This research was supported by a National Leading Research Laboratory Program (Grant NRF-2013R1A2A1A05006378) through the National Research Foundation of Korea funded by the Ministry of Science, ICT and Future Planning. The authors also acknowledge a KAIST Systems Healthcare Program.

マイクロパターン金型及びヒドロゲルの作製<ol><li> PDMSモールドを鋳造するための標準的な2段階のフォトリソグラフィ技術15,17を介して、シリコンウェハの表面上のSU-8フォトレジストを用いて所望のマイクロスケールのパターンを生成します。示された例は、肝小葉様メッシュパターン（ 図1）を使用します 。 </li><li> 1の比でPDMSと硬化剤溶液を秤量：5（ すなわち 、PDMS 12.5gのと硬化剤2.5 g）を得ました。 </li><li>完全に溶液の15グラムを混合し、真空チャンバ内に気泡を脱ガスし、次に均一にフォイル鋳造皿内のシリコンウェーハのマイクロパターン化表面上に混合溶液を広げます。 </li><li> PDMSを硬化させるために、平らな面に90分間65℃で加熱したプレート上にシリコンウェーハを配置します。 </li><li>鋳造皿やシリコンウエハから硬化PDMSを削除します。 </li><li> PDMSの端をカットし、100 mmの直径のペトリ皿の上に置きますマイクロパターンサイドアップ。 </li><li>主な滅菌のために70％エタノールと蒸留水を用いてシャーレに微細化硬化PDMSを洗ってください。その後、65℃のオーブンで10分間完全に乾燥します。 </li><li>コー​​ティング溶液（w / v）の3％を作成し、蒸留水100ml中で粉末化非イオン性界面活性剤のO / N 3グラムを溶解し、混合します。 </li><li>プラズマクリーナーにマイクロパターンPDMS金型を置き、1分（85 W、0.73ミリバール）水性液体の追加を容易にするために、親水性表面を作成するためにそれらをきれいにします。その後、実験室コートロッカーを使用して、少なくとも3時間（ORO / N）を100 mlの界面活性剤溶液とPDMSの表面。 </li><li> PDMS型から界面活性剤溶液を洗浄し、10分間65℃のオーブンで完全に乾燥させます。その後、30分かけて紫外線（UV）放射線に曝露することによって、各微細金型を滅菌します。 </li></ol> 2.ヒドロゲル前駆体中の細胞懸濁液を準備<ol><li>に1％（w / v）のアルギン酸塩前駆体を生成する、ヒドロゲル前駆体を調製リン酸緩衝生理食塩水（PBS）10ml中のアルギン酸ナトリウム粉末を0.1gを溶解します。完全に粉末を溶解するために、O / Nそれらをインキュベートし、混合します。 </li><li> 1ml注射器に接続された0.22μmのフィルターを通して溶液をフィルタリングします。 </li><li>培養10％ウシ胎児血清および1％ペニシリン-ストレプトマイシン、従来の組織培養皿で70％までを補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でHepG2細胞- 37℃、5％CO 2の加湿インキュベーター中で80％コンフルエンス。 </li><li>一度PBSを用いて細胞を洗浄し、次いで37℃で5％CO 2加湿インキュベーター中で4分間、0.05％トリプシン-EDTAを1ml添加することによって、それらをトリプシン処理。遠心上清を除去した後、1mlのPBSを用いて3分間再懸濁し、250×gで培養皿から細胞を採取しました。 </li><li>自動化された細胞を用いてPBS中で単分散細胞の数を数えますカウンタ。 </li><li> 3分およびPBSを除去するために250×gで遠心分離した後、（w / v）の1％の1 mLを加え、残りの細胞ペレットのアルギン酸ナトリウム溶液を、穏やかにピペッティングを使用して混合します。 10 7細胞/ ml -細胞の最終播種密度は5×10 6でなければなりません。 37℃で5％CO 2の加湿インキュベーター中で、細胞/ヒドロゲルサスペンションをインキュベートします。 </li></ol> 3.ロードとセル/ハイドロサスペンションの架橋<ol><li>塩化カルシウム1.47 gを架橋試薬を生成するためのddH 2 O 100ml中に溶解する脱水（ すなわち 、100ミリモルのCaCl 2・2H 2 O中のddH 2 O）。 </li><li> 70％エタノールを用いた超音波トランスデューサと加湿器の内部をすすぎ、および架橋試薬200mlでそれを埋めます。加湿器は、110ミリメートル幅の広い300ミリメートル、長さ170ミリメートルの深さ（ すなわち 、110ミリメートル×300ミリメートル×170ミリメートル（幅×高さ×奥行））。 </li><li>マイクロパターンPDMSを配置プラズマクリーナーで金型や親水性表面を作成するために、85 Wで1分間のためにそれらをきれいにします。 </li><li>着実に金型内の微細パターンのエッジでよく混合細胞/ヒドロゲル懸濁液の7.2μLをロードします。示された例は、肝小葉様メッシュパターン（ 図1）を使用します 。懸濁液の容量は、地形のパターンに依存します。 </li><li>細胞/ヒドロゲル懸濁液のゲル化を達成するためには、加湿器をオンにし、加湿器は、架橋試薬のミストを生成することを確認します。 