicklung Experimenten. Die Abmessungen der unser System zu schaffen einen Raum, der eine Unterdrückung bis &lt;1 / 1.000 der natürlichen GMF ermöglicht über einen 25 x 25 x 25 cm 3 Kugelvolumen (siehe 1A), so dass mehrere Petrischalen oder eine kleine Gastgeber Töpfe für das Pflanzenwachstum. Die hier vorgestellte Methode zur Pflanzenbiologie Studien angewandt wurden; jedoch kann das System eine Vielzahl von Experimenten, darunter Virologie und Mikrobiologie, sowie Studien über Nematoden (zB Caenorhabditis elegans), Arthropoden und kleine Tiere (einschließlich Mäusen und Ratten). Daher Tests der Hypothese, dass die Umkehrung der GMF ist in der Lagezur Induktion morphologischer und Transkriptionsänderungen können auch auf viele andere lebende Systeme erweitert werden, möglicherweise letztlich sogar auf menschliche Zellen. Die GMF ändert sich ständig und schwankenden. Daher ist in unseren Experimenten eine große Herausforderung ist, eine konstante Vergütung des GMF, um die gewünschte neue GMF-Werte zu erhalten ist. Dies kann nur durch eine kontinuierliche Steuerung der Magnetfelder Werte durch Lesen des Magnetowerte und Spannungskompensation erreicht werden. Daher kann das System den langsam variierenden Teil des GMF zu kompensieren, aber es tut nichts zur höheren Frequenzschwankungen. Zusammenfassend war die Verwendung von triaxialen Spulen um die GMF Vektorumkehr instrumental zu demonstrieren, dass diese Umkehrung des GMF-Vektor ist in der Lage, Pflanzen morphologische Veränderungen und differentielle Genexpression zu induzieren. Die mit dem vorgestellten Verfahren erzielten Ergebnisse bieten eine überzeugende Beweise für die Hypothese, dass die GMF WiederVersalien könnte eine der treibenden Kräfte für die Pflanzenentwicklung haben über geologische Zeitskalen 2.

Das Magnetfeld der Erde (oder äquivalent das Erdmagnetfeld, GMF) ist eine unausweichliche Umweltfaktor für alle lebenden Organismen auf der Erde, einschließlich Pflanzen. Die GMF ist seit jeher eine natürliche Eigenschaft der Erde, so dass im Laufe der Evolution erlebten alle Lebewesen seine Wirkung. Liegen zunehmend Belege dafür, dass das GMF der Lage ist, viele biologische Prozesse 1 beeinflussen. GMF nicht einheitlich, und es gibt erhebliche lokale Unterschiede in der Größe und Richtung an der Oberfläche der Erde. Die GMF an der Erdoberfläche zeigt eine breite Palette von Größen, von weniger als 30 &amp; mgr; T, um fast 70 &amp; mgr; T. Die GMF schützt die Erde und ihrer Biosphäre von den tödlichen Auswirkungen der Sonnenwind durch Ablenken meisten seiner geladenen Teilchen durch die Magnetosphäre 2. Pflanzen reagieren auf Reize aus der Umwelt; und der klassischen Reaktionen auf abiotische Faktoren wie Licht und Schwerkraft haben t gewesenhoroughly durch Definition der sogenannten phototropen und gravitrope Reaktionen beschrieben. Sehr wenig oder gar nichts tun, wird über die Mechanismen der Wahrnehmung und Reaktionen von Pflanzen gegenüber Magnetfeldern bekannt, trotz der Fülle von Arbeiten zu diesem Thema veröffentlicht und vor kurzem überprüft 1. Anders als das Gravitationsfeld, änderte sich die GMF konsequent während der Pflanzenentwicklung damit einen wichtigen abiotischen Stressfaktor, der vor kurzem als eine potenzielle Antriebskraft letztlich einen Beitrag zur Diversifizierung und Artbildung 2 pflanzen darstellt. Feldumkehrung (oder Ausflüge) sind Änderungen der Polarität des GMF. Während der Lebensgeschichte der Erde, GMF Wertaufholungen kam mehrmals. Diese freiliegenden den Planeten zu Zeiten der reduzierten GMF Festigkeit bei jedem Polaritätsübergang. Einige Autoren haben die Hypothese aufgestellt, dass diese Übergänge Zeiten geringer GMF Stärke könnte erlaubt haben, ionisierende Strahlung aus dem Sonnenwind auf der Oberfläche der Erde zu erreichen, wodurch eine Induktionkonsistente Belastung für lebende Organismen, die stark genug gewesen, um Gen-Veränderungen schließlich zu induzieren, die zu Evolution 2 pflanzen konnte. Eine detaillierte Analyse der Experimente beschreiben die Wirkung von Magnetfeldern auf die Pflanzen eine große Anzahl von widersprüchliche Berichte, gekennzeichnet durch einen Mangel der plausiblen biophysikalischen Wirkungsmechanismen. Viele Experimente sind einfach unrealistisch, während andere fehlt eine testbare Hypothese, und letztlich nicht überzeugend 3. In den letzten Jahren hat sich der Fortschritt und Stand der Forschung über die Wirkung von Magnetfeldern auf die Anlage überprüft 2,4-11. Vor kurzem hat die Wirkung der beiden niedrigen und hohen Magnetfeld eingehend erörtert 1 wurde, mit einem besonderen Schwerpunkt auf der Beteiligung von GMF Umkehr Veranstaltungen an Pflanzenevolution 2. Die direkte Methode, um die Hypothese zu untermauern, dass GMF Auflösungen beeinflussen Pflanzenevolution ist es, eine GMF synthetisierenUmkehr im Labor durch Testen der Reaktion von Pflanzen auf normale und umgekehrte Magnetfeldbedingungen. Um die Hypothese zu testen, daher haben wir eine achteckige dreiachsigen Helmholtzspule-Paaren Magnetfeld-Kompensationssystem (Drei-Achs-Spulen), die in der Lage, die normalen GMF Bedingungen genau umgekehrte ist. Wir verwendeten Arabidopsis thaliana als Modellpflanze und wir die Wirkung rückgängig GMF auf die Genexpression einiger wichtiger Gene getestet: Cruciferin 3 (CRU3), die eine 12S Samenspeicherprotein, das tyrosinphosphorylierten ist und dessen Phosphorylierungszustand in Reaktion moduliert kodiert ABA in Arabidopsis thaliana Samen 12,13; Die Kupfer Transport protein1 (COTP1), die eine Schwermetalltransport / Entgiftung Super Protein mit der vorherrschenden Funktion im Boden Cu Erwerb und Pollenentwicklung 14 kodiert; und Redox-gesteuerten Transkriptions Factor1 (RRTF1)dass kodiert