5cmの範囲内のPDMSモールドの地形表面を覆う、5分間のヒドロゲル前駆体上に架橋試薬を噴霧。 距離より長く、より短い5センチメートルはそれぞれ、不完全で、不均一なゲル化が生じる可能性があります。注意して​​ください。加湿器は、5分で架橋試薬のミスト20mlのを生産、250ミリリットル/時間の噴霧速度を持っていることを確認してください。 </li><li>架橋工程の後、加湿器の電源をオフにし、PDMS MOを埋めますPBSでLDS。 </li></ol>シングルモジュラーヒドロゲルシートの4取り扱い<ol><li> 200μlのピペットチップを使用して、ハイドロゲルシートの周りに優しくPBSをピペットを介しマイクロパターンを型から各硬化ヒドロゲルシートを外します。 </li><li>エンドカット千μlのピペット先端を使用して、各浮動ハイドロゲルシートをピックアップ。各肝小葉様メッシュハイドロゲルシートを8ミリメートル×8.7ミ​​リメートルの寸法を有し、かつ100である - 厚さ200μm。 </li><li>ハイドロゲルを使用して浮いた状態でのin vitroでの細胞は5週で12ウェルプレート中のユニット部品として構成する12ウェルプレートに1mlのDMEMにハイドロゲルシートの単層を移し、文化37℃での％のCO 2の加湿インキュベーター。一日おきに培地を交換します。 </li></ol> 5の組立多層ヒドロゲルシート<ol><li>繰り返しが18ミリメートル×18ミリメートル×4mmの寸法のPDMSフレームを生成するために1.5から1.1ステップ（幅x下面には170μmの高い柱状構造を含むのHのx D）、および。ステップ1.2と同じ比率で、PDMSと硬化剤の混合物の42グラムを使用してください。 ×9ミリメートル×2ミリメートル（幅×高さ×奥行）8mmの寸法の内部フレームを作成するために、PDMSフレーム用シリコンウェーハ上に特殊なポリカーボネートの金型を置きます。 </li><li> 121℃で15分間オートクレーブに蒸留水とピンセットに沈め、PDMSフレームと180μmの細孔ナイロン濾紙を滅菌します。 </li><li> 60 mmの直径のペトリ皿中（直径5cmの）ナイロンフィルター紙片の四分の一に滅菌PDMSフレームを配置します。 </li><li>エンドカット千μlのピペットチップを使用して、PDMSフレームの内部にモジュラーハイドロゲルシートを転送します。組み立てに使用されるハイドロゲルシートは、それらが作製した後、少なくとも一日のために培養されるべきです。 </li><li>空の200μlのピペットチップを使用して、PDMSフレームと各モジュール式のハイドロゲルシートの端を合わせます。 </li><li> 6層 - 繰り返し4のスタックを形成するために、モジュール式のヒドロゲルシートを使用して、5.4と5.5を繰り返します。 </li><li> PDMSフレームの一番下にある柱構造を介して流出することにより、培養液を除去します。そして、多層構造物の隅にアルギン酸塩溶液2μL（w / vの2％）を追加します。 </li><li>別のものとそれぞれの層の端部を取り付けるために、多層構造体の上に30秒間架橋試薬のミストを噴霧します。 （250ミリリットル/時間の噴霧速度で）架橋剤のミストの2ミリリットルを使用してください。 </li><li> 400μlのDMEMで穏やかに多層構造物をすすぎ、ピンセットを使用して、PDMSのフレームを削除します。 </li><li>優しくDMEMの4ミリリットルを添加した後、細胞リフターで拭いてろ紙から多層構造体を取り外します。 </li><li>ヒドロゲルと同様に構成する、3濾紙を使用して、DMEM mlの培養浮遊様式でインビトロで細胞を含む6ウェルプレートに、多層構築物を転写37℃で5％CO 2の加湿インキュベーター中で一週間以上、6ウェルプレート中のマルチスケールの細胞の足場。一日おきに培地を交換します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+biomedical+applications.">Hydrogels for biomedical applications.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64 (Supplement), 18-23 (2012).</li><li>Lan, S., Starly, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+based+3D+hydrogels+as+an+in+vitro+co-culture+model+platform+for+the+toxicity+screening+of+new+chemical+entities.">Alginate based 3D hydrogels as an in vitro co-culture model platform for the toxicity screening of new chemical entities.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 256 (1), 62-72 (2011).</li><li>Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. 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Mater. 12 (6), 584-590 (2013).</li><li>Lee, W., Son, J., Yoo, S. S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facile+and+Biocompatible+Fabrication+of+Chemically+Sol&#8722;Gel+Transitional+Hydrogel+Free-Standing+Microarchitectures.">Facile and Biocompatible Fabrication of Chemically Sol&#8722;Gel Transitional Hydrogel Free-Standing Microarchitectures.</a> 12 (1), 14-18 (2011).</li><li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+hydrogel+biopaper+for+patterned+3D+cell+culture+and+modular+tissue+reconstruction.">Cellular hydrogel biopaper for patterned 3D cell culture and modular tissue reconstruction.</a> Adv. Healthcare Mater. 1 (5), 635-639 (2012).</li><li>Bae, C. Y., Min, M. K., Kim, H., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+effect+of+the+hydrogel+grid+structure+on+in+vitro+formation+of+homogeneous+MIN6+cell+clusters.">Geometric effect of the hydrogel grid structure on in vitro formation of homogeneous MIN6 cell clusters.</a> Lab Chip. 14 (13), 2183-2190 (2014).</li><li>Bruzewicz, D. A., McGuigan, A. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+a+modular+tissue+construct+in+a+microfluidic+chip.">Fabrication of a modular tissue construct in a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 8 (5), 663-671 (2008).</li><li>Choi, S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+photolithography+to+fabricate+multilevel+microchannels.">Two-step photolithography to fabricate multilevel microchannels.</a> Biomicrofluidics. 4 (4), 046503 (2010).</li><li>Lee, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+formation+and+collagen-alginate+composite+encapsulation+of+pancreatic+islet+spheroids.">In situ formation and collagen-alginate composite encapsulation of pancreatic islet spheroids.</a> Biomaterials. 33 (3), 837-845 (2012).</li><li>Cabodi, M., Choi, N. W., Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+biomaterial.">A microfluidic biomaterial.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (40), 13788-13789 (2005).</li><li>Choi, N. W., Cabodi, M., Held, B., Gleghorn, J. P., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+scaffolds+for+tissue+engineering.">Microfluidic scaffolds for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 6 (11), 908-915 (2007).</li><li>Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alginate+hydrogels+as+synthetic+extracellular+matrix+materials.">Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials.</a> Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