für ein Mitglied des ERF (Ethylen-Antwort-Faktor) Unterfamilie B-3 der EFF / AP2 Transkriptionsfaktor-Familie, die eine AP2-Domäne, die die synergistische Co-Aktivierung der Genexpression Wege sowie verleihen Quer Toleranz gegenüber abiotischen und biotischen betont 15 enthält. Darüber hinaus haben wir auch analysiert fünf Gene in oxidativen Stress-Antworten beteiligt sind: Fe Superoxid Dismutase1 (FSD1), das ein zytoplasmatisches Enzym, das enzymatisch und schnell wandelt das Superoxidanion kodiert (O 2 -) und Wasser (H 2 O) zu Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) und molekularem Sauerstoff (O 2) 16; Catalase3 (CAT3), dass dieses Enzym codiert, und die den Abbau von H 2 O 2 in Wasser und Sauerstoff 17,18 katalysiert; Thylakoidal Ascorbatperoxidase (TapX), das ein kodiert Chloroplasten thylakoid Peroxidase, die H 2 O abfängt2 19; Ascorbate Peroxidase1 (APX1), das eine cytosolische Peroxidase umfaßt, die H 2 O 2 spült und stellt eines der möglichen Ziele von post-translationalen Modifikationen von NO-abgeleiteten Molekülen 20 vermittelte codiert; und NADPH Respiratory Burst-Oxidase Protein D (RbohD), die ein Enzym, das O 2 erzeugt codiert - und spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Wachstums, der Entwicklung und Stressantworten in Arabidopsis 21. Unsere Feldumkehr Methode liefert den ersten Beweis, dass GMF Umkehr kann eine signifikante Veränderung in der Morphologie und Genexpression von A. induzieren thaliana Wurzeln und Sprossen. Dieses Protokoll stellt eine innovative Möglichkeit, die Wirkung von GMF Umkehr auf Pflanzenmorphologie und der Genexpression zu bewerten und kann verwendet werden, um die möglichen Auswirkungen der GMF Umkehr auf andere Aspekte der Anlagenverhalten zu bewerten und dadurch zu führen Diskussion der role der GMF Umkehr auf die Pflanzenentwicklung.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>three-axis magnetometer</td>
			<td>Bartington&#160;</td>
			<td>Mag-03MC</td>
			<td>triaxial fluxgate magnetometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetometer power supply</td>
			<td>Bartington&#160;</td>
			<td>Mag-03PSU</td>
			<td>triaxial fluxgate magnetometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetometer software</td>
			<td>Bartington&#160;</td>
			<td>Mag03DAM</td>
			<td>triaxial fluxgate magnetometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DC power supply&#160;</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>E3642A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium hypochlorite&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>211389</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X100&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>2860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GroLux Sodium vapor lamps&#160;</td>
			<td>OSRAM Sylvania</td>
			<td>600W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Plant RNA kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase-Free DNase&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>79254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent 2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2938B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop ND-1000&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>not available</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4368813</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mx3000P</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401512</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X MaximaTM SYBR Green qPCR Master Mix&#160;</td>
			<td>Fermentas International, Inc</td>
			<td>K0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog Basal Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5519&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish square (120x120)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z692344&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