このプロトコルは、モジュラーヒドロゲルシートを作製し、3次元細胞の足場を形成するためにそれらを組み立てる単純な方法を提供します。 短時間で明確なパターン化アルギン酸塩構造を構築するために、我々は金型から複雑な微細パターンを維持するだけでなく、細胞の生存率および代謝を維持するのに十分な剛性構造を作成することができ、架橋プロセスを特定す?...

ヒドロゲルは、特に、生体材料を約束しており、基本的な生物学、薬理学的ア ​​ッセイおよび医学において重要であることが期待される。ヒドロゲル系の細胞構築物の1 Biofabrication動物実験の使用を低減するために提案されている、2,3移植組織4を交換し、改善細胞ベースのアッセイ。5,6-含水（ハイドロ）粘弾性物質（ゲル）は、多数のセルが3D細胞の微小環境を制御するために、骨格構造中にカプセル化され、維持されることを可能にします。微小流体または微細技術のガイダンスと組み合わせて、ヒドロゲル構築物の形状は正確に細胞のスケールで制御することができます。現在までに、粒子、7を含むヒドロゲルの様々な形状、 - 9繊維、10から12とシートは、13から15 は、ボトムアップアプロに構築単位として使用されていますマクロスケール多細胞アーキテクチャの製作に痛みます。 ヒドロゲルをベースとする粒子および繊維の両方は、マイクロ流体デバイスを用いて流体を制御して、マイクロスケール細胞環境のような用途のために容易にかつ迅速に製造されています。しかし、操作された組織の基本単位として、それはそれらを再配置し、マクロスケール構造物としての容積を拡大するために複雑になる。16マイクロメートルサイズの基本モジュールを製造することよりも、これは、マクロスケールの構造体を達成することはより困難です。ヒドロゲルに基づく構築物のシート状のユニットは、簡単な組立工程を介して足場の容積を増加させることができます。結果的に、ヒドロゲルシートの積層は、体積の増加だけでなく、3D空間の幾何学的な拡張だけでなく、を提供します。 マルチレイにそのアセンブリと一緒に15 -我々は以前、13マイクロパターンハイドロゲルシートを製造する方法を報告していますセルラーアーキテクチャをered。技術は、多層構造の積層工程を経て、複雑な微細と細胞構造物のモジュラー設計を可能にします。微細化されている積層型モジュラーヒドロゲルシートの製造を介して、制御マクロスケールの細胞微小環境と3D細胞培養系を実現することができます。このビデオプロトコルは、ヒト肝癌細胞株（HepG2細胞）に基づくモジュラーヒドロゲルシートを構築するために使用することができるシンプルで強力な製造方法について説明します。我々は、多層構造の中に、本明細書にこれらの単純なパターニングモジュラーヒドロゲルシートの操作、及びそれらの組み立てを実証します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:288px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:111px;">Dow Corning Corporation</td>
			<td style="width:163px;">000000000001064291</td>
			<td style="width:397px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:288px;">Pluronic F-127</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">P2443</td>
			<td>Powdered nonionic surfactant&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Alginic acid sodium salt, low viscosity</td>
			<td style="width:111px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:163px;">B25266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:111px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">C7902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Ultrasonic humidifier</td>
			<td style="width:111px;">MediHeim</td>
			<td style="width:163px;">MH-2800</td>
			<td>Modified equipment, Maximum sprayed rate: 250 mL/h</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:288px;">Nylon net filter hydrofilic, 180 &#956;m</td>
			<td style="width:111px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:163px;">NY8H04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:288px;">Polycarbonate mold</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td>Customized mold for fabrication of a PDMS frame pattern</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

construction of modular hydrogel sheets for micropatterned macro-scaled 3d cellular architecture

ヒドロゲルは 、インビボ様の三次元（3D）組織形状を提供するために、マイクロ流体や微細化技術を使用してマイクロスケールでパターン化することができます。結果の3Dハイドロゲルベースの​​細胞構築物は、高度な生物学的研究、薬理学的アッセイおよび臓器移植アプリケーションのための動物実験の代替として導入されています。ヒドロゲルをベースとする粒子および繊維は、容易に製造することができるが、組織の再構築のためにそれらを操作することは困難です。この動画では、制御された細胞の微小環境とマクロスケール3D細胞培養系を形成するために、それらのアセンブリと共に、微細アルギネートヒドロゲルシートの製造方法を説明します。 200μmで、かつ正確な微細パターンを有する - カルシウムゲル化剤のミストの形を用いて、薄いハイドロゲルシートは容易に100の範囲の厚さで生成されます。次いで、細胞をヒドロゲルシートの幾何学的な指導を培養することができます自立型条件。また、ヒドロゲルシートは、容易にエンドカットチップでマイクロピペットを使用して操作することができ、パターン化ポリジメチルシロキサン（PDMS）フレームを使用してそれらを積層した多層構造に組み立てることができます。容易なプロセスを用いて製造することができ、これらのモジュラーヒドロゲルシートは、ミクロおよびマクロ構造および組織再構築の機能試験を含むインビトロ薬物アッセイおよび生物学的研究の潜在的な用途を有します。

我々は、製造や携帯ヒドロゲルシートを自立の操作を説明しています。 図1に示すように 、我々は、マイクロパターンPDMS金型を製作し、細胞を含むヒドロゲルは、ゲル化剤のエアロゾル化ミストを生成するための加湿器を使用して、これらの型の親水性表面上にロードされ、架橋されました。金型からの放出後に、HepG2細胞を様々なパターン（ 図2?...

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Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

マイクロパターンマクロスケール3D細胞構造のためのモジュラーヒドロゲルシートの構築

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K ビュー.  Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST). We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment. 

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Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

組織工学：層状細胞シートの送達のための多細胞3D足場の構築

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

生物工学

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up cellular mimics that better represent the complexity of cellular life. To date there are a number of paths that could be taken to build compartmentalized cellular mimics, including the exploitation of water-in-oil emulsions, microfluidic devices, and vesicles. Each of the available options has specific advantages and disadvantages. For example, water-in-oil emulsions give high encapsulation efficiency but do not mimic well the permeability barrier of living cells. The primary advantage of the methods described herein is that they are all easy and cheap to implement. Transcription-translation machinery is encapsulated inside of phospholipid vesicles through a process that exploits common instrumentation, such as a centrifugal evaporator and an extruder. Reactions are monitored by fluorescence spectroscopy. The protocols can be adapted for recombinant protein expression, the construction of cellular mimics, the exploration of the minimum requirements for cellular life, or the assembly of genetic circuitry.

Herein we describe simple methods for the preparation of vesicles, the encapsulation of transcription and translation machinery, and the monitoring of protein production. The resulting cell-free systems can be used as a starting point from which to build increasingly complex cellular mimics.

セルラーミミックの構築のための小胞における無細胞転写および翻訳機構のカプセル化

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

関節軟骨細胞培養軟骨の生成のための3Dハイドロゲルの足場

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Gradient Strain Chip for Stimulating Cellular Behaviors in Cell-laden Hydrogel

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single strain-induced cellular alignment on a cell-laden hydrogel by using complex experimental processes and mass controlling systems, which are usually associated with contamination issues. Thus, in this article, we propose a simple approach to building a gradient static strain using a fluidic chip with a plastic PDMS cover and a UV transparent glass substrate for the stimulation of cellular behavior in a 3D hydrogel. Overloading photo-patternable cell prepolymer in the fluidic chamber can generate a convex curved PDMS membrane on the cover. After UV crosslinking, through a concentric circular micropattern under the curved PDMS membrane, and buffer washing, a microenvironment for investigating cell behaviors under a variety of gradient strains is self-established in a single fluidic chip, without external instruments. NIH3T3 cells were demonstrated after observing the change in the cellular alignment trend under geometry guidance, in cooperation with strain stimulation, which varied from 15 - 65% on hydrogels. After a 3-day incubation, the hydrogel geometry dominated the cell alignment under low compressive strain, where cells aligned along the hydrogel elongation direction under high compressive strain. Between these, the cells showed random alignment due to the dissipation of the radical guidance of hydrogel elongation and the geometry guidance of the patterned hydrogel.

This article introduces a simple approach to providing non-continuous gradient static strains on a concentric cell-laden hydrogel to regulate cell alignment for tissue engineering.

細胞を含んだハイドロゲルの刺激細胞挙動のひずみ勾配チップ

Artificial guidance for cellular alignment is a hot topic in the field of tissue engineering. Most of the previous research has investigated single ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance function result in the same outcome: excess inflammation leads to gliosis, cytotoxicity, and/or formation of a glial scar that collectively exacerbate injury or prevent healthy recovery. With the intent of creating a system to model glial scar formation and study inflammatory processes, we have generated a 3D cell scaffold capable of housing primary cultured glial cells: microglia that regulate the foreign body response and initiate the inflammatory event, astrocytes that respond to form a fibrous scar, and oligodendrocytes that are typically vulnerable to inflammatory injury. The present work provides a detailed step-by-step method for the fabrication, culture, and microscopic characterization of a hyaluronic acid-based 3D hydrogel scaffold with encapsulated rat brain-derived glial cells. Further, protocols for characterization of cell encapsulation and the hydrogel scaffold by confocal immunofluorescence and scanning electron microscopy are demonstrated, as well as the capacity to modify the scaffold with bioactive substrates, with incorporation of a commercial basal lamina mixture to improved cell integration.

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Herein, we present a protocol for the 3D culture of rat brain-derived glia cells, including astrocytes, microglia, and oligodendrocytes. We demonstrate primary cell culture, methacrylated hyaluronic acid (HAMA) hydrogel synthesis, HAMAphoto-polymerization and cell encapsulation, and sample processing for confocal and scanning electron microscopic imaging.