geomagnetic field (gmf) and plant evolution: investigating the effects of gmf reversal on arabidopsis thaliana development and gene expression

Einer der anregendsten Beobachtungen in der Pflanzenentwicklung eine Korrelation zwischen dem Auftreten des Erdmagnetfeldes (GMF) Auflösungen (oder Ausflüge) und dem Zeitpunkt der Strahlung der Angiospermen. Dies führte zu der Hypothese, dass Veränderungen im GMF Polarität kann eine Rolle bei der Pflanzenevolution spielen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um diese Hypothese durch Aussetzen Arabidopsis thaliana künstlich umgekehrt GMF Bedingungen zu testen. Wir verwendeten ein Drei-Achsen-Magnetometer und die gesammelten Daten wurden verwendet, um die Größe des GMF berechnen. Drei DC-Netzteile wurden zu drei Helmholtz-Spulenpaare verbunden und wurden von einem Computer gesteuert, um die GMF Bedingungen zu ändern. Pflanzen in Petrischalen gezüchtet wurden sowohl normale freigelegt und umgekehrt GMF Bedingungen. Schein-Expositions-Experimente wurden ebenfalls durchgeführt. Exposed Pflanzen wurden während des Experiments fotografiert und die Bilder wurden analysiert, um die Wurzellänge und Blattflächen zu berechnen. Arabidopsis Gesamt-RNA wurde extrahiert und QuantitativeEchtzeit-PCR (qPCR) Analysen wurden auf die Genexpression von Cruciferin 3 (CRU3), Kupfer Transport protein1 (COTP1), Redox gesteuerten Transkriptions Factor1 (RRTF1), Fe Superoxide Dismutase 1 (FSD1), Catalase3 (CAT3), Thylakoidal geführt Ascorbatperoxidase (TapX), einer zytosolischen Ascorbat Peroxidase1 (APX1) und NADPH / respiratory burst oxidase Protein D (RbohD). Vier verschiedene Referenzgene wurden analysiert, um die Ergebnisse der qPCR normalisieren. Die beste der vier Gene, wurde ausgewählt und die stabilste Gen zur Normalisierung verwendet. Unsere Daten zeigen zum ersten Mal, dass die Umkehrung der Polarität GMF mit dreiachsigen Spulen hat erhebliche Auswirkungen auf das Pflanzenwachstum und die Genexpression. Dies stützt die Hypothese, dass die GMF Umkehr trägt zu induzieren Veränderungen in der Pflanzenentwicklung, die einen höheren Selektionsdruck rechtfertigen könnten, was schließlich zu p führendenlant Evolution.

Ziel dieses Protokolls ist es, ein Verfahren zu schaffen, um zu beurteilen, wie in 1A gezeigt, ob Umkehrung des Erdmagnetfeldes (GMF) kann die Pflanzenentwicklung und Genexpression von Arabidopsis thaliana Ökotyp Col 0. Triaxial Spulen beeinflussen, werden verwendet, um die GMF, wenn Satz umkehren mit den entsprechenden Treiberspannungen (1B), erhalten wie in Schritt 1.5 beschriebenen Protokoll. Die Abmessungen der triaxiale Spulen ~ 2 x 2 x 2 m 3, der ausreichend Platz mit umgekehrtem GMF Verhältnisse mehrere Petrischalen Host erlaubt. Kontrollen wurden unter den gleichen Umgebungsbedingungen und bei Normal GMF Werte gewachsen. Nach 10 Tagen Exposition gegenüber normalen und umgekehrten GMF Bedingungen der Phänotyp der Pflanzen zeigten morphologische Veränderungen offensichtlich. Wie in Figur 2 gezeigt, die Kontrollpflanzen (dh bei normalen Bedingungen gezüchtet GMF) zeigte Wurzellängen mit signifikant (Dunn-Sidak und Bonferroni bereinigt Prob &lt;0,001;Student-t = 10.68, df = 31), höhere Werte (29,41 mm; SEM = 1,04; n = 32) in Bezug auf Pflanzen umgekehrt GMF ausgesetzt (17,53 mm; SEM = 0,58; n = 36). In GMF-Anlagen umgekehrt wurde die Morphologie der Triebe auch durch, die eine reduzierte Entwicklung der Packungsbeilage Expansion verändert. Pflanzen in den normalen Bedingungen ausgesetzt zeigte eine durchschnittliche Blattfläche von 4,95 mm 2 (SEM 0,025, n = 54), während die Pflanzen umgekehrt GMF Bedingungen ausgesetzt deutlich zeigten (Dunn-Sidak und Bonferroni Bereinigt Prob = &lt;0,001; Schüler t = 31.32, df = 53) unteren Blattbereich-Werte (3,71 mm 2; SEM = 0,032; n = 54). Daher Exposition von Arabidopsis rückgängig GMF Bedingungen führte zu einer Verringerung sowohl der Wurzellänge und Blattfläche. Blattausdehnung und Wurzelwachstum sind abhängig sowohl von der Trennfläche und der Dehnung der Zellen 27. Daher Pflanzenentwicklung, Produktivität und allgemeine Fitness sind abhängig von einer optimalen shoot- und Wurzel-System-Architektur &lt;sup&gt; 28. Die reduzierte Wurzellänge und Blattgröße von Pflanzen zu wend GMF Bedingungen ausgesetzt zeigen das Vorhandensein von einem Erfassungssystem in der Lage, nicht nur das wahr Variationen in der Magnetfeldstärke, sondern auch auf Änderungen des Magnetfeldes &quot;direction&quot; im Vergleich zur Schwerkraft reagieren. Die Hypothese, dass GMF Umkehr kann das Pflanzenwachstum beeinflussen findet überzeugende Beweise in unseren Experimenten, die zeigen, dass GMF Umkehrbedingungen erheblich Pflanzenentwicklung auswirken. Die morphologischen Veränderungen wurden auch durch Veränderungen in der Genexpression begleitet. Unter Haushaltsgenen war die stabilste Gen Elongationsfaktors 1B alpha-Untereinheit 2. Die erste Gruppe von Genen (CRU3, COTP1, RRTF1) zeigte eine dramatische Veränderung in der Genexpression (Abbildung 3). Erschießen Expression aller drei Gene signifikant um etwa das 2,5-fache erhöht (P &lt;0,05) in Anlagen zur Rücklage ausgesetztd GMF Bedingungen. Root Expression CRU3 wurde in den Wurzeln der Pflanzen in den Normal GMF Bedingungen ausgesetzt hochreguliert, jedoch war signifikant (P &lt;0,05) in der Umkehr GMF Bedingungen herunterreguliert. Das Gegenteil wurde COTP1 und RRTF1, unter normalen Einsatzbedingungen abgeschwächt und in Gegenwart von GMF Umkehr hochreguliert wurden (Figur 3) festgestellt. Cruciferin (a 12 S-Globulin) ist das häufigste Speicherproteins in den Samen von A. thaliana und andere Kreuzblütler und als Vorstufe im rauen endoplasmatischen Retikulum synthetisiert. Es wird dann auf die Lagerung des Proteins Vakuolen 13 transportiert. Sämling Keimung erfordert die Aufteilung der Cruciferin, die als eine anfängliche Stickstoffquelle verwendet wird. Herabregulierung von Cruciferin Abbau reduziert Embryonen Entwicklung von Zellstrukturen oder Zellbestandentwicklungs 29,30 beeinträchtigen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Hochregulierung von CRU3 korreliert miteine untere Blattausdehnung und eine reduzierte Wurzellänge, was darauf hinweist, daß dieses Gen in empfindlich GMF Umkehr und dass seine Überexpression kann die Reduktion der Pflanzenentwicklung beitragen. Außerdem induziert GMF Umkehr eine signifikante Herabregulation CRU3 in Wurzeln, die mit einem reduzierten Wurzellänge korreliert. Kupfer ist ein essentielles Co-Faktor für die wichtigsten Prozesse in Pflanzen, aber es schädliche Auswirkungen, wenn mehr ausübt; Somit überexprimierenden Kupfertransport beeinträchtigt das Pflanzenwachstum. Die Wirkung von GMF Umkehr gab eine signifikante Überexpression von COTP1 in beiden Sprossen und Wurzeln, was erklärt die reduzierte Pflanzenwachstum. Ionen Stress beeinträchtigt Chloroplasten Stoffwechsel, die fest an den Redoxzustand der Zelle verbunden ist. In Arabidopsis der Transkriptionsfaktor RRTF1 ist wichtig für die Expression von Genen, mit der Fähigkeit assoziiert zu justieren, um Redoxveränderungen 31. Deshalb, wenn Pflanzen werden auf äußere Reize in der Lage, ihre physiologischen und Entwicklung verändern ausgesetztal Programme eine