プライマリのグリア細胞の in Vitro Neuroinflammation のモデリングのための三次元ハイドロゲル文化を改善

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell lines using conventional two-dimensional (2D) cell culture. These challenges can be overcome by using bioprinting techniques to build heterogeneous three-dimensional (3D) tumor models whereby different types of cells are embedded. Alginate and gelatin are two of the most common biomaterials employed in bioprinting due to their biocompatibility, biomimicry, and mechanical properties. By combining the two polymers, we achieved a bioprintable composite hydrogel with similarities to the microscopic architecture of a native tumor stroma. We studied the printability of the composite hydrogel via rheology and obtained the optimal printing window. Breast cancer cells and fibroblasts were embedded in the hydrogels and printed to form a 3D model mimicking the in vivo microenvironment. The bioprinted heterogeneous model achieves a high viability for long-term cell culture (&#62; 30 days) and promotes the self-assembly of breast cancer cells into multicellular tumor spheroids (MCTS). We observed the migration and interaction of the cancer-associated fibroblast cells (CAFs) with the MCTS in this model. By using bioprinted cell culture platforms as co-culture systems, it offers a unique tool to study the dependence of tumorigenesis on the stroma composition. This technique features a high-throughput, low cost, and high reproducibility, and it can also provide an alternative model to conventional cell monolayer cultures and animal tumor models to study cancer biology.

Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

We developed a heterogeneous breast cancer model consisting of immortalized tumor and fibroblast cells embedded in a bioprintable alginate/gelatin bioink. The model recapitulates the in vivo tumor microenvironment and facilitates the formation of multicellular tumor spheroids, yielding insight into the mechanisms driving tumorigenesis.

Bioprintable アルギン酸/ゼラチン ゲル 3 Dの in Vitroモデル システム細胞スフェロイドの形成を誘導します。

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Construction of a Multilayered Mesenchymal Stem Cell Sheet with a 3D Dynamic Culture System

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low cell retention and poor survival within the target zone. However, during the in vitro construction process, a solution for maintaining stem cell bioactivity and increasing the cell amount within the cell sheet is urgently needed. Here, this protocol presents a method for constructing a multilayered cell sheet with favorable stem cell bioactivity and optimal operability. Decellularized porcine pericardium (DPP) is prepared by phospholipase A2 (PLA2) decellularization method as the cell sheet scaffold, and rat bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) are isolated and expanded as the seeded cells. The temporary multilayered cell sheet structure is constructed by using RAD16-I peptide hydrogel. Finally, the cell sheet is cultured with a dynamic perfusion system to stabilize the three-dimensional (3D) structure, and the cell sheet could be obtained following a 48-hour culture in vitro. This protocol provides an efficient and feasible method for constructing a multilayered stem cell sheet, and the cell sheet could be developed as a favorable stem cell therapy product in the future.

This article provides an efficient and feasible method for constructing multilayered stem cell sheets with favorable stem cell property.

3 D ダイナミック文化システムの多層間葉系幹細胞シートの構築

Stem cell therapy shows a promising future in regenerating injured organ and tissues, and the cell sheet technique has been developed to improve the low ...

3D Analysis of Multi-cellular Responses to Chemoattractant Gradients

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and chemical complexity of living tissues and mimic in vivo tissue functions. Recent advances in microfabrication technologies have facilitated the development of 3D in vitro environments in which cells can be integrated into a well-defined extracellular matrix (ECM) and a defined set of soluble or matrix associated biomolecules. However, technological barriers have limited their widespread use in research laboratories. Here, we describe a method to construct simple devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids in 3D microenvironments with a defined chemoattractant gradient. We illustrate the use of this platform for analysis of the response of epithelial cells and organoids to gradients of growth factors, such as epidermal growth factor (EGF). EGF gradients were stable in the devices for several days leading to directed branch formation in breast organoids. This analysis allowed us to conclude that collective gradient sensing by groups of cells is more sensitive vs. single cells. We also describe the fabrication method, which does not require photolithography facilities nor advanced soft lithography techniques. This method will be helpful to study 3D cellular behaviors in the context of the analysis of development and pathological states, including cancer.