Überexpression dieser wichtigen Transkriptionsfaktor zu erwarten ist. Umkehr der GMF induzierte eine signifikante Überexpression von RRTF1 in beiden Sprossen und Wurzeln, was auf höhere oxidative Stressreaktionen von Pflanzen umgekehrt GMF Bedingungen. Interessante Ergebnisse werden durch die Analyse der fünf in oxidativen Stress beteiligten Gene erhalten. In der Regel haben alle extrahiert und in Trieben analysierten Gene keine signifikanten Unterschiede (P&gt; 0,05), wenn Pflanzen werden in normalen angebaut oder umgekehrt GMF Bedingungen (Abbildung 4 und Abbildung 5) zu zeigen. Jedoch wurde eine signifikante Herabregulierung immer Wurzeln der Pflanzen zu wend GMF Bedingungen ausgesetzt waren. Insbesondere zeigten CAT3 die höchste Herunterregulierung (Bild 5), gefolgt in der Reihenfolge der Herunterregulierung von APX1, FSD1, RBOHD und TapX (Abbildung 4). Kreuztoleranz einbiotische und abiotische Stress wird durch die Aktivierung verschiedener Gene in verschiedenen biochemischen Stoffwechselwegen beteiligt ist. RRTF1 Transkriptionsfaktor ermöglicht die synergistische Co-Aktivierung der Genexpression dieser Wege 15,31, und können möglicherweise zu oxidativem Stress 32 einbezogen werden. Daher ist die Hochregulation von RRTF1 erwartet, wenn sauerstoffaufnehmende verringert. Herabregulierung von Wurzelfänger Enzyme korreliert mit der Hochregulation von RRTF1, das als Reaktion auf erhöhten oxidativen Stress wirkt. Die dramatische Wurzelherunterregulieren der KW3, APX1 und TapX zeigt die reduzierte Fähigkeit der Wurzelzellen zu H 2 O 2, die durch die verringerte Fähigkeit, die Superoxid-Anion, das durch Herunterregulieren der FSD1 dismutieren begleitet wird abzufangen. Die oxidative Stressantworten in Wurzeln, die auf die Hauptseite umgekehrter GMF Wahrnehmung erscheinen höher. Abbildung 1. Erdmagnetfeld Vergütungssystem. (A) triaxiale Spulen (umfassend ein Paar von achteckigen Spulen für jede der drei senkrechten Achsen) um den Erdmagnetfeldvektors umkehren. (B) eine computergesteuerte Stromversorgung mit jedem Paar von Helmholtz-Spulen verbunden ist. (Spannungen in diesen Zahlen sind willkürlich) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig2.jpg" /> Abbildung 2. Auswirkungen der geomagnetischen Feldumkehr auf Arabidopsis-Morphologie. Nach zehn Tagen Exposition Kontrollpflanzen (dh diejenigen, die normale GMF Bedingungen ausgesetzt) ​​zeigen eine signifikant größere Wurzellänge und mehr expanded Blättchen im Vergleich zu Pflanzen, die umgekehrt GMF Bedingungen ausgesetzt wurden. Metric bar = 18 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig3.jpg" /> Abbildung 3. Auswirkungen der geomagnetischen Feldumkehr auf Arabidopsis Genexpression. Nach zehn Tagen nach der Exposition wurde Gesamt-RNA von Kontroll- und behandelten Pflanzen extrahiert und durch Real-Time PCR für die Expressionsanalyse analysiert. Der Effekt der Umkehrung der GMF war es, eine drastische Veränderung in der Genexpression aller Gene, die CRU3, Cruciferin 3 getestet wurden, zu induzieren;. COTP1, Kupfer Transport protein1; RRTF1, Redox gesteuerten Transkriptions Factor1. Balken zeigen die Standardfehler; Sternchen zeigt signifikante (p &lt;0,05) Unterschiede zwischen plAmeisen, um umgekehrt und normalen GMF Bedingungen ausgesetzt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig4.jpg" /> Abbildung 4. Auswirkungen der geomagnetischen Feldumkehr auf Arabidopsis Antioxidans-verbundene Genexpression. Nach zehn Tagen der Exposition wird eine Gesamt-RNA von Kontroll- und behandelten Pflanzen isoliert und für die Genexpressionsanalyse mittels Real-Time PCR eingesetzt. Die Wirkung der Umkehr der GMF war, keine signifikanten Veränderungen in shoot Genexpression zu induzieren; Jedoch wurde eine drastische Herunterregulation in root Genexpression von Pflanzen unter Umkehr GMF Bedingungen gezüchtet beobachtet TapX, Thylakoidal Ascorbatperoxidase;. APX1, Ascorbate Peroxidase1; FSD1, Fe Superoxid Dismutase1; RbohD, NA. DPH / Respiratory Burst-Oxidase Protein D Balken zeigen Standardfehler; Sternchen zeigt signifikante (p &lt;0,05) Unterschiede zwischen Pflanzen umgekehrt und normalen GMF Bedingungen ausgesetzt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/53286/53286fig5.jpg" /> Abbildung 5. Effekte des Erdmagnetfeldes Wende an Arabidopsis Katalase 3 (CAT3) Genexpression. Nach zehn Tagen der Exposition wird eine Gesamt-RNA von Kontroll- und behandelten Pflanzen isoliert und für die Genexpressionsanalyse mittels Real-Time PCR eingesetzt. Die Wirkung der Umkehr der GMF war, keine signifikanten Veränderungen in shoot Genexpression zu induzieren; Jedoch wurde eine drastische Herunterregulation in root Genexpression von Pflanzen unter Umkehr GMF Bedingungen gezüchtet beobachtet. Balken zeigen die Standard error; Sternchen zeigt signifikante (p &lt;0,05) Unterschiede zwischen Pflanzen umgekehrt und normalen GMF Bedingungen ausgesetzt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53286/53286fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression at JoVE.com

Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

Erdmagnetfeld (GMF) und Pflanze Evolution: Untersuchung der Auswirkungen von Gmf Reversal auf<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Entwicklung und Genexpression

One of the most stimulating observations in plant evolution is a correlation between the occurrence of geomagnetic field (GMF) reversals (or excursions) ...

geomagnetic-field-gmf-plant-evolution-investigating-effects-gmf

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Geomagnetic Field (Gmf) and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

13.0K Aufrufe.  University of Turin. This protocol describes a method to test the hypothesis that the reversal of the effective geomagnetic field (GMF) induces differential gene expression and alters the morphology of Arabidopsis thaliana. A triaxial octagonal system of Helmholtz coil-pairs was used to artificially generate reversed GMF conditions in the plant growth chamber.

Serie: Geomagnetic Field Gmf and Plant Evolution: Investigating the Effects of Gmf Reversal on Arabidopsis thaliana Development and Gene Expression

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Kultur von embryonalen Maus Cochlear Explantate und Gentransfer durch Elektroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene therapy in organ-cultured corneas. The diabetic corneal disease is a complication of diabetes with frequent abnormalities of corneal nerves and epithelial wound healing. We have also documented significantly altered expression of several putative epithelial stem cell markers in human diabetic corneas. To alleviate these changes, adenoviral gene therapy was successfully implemented using the upregulation of c-met proto-oncogene expression and/or the downregulation of proteinases matrix metalloproteinase-10 (MMP-10) and cathepsin F. This therapy accelerated wound healing in diabetic corneas even when only the limbal stem cell compartment was transduced. The best results were obtained with combined treatment. For possible patient transplantation of normalized stem cells, an example is also presented of the optimization of gene transduction in stem cell-enriched cultures using polycationic enhancers. This approach may be useful not only for the selected genes but also for the other mediators of corneal epithelial wound healing and stem cell function.

An example of adenoviral gene therapy in the human diabetic organ-cultured corneas is presented towards the normalization of delayed wound healing and markedly reduced epithelial stem cell marker expression in these corneas. It also describes the optimization of this process in stem cell-enriched limbal epithelial cultures.

Adenoviralen Gentherapie für diabetische Keratopathie: Auswirkungen auf die Wundheilung und Zellmarker Expression in Human Organ kultivierten Hornhäute und Limbale Epithelial Stammzellen

The goal of this protocol is to describe molecular alterations in human diabetic corneas and demonstrate how they can be alleviated by adenoviral gene ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

Embryo Mikroinjektions und Elektroporation in der bei Chor<em&gt; Schlauchseescheide</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

A Simple Chamber for Long-term Confocal Imaging of Root and Hypocotyl Development

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and subcellular processes, high resolution time-lapse microscopy strategies that preserve physiological conditions are required. Plant tissues must have adequate nutrient and water supply with sustained gaseous exchange but, when submerged and immobilized under a coverslip, they are particularly susceptible to anoxia. One strategy that has been successfully employed is the use of a perfusion system to maintain a constant supply of oxygen and nutrients. However, such arrangements can be complicated, cumbersome, and require specialized equipment. Presented here is an alternative strategy for a simple imaging system using perfluorodecalin as an immersion medium. This system is easy to set up, requires minimal equipment, and is easily mounted on a microscope stage, allowing several imaging chambers to be set up and imaged in parallel. In this system, lateral root growth rates are indistinguishable from growth rates under standard conditions on agar plates for the first two days, and lateral root growth continues at reduced rates for at least another day. Plant tissues are supplied with nutrients via an agar slab that can be used also to administer a range of pharmacological compounds. The system was established to monitor lateral root development but is readily adaptable to image other plant organs such as hypocotyls and primary roots.

Presented here is a simple technique for high-resolution confocal time-lapse imaging of root and hypocotyl development for up to 3 days using high numerical-aperture objectives and perfluorodecalin as an immersion medium.

Eine einfache Kammer für die langfristige konfokale Bildgebung der Wurzel- und Hypocotyl-Entwicklung

Several aspects of plant development, such as lateral root morphogenesis, occur on time spans of several days. To study underlying cellular and ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, early stage plant embryos are small and contain few cells, making them difficult to observe and analyze. A method is described here for characterizing pattern formation in plant embryos under a microscope using the model organism Arabidopsis. Following the clearance of fresh ovules using Hoyer's solution, the cell number in and morphology of embryos could be observed, and their developmental stage could be determined by differential interference contrast microscopy using a 100X oil immersion lens. In addition, the expression of specific marker proteins tagged with Green Fluorescent Protein (GFP) was monitored to annotate cell identity specification during embryo patterning by confocal laser scanning microscopy. Thus, this method can be used to observe pattern formation in wild-type plant embryos at the cellular and molecular levels, and to characterize the role of specific genes in embryo patterning by comparing pattern formation in embryos from wild-type plants and embryo-lethal mutants. Therefore, the method can be used to characterize embryogenesis in Arabidopsis.

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

This protocol outlines a method for observing embryogenesis in Arabidopsis via ovule clearance followed by the inspection of embryo pattern formation under a microscope.