We describe a method to construct devices for 3D culture and experimentation with cells and multicellular organoids. This device allows analysis of cellular responses to soluble signals in 3D microenvironments with defined chemoattractant gradients. Organoids are better than single cells at detection of weak noisy inputs.

化学誘引物質勾配に対するマルチセル応答の3D 解析

Various limitations of 2D cell culture systems have sparked interest in 3D cell culture and analysis platforms, which would better mimic the spatial and ...

3D Printed Porous Cellulose Nanocomposite Hydrogel Scaffolds

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with controlled pore structure and mechanical properties. Cellulose nanocrystals (CNCs, 69.62 wt%) based hydrogel ink with matrix (sodium alginate and gelatin) was developed and 3D printed into scaffolds with uniform and gradient pore structure (110-1,100 &#181;m). The scaffolds showed compression modulus in the range of 0.20-0.45 MPa when tested in simulated in vivo conditions (in distilled water at 37 &#176;C). The pore sizes and the compression modulus of the 3D scaffolds matched with the requirements needed for cartilage regeneration applications. This work demonstrates that the consistency of the ink can be controlled by the concentration of the precursors and porosity can be controlled by the 3D printing process and both of these factors in return defines the mechanical properties of the 3D printed porous hydrogel scaffold. This process method can therefore be used to fabricate structurally and compositionally customized scaffolds according to the specific needs of patients.&#160;

The three critical steps of this protocol are i) developing the right composition and consistency of the cellulose hydrogel ink, ii) 3D printing of scaffolds into various pore structures with good shape fidelity and dimensions and iii) demonstration of the mechanical properties in simulated body conditions for cartilage regeneration.

3 D プリントされた多孔性セルロース ナノコンポジット型ヒドロゲル足場

This work demonstrates the use of three-dimensional (3D) printing to produce porous cubic scaffolds using cellulose nanocomposite hydrogel ink, with ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

ゼラチンメタクリロイルヒドロゲルベースバイオインクの3Dバイオプリンティングのプロトコル

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

マイクロパターンマクロスケール3D細胞構造のためのモジュラーヒドロゲルシートの構築

要約

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組織工学：層状細胞シートの送達のための多細胞3D足場の構築

セルラーミミックの構築のための小胞における無細胞転写および翻訳機構のカプセル化

関節軟骨細胞培養軟骨の生成のための3Dハイドロゲルの足場

細胞を含んだハイドロゲルの刺激細胞挙動のひずみ勾配チップ

プライマリのグリア細胞の in Vitro Neuroinflammation のモデリングのための三次元ハイドロゲル文化を改善

Bioprintable アルギン酸/ゼラチンゲル 3 Dの in Vitroモデルシステム細胞スフェロイドの形成を誘導します。

3 D ダイナミック文化システムの多層間葉系幹細胞シートの構築

化学誘引物質勾配に対するマルチセル応答の3D 解析

3 D プリントされた多孔性セルロースナノコンポジット型ヒドロゲル足場

ゼラチンメタクリロイルヒドロゲルベースバイオインクの3Dバイオプリンティングのプロトコル

マイクロパターンマクロスケール3D細胞構造のためのモジュラーヒドロゲルシートの構築

要約

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組織工学：層状細胞シートの送達のための多細胞3D足場の構築

セルラーミミックの構築のための小胞における無細胞転写および翻訳機構のカプセル化

関節軟骨細胞培養軟骨の生成のための3Dハイドロゲルの足場

細胞を含んだハイドロゲルの刺激細胞挙動のひずみ勾配チップ

プライマリのグリア細胞の in Vitro Neuroinflammation のモデリングのための三次元ハイドロゲル文化を改善

Bioprintable アルギン酸/ゼラチン ゲル 3 Dの in Vitroモデル システム細胞スフェロイドの形成を誘導します。

3 D ダイナミック文化システムの多層間葉系幹細胞シートの構築

化学誘引物質勾配に対するマルチセル応答の3D 解析

3 D プリントされた多孔性セルロース ナノコンポジット型ヒドロゲル足場

ゼラチンメタクリロイルヒドロゲルベースバイオインクの3Dバイオプリンティングのプロトコル

Bioprintable アルギン酸/ゼラチンゲル 3 Dの in Vitroモデルシステム細胞スフェロイドの形成を誘導します。

3 D プリントされた多孔性セルロースナノコンポジット型ヒドロゲル足場