Eine Methode zur Charakterisierung der Embryogenese in Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Assessment of the Effects of Endocrine Disrupting Compounds on the Development of Vertebrate Neural Network Function Using Multi-electrode Arrays

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday products. They are classified as endocrine disrupting compounds (EDC) with estradiol-like properties. Long-term exposure to EDCs, even at low doses, has been linked with various health defects including cancer, behavioral disorders, and infertility, with greater vulnerability during early developmental periods. To study the effects of BPA on the development of neuronal function, we used an in vitro neuronal network derived from the early chick embryonic brain as a model. We found that exposure to BPA affected the development of network activity, specifically spiking activity and synchronization. A change in network activity is the crucial link between the molecular target of a drug or compound and its effect on behavioral outcome. Multi-electrode arrays are increasingly becoming useful tools to study the effects of drugs on network activity in vitro. There are several systems available in the market and, although there are variations in the number of electrodes, the type and quality of the electrode array and the analysis software, the basic underlying principles, and the data obtained is the same across the different systems. Although currently limited to analysis of two-dimensional in vitro cultures, these MEA systems are being improved to enable in vivo network activity in brain slices. Here, we provide a detailed protocol for embryonic exposure and recording neuronal network activity and synchrony, along with representative results.

Exposure to environmental toxins can acutely impact developing embryos. Endocrine disrupting chemicals such as bisphenols are known to adversely affect the nervous system. Here we describe a protocol using an in vitro vertebrate (chick embryo) neuronal network model to study the functional impact of toxin exposure on early embryos.

Bewertung der Auswirkungen von endokriner Substanzen auf die Entwicklung der Wirbeltiere neuronales Netz-Funktion mit Multi-Elektroden

Bis-phenols, such as bis-phenol A (BPA) and bis-phenol-S (BPS), are polymerizing agents widely used in the production of plastics and numerous everyday ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, especially, in plant reproductive biology. However, plant morphological, anatomical, and ultrastructural analyses traditionally involve time-consuming embedding and sectioning procedures for bright field, scanning, and electron microscopy. Recent progress in confocal fluorescence microscopy, state-of-the-art 3-D computer-aided microscopic analyses, and the continuous refinement of molecular techniques to be used on minimally processed whole-mount specimens, has led to an increased demand for developing efficient and minimal sample processing techniques. In this protocol, we describe techniques for properly dissecting Arabidopsis flowers and siliques, basic clearing techniques, and some staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

In this protocol, we describe techniques for the proper dissection of Arabidopsis flowers and siliques, some basic clearing techniques, and selected staining procedures for whole-mount observations of reproductive structures.

Vollständig-hängen Clearing und Färbung des Arabidopsis Blume Organe und Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Laser Capture Microdissection of Mouse Embryonic Cartilage and Bone for Gene Expression Analysis

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and molecular complexity of skeletal elements increases with development. Tissue heterogeneity, such as at the interface of cartilaginous and osseous elements with each other or with surrounding tissues, is one obstacle to the study of developing cartilage and bone. Our protocol provides a rapid method of tissue processing and isolation of cartilage and bone that yields high quality RNA for gene expression analysis. Fresh frozen tissues of mouse embryos are sectioned and brief cresyl violet staining is used to visualize cartilage and bone with colors distinct from surrounding tissues. Slides are then rapidly dehydrated, and cartilage and bone are isolated subsequently by LCM. The minimization of exposure to aqueous solutions during this process maintains RNA integrity. Mouse Meckel&rsquo;s cartilage and mandibular bone at E16.5 were successfully collected and gene expression analysis showed differential expression of marker genes for osteoblasts, osteocytes, osteoclasts, and chondrocytes. High quality RNA was also isolated from a range of tissues and embryonic ages. This protocol details sample preparation for LCM including cryoembedding, sectioning, staining and dehydrating fresh frozen tissues, and precise isolation of cartilage and bone by LCM resulting in high quality RNA for transcriptomic analysis.

This protocol describes laser capture microdissection for the isolation of cartilage and bone from fresh frozen sections of the mouse embryo. Cartilage and bone can be rapidly visualized by cresyl violet staining and collected precisely to yield high quality RNA for transcriptomic analysis.

Laser Capture Mikrodissektion von Maus embryonalen Knorpel und Knochen für Die Genexpressionsanalyse

Laser capture microdissection (LCM) is a powerful tool to isolate specific cell types or regions of interest from heterogeneous tissues. The cellular and ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Übersetzen von Ribosome Affinity Purification (TRAP) zur Untersuchung der Arabidopsis thaliana Wurzelentwicklung in einer zelltypspezifischen Skala

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...